Сложный способ окраски это использование

Простые и сложные методы окраски

Выделяют простые и сложные методы окраски.

Простыми методами окрашивания называют окрашивание препаратов каким-либо одним красителем. Некоторые микроорганизмы (спирохеты), плохо выявляемые с помощью позитивных красителей, легко выявляются при окрашивании негативными красителями.

Техника приготовления препарата заключается в следующем. Фиксированный препарат помещают на параллельные стеклянные рейки (мостик), которые лежат над кюветой. На мазок наносят с помощью капельницы 1 % водный раствор фуксина или метиленового синего на 1–2 мин. Следят за тем, чтобы во время окрашивания раствор красителя не подсыхал. После завершения окрашивания, краситель сливают. Препарат промывают водой до тех пор, пока стекающая воде не станет бесцветной. Затем препарат высушивают. Для этого нижнюю сторону препарата промокают фильтровальной бумагой, а верхнюю сторону осторожно обсушивают с боков, не дотрагиваясь до мазка. Препарат окончательно досушивают на воздухе или высоко над пламенем спиртовки. Для получения более чистых препаратов краситель наносят на мазок, покрытый фильтровальной бумагой. Метод окрашивания в модификации Синева позволяет использовать вместо раствора красителя заранее пропитанную им фильтровальную бумагу. В правильно окрашенном и хорошо промытом препарате поле зрения светлое и чистое, окрашены только клетки. Микроскопируют препараты с иммерсионной системой.

Присложных (дифференцирующих) методах окрашивания на один и тот же препарат воздействуют несколькими красящими веществами, одно из которых называется основным, другие – дополнительными. Кроме красителей используются различные обесцвечивающие вещества: спирты, кислоты, ацетон и др. С помощью сложных методов окрашивания выявляют цитологические особенности клеток микроорганизмов (клеточные структуры, включения и т. д.).

Окраска по методу Грамаявляется самым универсальным из сложных методов окраски. Окраска положена в основу дифференциации бактерий и отражает способность клеток воспринимать и удерживать внутри клетки красящий комплекс генцианового фиолетового и йода либо терять его после обработки спиртом. Соответственно выделяют грамположительные (Bacillus, Clostridium, Streptococcus, Lactobacillus, etc.) и грамотрицательные (Escherichia, Pseudomonas, Erwinia, Neisseria, etc.) формы.

Для получения достоверных результатов необходимо готовить мазки для окраски по Граму из молодых, активно растущих (обычно односуточных) культур, так как клетки из старых культур иногда дают неустойчивую реакцию по Граму. Грамотрицательные бактерии могут выглядеть как грамположительные, если бактериальная пленка (мазок) слишком толста и обесцвечивание спиртом не проведено до конца. Грамположительные бактерии могут выглядеть как грамотрицательные, если мазок переобесцвечен спиртом.

Сущность метода. На поверхности цитоплазмы клетки у грамположительных микроорганизмов располагается комплекс из белка и рибонуклеата магния, отсутствующий у грамотрицательных бактерий. При окрашивании по Граму на поверхности грамположительных клеток образуется прочный комплекс из белка, рибонуклеата магния, генцианвиолета и йода, не разрушающийся при обработке спиртом. Такие бактерии остаются окрашенными в сине-фиолетовый цвет. Грамотрицательные бактерии не обладают свойством удерживать краску и при обработке спиртом обесцвечиваются. Для выявления их препарат докрашивают фуксином. При этом грамотрицательные бактерии окрашиваются в красный цвет.

Этапы дифференцированного окрашивания по Граму:

1 Фиксированный мазок покрывают кусочком фильтровальной бумаги (1,5 х 1,5 см) и на него до полного смачивания наносят карболовый раствор генцианового фиолетового или кристаллический фиолетовый (чаще используют модификацию Синева). Окрашивание проводят на протяжении 1–2 мин.

2 Бумажку снимают, краситель сливают и, не промывая препарат водой, наносят на препарат раствор Люголя на 1–2 мин до почернения мазка.

3 Сливают раствор Люголя, окрашенный мазок обесцвечивают 96º этиловым спиртом. Для этого препарат 2–3 раза помещают в стакан со спиртом до прекращения отхождения фиолетовых струек (время обесцвечивания – не более 30 с), либо наливают 2–4 капли спирта на мазок на 30–45 с.

4 Препарат быстро промывают водой (как описано выше).

5 Мазок дополнительно окрашивают на протяжении 1–2 мин водным раствором фуксина (фуксин Пфейффера).

6 Краситель сливают, препарат промывают водой, высушивают фильтровальной бумагой.

7 Микроскопируют с иммерсионной системой.

Грамположительные бактерии окрашиваются в фиолетовый цвет, грамотрицательные – в розовый.

Нуклеоид. Обнаружить нуклеоид в бактериальной клетке при помощи светового микроскопа трудно. Для избирательного окрашивания нуклеоида фиксированные клетки предварительно обрабатывают рибонуклеазой или разбавленной соляной кислотой, чтобы разрушить рибосомальную РНК. Последующее окрашивание основным красителем позволяет выявить нуклеоид в виде плотных тел с неправильными очертаниями, расположенные в центре или на полюсах клетки.

Окраска кислотоустойчивых бактерий по методу Циля-Нильсена отражает особенности микобактерий и нокардий.

Принцип метода. Кислотоустойчивость этих бактерий связана с высоким содержанием липидов в клеточной стенке. Кислотоустойчивые бактерии окрашиваются карболовым фуксином Циля при нагревании препарата в красный цвет и сохраняют эту окраску после обесцвечивания серной кислотой. Некислотоустойчивые бактерии обесцвечиваются кислотой и в последующем докрашиваются метиленовым синим в синий цвет.

Для выявления капсул пользуются различными методами, среди которых можно отметить метод Бурри и Бурри-Гинса. В основе метода лежит негативное контрастирование. Так как капсула или тело микробной клетки не воспринимает красители, тушью окрашивается лишь фон микропрепарата. Капсула видна как неокрашенная зона на темном фоне тушевого мазка. По методу Бурри-Гинса тела микробных клеток дополнительно окрашиваются в красный цвет фуксином.

Для окрашивания жгутиков предложено несколько методов, общим этапом для которых является протравливание препарата (обычно растворами таннина, KAl(SO₄)₂, HgCl₂) и последующая окраска (чаще карболовым раствором фуксина). В результате этого на жгутиках происходит осаждение красителя, благодаря чему одновременно достигается как увеличение их толщины, так и уменьшение прозрачности. Одним из предложенных методов окрашивания жгутиков является метод Лейфзона. Препарат микроскопируют с иммерсионной системой. Клетки бактерий окрашиваются в красный цвет, жгутики принимают вид толстых нитей, отходящих от клетки.

Вопросы для самоконтроля

1 Перечислите основные морфологические типы клеток микроорганизмов.

2 Охарактеризуйте схематичное строение бактериальной клетки.

3 Перечислите этапы приготовления фиксированных препаратов микроорганизмов, охарактеризуйте их.

5 Классифицируйте используемые в микробиологии красители, охарактеризуйте их.

Практическое занятие 3

Цель:ознакомление сметодикой приготовления фиксированных препаратов, простыми и сложными методами окраски; ознакомление с морфологией и цитологией различных микроорганизмов.

Материалы и оборудование: микроскопы биологические, предметные и покровные стекла, спиртовки, бактериальные петли, иммерсионное масло, стерильные пипетки, пинцеты, фильтровальная бумага, спички, палочки ватные гигиенические, маркеры, стерильные чашки Петри, на группу – в 50 мл колбе стерильная водопроводная вода, дистиллированная вода для промывки, промывалки, кюветы, мостики, набор готовых растворов красок в штативе, спирт 96 0 , пипетки, настои из естественных материалов: мяса, гороха и т.д.

Ход работы

1 Рассмотреть разнообразие форм прокариот на рисунке 3.2. Описать морфологию всех представленных форм согласно схеме таблицы 4.1. Оформить таблицу в тетради.

Рисунок 3.2 – Разнообразие форм прокариот

Таблица 3.1 – Морфология клеток микроорганизмов

№ п/п

Рисунок микроорганизма

Форма клетки, сочетание

2 Рассмотреть рисунок 4.1. Определить указанные под номерами структуры бактериальной клетки. Зарисовать схему в рабочей тетради, сделать соответствующие записи названий.

3 Ознакомиться с этапами и техникой приготовления фиксированных препаратов микроорганизмов.

4 Составить схему простого метода окрашивания.

5 Составить схему окрашивания препаратов по методу Грама.

6 Приготовить фиксированный препарат с использованием простых методов окраски.

7 Приготовить фиксированный препарат по методу Грама.

8 Препараты микроскопировать с объективами 10х и 100х.

9 Охарактеризовать особенности морфологии клеток микроорганизмов согласно схеме таблицы 3.2, записать в рабочую тетрадь. Выполнить рисунки, под рисунком указать увеличение микроскопа.

Таблица 3.2 – Некоторые особенности морфологии клеток

Параметры	Характеристика
Состав среды, объект исследования
Возраст культуры
Форма клеток
Сочетание клеток
Окраска по Граму
Рисунок клеток
Выводы:

10 Указать в выводах наблюдаемое разнообразие прокариот; преимущества использования в работе фиксированных препаратов.

1 Борисов, Л. Б. Руководство к лабораторным занятиям по микробиологии / Л. Б. Борисов [и др.]. – М.: Медицина, 1984. – 256 с.

Выделение и идентификация микроорганизмов; учебно-методическое пособие / Р. А. Желдакова. – Мн.: БГУ, 2003. – 36 с.

3 Микробиология: методические рекомендации к лабораторным занятиям и контроль самостоятельной работы студентов / В. В. Лысак, Р. А. Желдакова. – Мн.: БГУ, 2002. – 100 с.

4 Павлович, С.А. Микробиология с вирусологией и иммунологией / С.А. Павлович. – Мн.: Вышэйшая школа. 2008. – 799 с.

5 Практикум по микробиологии /А. И. Нетрусов [и др.]. – М.: Академия, 2005. – 604 с.

6 Теппер, Е. З. Практикум по микробиологии / Е. З. Теппер [и др.]. – М.: Колос, 1979. – 216 с.

КОНЦЕВАЯ Ирина Ильинична

Практическое руководство

по изучению раздела «Морфология и структурная

организация бактериальной клетки»

для студентов специальности 1–31 01 01-02

«Биология (научно-педагогическая деятельность)»

Источник

Нарисуем невидимое, или методы окраски микроорганизмов

Простые и сложные методы окраски

Выделяют простые и сложные методы окраски.

Простыми методами окрашивания называют окрашивание препаратов каким-либо одним красителем. Некоторые микроорганизмы (спирохеты), плохо выявляемые с помощью позитивных красителей, легко выявляются при окрашивании негативными красителями.

Техника приготовления препарата заключается в следующем. Фиксированный препарат помещают на параллельные стеклянные рейки (мостик), которые лежат над кюветой. На мазок наносят с помощью капельницы 1 % водный раствор фуксина или метиленового синего на 1–2 мин. Следят за тем, чтобы во время окрашивания раствор красителя не подсыхал.

После завершения окрашивания, краситель сливают. Препарат промывают водой до тех пор, пока стекающая воде не станет бесцветной. Затем препарат высушивают. Для этого нижнюю сторону препарата промокают фильтровальной бумагой, а верхнюю сторону осторожно обсушивают с боков, не дотрагиваясь до мазка. Препарат окончательно досушивают на воздухе или высоко над пламенем спиртовки.

Для получения более чистых препаратов краситель наносят на мазок, покрытый фильтровальной бумагой. Метод окрашивания в модификации Синева позволяет использовать вместо раствора красителя заранее пропитанную им фильтровальную бумагу. В правильно окрашенном и хорошо промытом препарате поле зрения светлое и чистое, окрашены только клетки.

Микроскопируют препараты с иммерсионной системой.

Присложных (дифференцирующих) методах окрашивания на один и тот же препарат воздействуют несколькими красящими веществами, одно из которых называется основным, другие – дополнительными.

Кроме красителей используются различные обесцвечивающие вещества: спирты, кислоты, ацетон и др.

С помощью сложных методов окрашивания выявляют цитологические особенности клеток микроорганизмов (клеточные структуры, включения и т. д.).

Окраска по методу Грамаявляется самым универсальным из сложных методов окраски.

Окраска положена в основу дифференциации бактерий и отражает способность клеток воспринимать и удерживать внутри клетки красящий комплекс генцианового фиолетового и йода либо терять его после обработки спиртом.

Соответственно выделяют грамположительные (Bacillus, Clostridium, Streptococcus, Lactobacillus, etc.) и грамотрицательные (Escherichia, Pseudomonas, Erwinia, Neisseria, etc.) формы.

Для получения достоверных результатов необходимо готовить мазки для окраски по Граму из молодых, активно растущих (обычно односуточных) культур, так как клетки из старых культур иногда дают неустойчивую реакцию по Граму.

Грамотрицательные бактерии могут выглядеть как грамположительные, если бактериальная пленка (мазок) слишком толста и обесцвечивание спиртом не проведено до конца.

Грамположительные бактерии могут выглядеть как грамотрицательные, если мазок переобесцвечен спиртом.

Сущность метода. На поверхности цитоплазмы клетки у грамположительных микроорганизмов располагается комплекс из белка и рибонуклеата магния, отсутствующий у грамотрицательных бактерий.

При окрашивании по Граму на поверхности грамположительных клеток образуется прочный комплекс из белка, рибонуклеата магния, генцианвиолета и йода, не разрушающийся при обработке спиртом. Такие бактерии остаются окрашенными в сине-фиолетовый цвет.

Грамотрицательные бактерии не обладают свойством удерживать краску и при обработке спиртом обесцвечиваются. Для выявления их препарат докрашивают фуксином. При этом грамотрицательные бактерии окрашиваются в красный цвет.

Этапы дифференцированного окрашивания по Граму:

1 Фиксированный мазок покрывают кусочком фильтровальной бумаги (1,5 х 1,5 см) и на него до полного смачивания наносят карболовый раствор генцианового фиолетового или кристаллический фиолетовый (чаще используют модификацию Синева). Окрашивание проводят на протяжении 1–2 мин.

2 Бумажку снимают, краситель сливают и, не промывая препарат водой, наносят на препарат раствор Люголя на 1–2 мин до почернения мазка.

3 Сливают раствор Люголя, окрашенный мазок обесцвечивают 96º этиловым спиртом. Для этого препарат 2–3 раза помещают в стакан со спиртом до прекращения отхождения фиолетовых струек (время обесцвечивания – не более 30 с), либо наливают 2–4 капли спирта на мазок на 30–45 с.

4 Препарат быстро промывают водой (как описано выше).

5 Мазок дополнительно окрашивают на протяжении 1–2 мин водным раствором фуксина (фуксин Пфейффера).

6 Краситель сливают, препарат промывают водой, высушивают фильтровальной бумагой.

7 Микроскопируют с иммерсионной системой.

Грамположительные бактерии окрашиваются в фиолетовый цвет, грамотрицательные – в розовый.

Нуклеоид. Обнаружить нуклеоид в бактериальной клетке при помощи светового микроскопа трудно.

Для избирательного окрашивания нуклеоида фиксированные клетки предварительно обрабатывают рибонуклеазой или разбавленной соляной кислотой, чтобы разрушить рибосомальную РНК.

Последующее окрашивание основным красителем позволяет выявить нуклеоид в виде плотных тел с неправильными очертаниями, расположенные в центре или на полюсах клетки.

Окраска кислотоустойчивых бактерий по методу Циля-Нильсена отражает особенности микобактерий и нокардий.

Принцип метода. Кислотоустойчивость этих бактерий связана с высоким содержанием липидов в клеточной стенке.

Кислотоустойчивые бактерии окрашиваются карболовым фуксином Циля при нагревании препарата в красный цвет и сохраняют эту окраску после обесцвечивания серной кислотой.

Некислотоустойчивые бактерии обесцвечиваются кислотой и в последующем докрашиваются метиленовым синим в синий цвет.

Для выявления капсул пользуются различными методами, среди которых можно отметить метод Бурри и Бурри-Гинса. В основе метода лежит негативное контрастирование.

Так как капсула или тело микробной клетки не воспринимает красители, тушью окрашивается лишь фон микропрепарата. Капсула видна как неокрашенная зона на темном фоне тушевого мазка.

По методу Бурри-Гинса тела микробных клеток дополнительно окрашиваются в красный цвет фуксином.

Для окрашивания жгутиков предложено несколько методов, общим этапом для которых является протравливание препарата (обычно растворами таннина, KAl(SO4)2, HgCl2) и последующая окраска (чаще карболовым раствором фуксина).

В результате этого на жгутиках происходит осаждение красителя, благодаря чему одновременно достигается как увеличение их толщины, так и уменьшение прозрачности. Одним из предложенных методов окрашивания жгутиков является метод Лейфзона. Препарат микроскопируют с иммерсионной системой.

Клетки бактерий окрашиваются в красный цвет, жгутики принимают вид толстых нитей, отходящих от клетки.

Вопросы для самоконтроля

1 Перечислите основные морфологические типы клеток микроорганизмов.

2 Охарактеризуйте схематичное строение бактериальной клетки.

3 Перечислите этапы приготовления фиксированных препаратов микроорганизмов, охарактеризуйте их.

5 Классифицируйте используемые в микробиологии красители, охарактеризуйте их.

Практическое занятие 3

Цель:ознакомление сметодикой приготовления фиксированных препаратов, простыми и сложными методами окраски; ознакомление с морфологией и цитологией различных микроорганизмов.

Материалы и оборудование: микроскопы биологические, предметные и покровные стекла, спиртовки, бактериальные петли, иммерсионное масло, стерильные пипетки, пинцеты, фильтровальная бумага, спички, палочки ватные гигиенические, маркеры, стерильные чашки Петри, на группу – в 50 мл колбе стерильная водопроводная вода, дистиллированная вода для промывки, промывалки, кюветы, мостики, набор готовых растворов красок в штативе, спирт 960 , пипетки, настои из естественных материалов: мяса, гороха и т.д.

Ход работы

1 Рассмотреть разнообразие форм прокариот на рисунке 3.2. Описать морфологию всех представленных форм согласно схеме таблицы 4.1. Оформить таблицу в тетради.

Рисунок 3.2 – Разнообразие форм прокариот

Таблица 3.1 – Морфология клеток микроорганизмов

№ п/п

Рисунок микроорганизма

Форма клетки, сочетание

2 Рассмотреть рисунок 4.1. Определить указанные под номерами структуры бактериальной клетки. Зарисовать схему в рабочей тетради, сделать соответствующие записи названий.

3 Ознакомиться с этапами и техникой приготовления фиксированных препаратов микроорганизмов.

4 Составить схему простого метода окрашивания.

5 Составить схему окрашивания препаратов по методу Грама.

6 Приготовить фиксированный препарат с использованием простых методов окраски.

7 Приготовить фиксированный препарат по методу Грама.

8 Препараты микроскопировать с объективами 10х и 100х.

9 Охарактеризовать особенности морфологии клеток микроорганизмов согласно схеме таблицы 3.2, записать в рабочую тетрадь. Выполнить рисунки, под рисунком указать увеличение микроскопа.

Таблица 3.2 – Некоторые особенности морфологии клеток

Параметры	Характеристика
Состав среды, объект исследования
Возраст культуры
Форма клеток
Сочетание клеток
Окраска по Граму
Рисунок клеток
Выводы:

10 Указать в выводах наблюдаемое разнообразие прокариот; преимущества использования в работе фиксированных препаратов.

1 Борисов, Л. Б. Руководство к лабораторным занятиям по микробиологии / Л. Б. Борисов [и др.]. – М.: Медицина, 1984. – 256 с.

Выделение и идентификация микроорганизмов; учебно-методическое пособие / Р. А. Желдакова. – Мн.: БГУ, 2003. – 36 с.

3 Микробиология: методические рекомендации к лабораторным занятиям и контроль самостоятельной работы студентов / В. В. Лысак, Р. А. Желдакова. – Мн.: БГУ, 2002. – 100 с.

4 Павлович, С.А. Микробиология с вирусологией и иммунологией / С.А. Павлович. – Мн.: Вышэйшая школа. 2008. – 799 с.

5 Практикум по микробиологии /А. И. Нетрусов [и др.]. – М.: Академия, 2005. – 604 с.

6 Теппер, Е. З. Практикум по микробиологии / Е. З. Теппер [и др.]. – М.: Колос, 1979. – 216 с.

КОНЦЕВАЯ Ирина Ильинична

Практическое руководство

по изучению раздела «Морфология и структурная

организация бактериальной клетки»

для студентов специальности 1–31 01 01-02

«Биология (научно-педагогическая деятельность)»

Подписано в печать . Формат 64х80 1/16.

Бумага офсетная. Ризография. Усл.-печ.л.

Уч.-изд.л. Тираж экз. Заказ №

Издатель и полиграфическое исполнение:

«Гомельский государственный университет

имени Франциска Скорины»

ул. Советская, 104, 246019, г. Гомель

Микробиология – Окраска микроорганизмов

Для изучения морфологии микроорганизмов, деталей их структуры используют метод окраски их анилиновыми красителями.

Исследуемый материал разводят изотоническим раствором хлорида натрия или бульоном, маленькую каплю размазывают тонким слоем на предметном стекле по площади диаметром 1 см и высушивают. Такой препарат называется мазком.

Его фиксируют на пламени горелки, если исследуют бактерии, или этиловым либо метиловым спиртом при микроскопии простейших, риккетсий, спирохет.

Большинство красителей, используемых в микробиологии, является солями двух типов. У кислых красителей ион, придающий окраску (хромофор), является кислотой и при окрашивании более интенсивно связывается с цитоплазматическими (основными) компонентами клетки, например эозин.

У основных красителей роль хромофора играет катион. Будучи основанием, он более интенсивно связывается с ядерными (кислыми) компонентами клетки, например метиленовый синий. Некоторые красители не образуют химических соединений, а просто растворяются или осаждаются на окружающем материале.

В механизме окрашивания имеют значение как химические, так и физические процессы.

Для окрашивания бактерий чаще используют основные красители: метиловый синий, кристаллический фиолетовый, основной фуксин, тионин. Широко используют щелочной раствор метиленового синего — краситель Леффлера, позволяющий выявить многие детали формы и структуры микробов.

Однако для выявления спор, капсул, жгутиков, различных структур и органелл, а также сходных по форме бактерий использование для окрашивания только одного красителя (простой способ окраски) бывает недостаточно. Поэтому существуют сложные, специальные методы окрашивания, удовлетворяющие различным требованиям.

Способ окраски по Граму позволяет дифференцировать сходные по форме и размерам бактерии, относящиеся к разным видам и родам. Мазок, приготовленный из исследуемого материала, окрашивают вначале кристаллическим фиолетовым в течение 1—2 мин, а затем раствором Люголя 1—2 мин. Все микроорганизмы, находящиеся в мазке, приобретают темно-фиолетовый цвет.

После этого мазок обрабатывают 96 % этиловым спиртом в течение 30 с— 1 мин, смывая остатки спирта водой. Под влиянием спирта одни бактерии обесцвечиваются, а другие сохраняют фиолетовую окраску, приданную Им комплексом красителя с йодом.

Те виды микробов, которые сохраняют фиолетовую окраску, называют грамположительными, а обесцвечивающиеся — грамотрицательными. После дополнительной окраски фуксином последние окрашиваются в красный цвет. Необходимо помнить, что на результаты окраски по Граму часто влияют небольшие отклонения в условиях культивирования или в методике окраски.

Старые культуры или отмирающие клетки грамположительных бактерий могут стать грамотрицательными. В кислой среде, как правило, все микробы грамотрицательны.

По отношению к окраске по способу Грама все бактерии делятся на две группы: грамположительные (стафилококки, стрептококки, пневмококки, возбудители сибирской язвы, столбняка, газовой гангрены и др.) и грамотрицательные (менингококки, гонококки, возбудители брюшного тифа, дизентерии и др.).

В механизме окраски по Граму имеют значение особенности химического состава микроорганизмов, различия в проницаемости клеточных стенок, наличие рибонуклеата магния у грамположительных бактерий. Между большинством грамположительных и грамотрицательных бактерий существуют различия в чувствительности к сульфаниламидам, пенициллину и лизоциму.

Способ окраски по Цилю — Нильсену предложен для кислотоустойчивых микроорганизмов — микобактерий туберкулеза и лепры. Эти микроорганизмы имеют своеобразный химический состав, отличающийся высоким (до 30—40%) содержанием особых жироподобных веществ (воски).

Предварительно фиксированный на пламени мазок из мокроты больного туберкулезом окрашивают раствором карболового фуксина при дву- или троекратном подогревании до появления паров.

Видимо, благодаря размягчению воска краска проникает в клетку и удерживается в ней даже при последующей обработке препарата 5% серной кислотой в течение 3—5 с; поэтому кислотоустойчивые микобактерии остаются окрашенными в красный цвет.

Остальные микробы обесцвечиваются под действием кислоты и при дополнительной окраске метиленовым синим становятся синими. Для окраски спор, которые при обычных методах окраски имеют вид неокрашенных пустот, применяют протравы: кислоты и щелочи. Они разрыхляют плотную оболочку споры и облегчают проникновение через нее краски.

Окрасившиеся споры обладают кислотоустойчивостью и не обесцвечиваются под действием кислоты в отличие от вегетативного тела микробной клетки. Поэтому принцип окраски спор и кислотоустойчивых бактерий одинаков. Споры можно окрасить по методу Циля—Нильсена (споры красные, вегетативное тело синее) или по Ожешко.

Для этого на высушенный, но нефиксированный мазок наливают несколько капель 0,5% раствора хлористоводородной или серной кислоты и подогревают над пламенем горелки в течение 1—2 мин до закипания. Остатки кислоты сливают, препарат высушивают, фиксируют в пламени. Дальнейшую окраску производят по методу Циля — Нильсена.

Капсулы при обычных методах окраски остаются бесцветными. Это позволяет применять простые методы окраски для выявления капсул микроорганизмов в мазках из органов и тканевой жидкости. Например, при окраске метиленовым синим ткани и клетки бактерий окрашиваются в голубой цвет, а вокруг бактерий сохраняется бесцветная зона — капсула.

Из специальных методов окраски применяют способ Бурри: на край стекла наносят каплю туши и каплю исследуемого материала, перемешивают их, делают мазок (так же как мазок крови), высушивают и микроскопируют с иммерсионной системой.

Фон препарата окрашен в темно-дымчатый цвет, тела микробов и их капсулы тушью не окрашиваются и остаются бесцветными — негативный способ окраски.

Негативный метод Г и не а сочетает окраску тушью и фуксином. Мазок окрашивают по способу Бурри, затем высушивают, фиксируют спиртом и докрашивают фуксином Циля. Фон препарата черный, капсула не окрашена, бактериальная клетка красная.

Зерна волютина, находящиеся в клетках возбудителей дифтерии, выявляют, применяя окраску по Нейссеру. Этот сложный метод окраски включает несколько этапов: окраску фиксированного на пламени горелки препарата уксуснокислым синим (1—2 мин), затем добавление на мазок нескольких капель раствора Люголя на 1 мин и промывание водой.

Препарат докрашивают раствором хризоидина или везувина в течение 2—3 мин, промывают водой, высушивают и микроскопируют. Зерна волютина окрашиваются в синий цвет, микробные клетки —в светло-коричневый. Методы окраски жгутиков — осаждение на них танина, который действует как протрава, т. е.

способствует фиксации красителя на окрашиваемом объекте (метод Лейфсона).

Для окраски простейших, а также спирохет и риккетсий широко применяют способ Романовского — Гимзы. Используемая краска состоит из смеси азура, эозина и метиленового синего.

Непосредственно перед употреблением ее растворяют дистиллированной или водопроводной водой (рН 7,0—7,2) из расчета 1 : 10. Препарат фиксируют этиловым или хметиловым спиртом в течение 5—15 мин, окрашивают 30—40 мин, высушивают и микроскопируют.

Ядро простейших, жгутики и блефа- ропласт окрашиваются в ярко-красный цвет, цитоплазма— в голубой, спирохеты и риккетсии — в сиреневато – синий или розовый.

Присутствие ДНК в клетках микроорганизмов можно определить с помощью реакции Фельгена и ее модификаций. Данный метод основан на способности ядерного материала окрашиваться в темно-пурпурный цвет при обработке реактивом Шиффа, (фуксин, обесцвеченный сернистой кислотой).

Предварительно фиксированный мазок обрабатывают горячим (60°С) 1 н. раствором хлористоводородной кислоты в течение 7— 8 мин для разрушения (гидролиз) РНК, наличие которой, особенно в бактериях, затрудняет выявление ДНК.

Можно также разрушить РНК специальным ферментом рибонуклеазой, а для окраски использовать красители, предложенные Романовским (азур I—II и эозин).

Морфология микроорганизмов. Методы окраски – презентация, доклад, проект

Морфология микроорганизмов.
Методы окраски.Слайд 2
Описание слайда:

В нативном (естественном) состоянии бактерии имеют такой же коэффициент преломления, как и стекло, поэтому они невидимы при микроскопическом исследовании. В нативном (естественном) состоянии бактерии имеют такой же коэффициент преломления, как и стекло, поэтому они невидимы при микроскопическом исследовании. Окраска микроорганизмов позволяет изучить морфологические особенности микробовСлайд 3
Описание слайда:

Методы окраски Простой методСлайд 4
Описание слайда:

Методы окраски Протравы – физические и химические факторы, обладающие свойствами повышать окрашиваемость микробов. Уплотняя цитоплаз­му, они могут делать окраску более прочной, или усиливать красящие свойства красителя, или разрыхлять оболочки клеток, спор, способствуя проникновению краски в клетку. Протравами обрабатывают мазок: а) перед окрашиванием – воздействуя раствором НCl при окраске спор у бактерий в методе Ожешки, б) в момент окраски – фенол и высокая температура (подогревание препарата) в методе Циля-Нильсена; в) после нанесения краски для ее закрепления – раствор Люголя в методе Грама. Дифференцирующие вещества избирательно обесцвечивают одни виды или структуры бактериальных клеток и не обесцвечивают другие. Например: этиловый спирт в окраске по Граму, серная кислота в методах Циль-Нильсена и Ожешки.Слайд 5
Описание слайда:

Техника приготовления фиксированного мазка Фиксированный мазок – основа большинства методов окраски На обезжиренное предметное стекло наносят бактериальной петлей маленькую каплю исследуемой жидкости; воды или стерильного физиологического раствора и бактериологической петлей переносят в нее небольшое количество исследуемого материала. Полученную суспензию равномерно распределяют тонким слоем на площади 1 – 2 см петлей. Препарат высушивают при комнатной температуре на воздухе. Для ускорения высушивания допускается подогревание мазка в струе теплого воздуха высоко над пламенем горелки. Высушенный мазок фиксируют в пламени горелки. Фиксация мазка является обязательной процедурой, в результате которой микробы погибают, прочно прикреп­ляются к стеклу и значительно лучше воспринимают окраску.Слайд 6
Описание слайда:

Техника приготовления фиксированного мазка. Простой метод окраски Способы фиксации: обычно применяют фиксацию в пламени го­релки (фиксация жаром): предметное стекло в положении мазком вверх 3 раза проводят через пламя горелки. применяют также различные жидкие фиксаторы, оказывающие более щадящее действие, например: этиловый или метиловый спирт, ацетон, формалин и др. Существуют также жидкие фиксаторы, представляющие собой смесь нескольких веществ, например, по Никифорову (смесь этилового спирта и эфира 1:1). Выбор способа фиксации зависит от окрашиваемого объекта: в жидких фиксаторах фиксируют мазки из крови, гноя, мокроты и т.п. и метода окраски.

Сложные методы окраски ДифференциальныеСлайд 8
Описание слайда:

Метод ГрамаСлайд 9
Описание слайда:

Метод Циля-НильсенаСлайд 10
Описание слайда:

Методы выявления спор При простом способе окраски спора не прокрашивается – в этом случае видны только эндоспоры как бесцветные образования в клетке Эндоспоры в теле клетки может располагаться: 1. центрально — возбудитель сибирской язвы Вacillus anthracis; 2. терминально — на конце палочки (возбудитель столбняка Clostridium Tetani); 3. субтерминально — ближе к концу (возбудитель ботулизма, Clostridium botulinum). Способность бактерий образовывать споры, различающиеся по форме размерам и локализации в клетке, является таксономическим признаком, который используется для их дифференцировкиСлайд 11
Слайд 12
Описание слайда:

Капсулы имеют консистенцию геля, плохо удерживают краситель, и для их выявления чаще всего применяют методы негативного контрастирования Капсулы имеют консистенцию геля, плохо удерживают краситель, и для их выявления чаще всего применяют методы негативного контрастирования Капсула выявляется при любом методе окраски в виде неокрашенной зоны между окрашенными телом бактерий и субстратом. При простом методе и методе Грама достаточно не промывать мазок на последнем этапе окраскиСлайд 13
Описание слайда:

Включения волютинаСлайд 14
Описание слайда:

Окраска клеточной стенки по ПешковуСлайд 15
Описание слайда:

Окраска нуклеоида по Романовскому-Гимзе

Биология

09 февраля 2011

Окраска микроорганизмов — комплекс методов и приёмов для исследования внешнего и внутреннего строения микроорганизмов, метод микробиологической техники, позволяющий различать виды микроорганизмов.

Метод широко используют в прикладной бактериологии для определения формы, размеров, строения, локализации, взаимного расположения микробов, структуры их органелл. Без окраски микробы, кроме некоторых грибов, в световой микроскоп практически не видны, вследствие их малой контрастности.

После обработки мембраны и/или органеллы микробов приобретают контрастирующую с фоном окраску.

Общие сведения о методе

Препараты микробов подвергают действию химических реагентов, обычно — красителей, или тетраоксида осмия. В результате физико-химического процесса взаимодействия красителя с химическими соединениями объектов, с целью искусственного придания ему определённой окраски, появляется возможность определить вид микроорганизма, или хотя бы тип его мембраны.

Способы крашения разделяют на витальный, поствитальный и негативный, последний может быть витальным и поствитальным.

Витальный способ окраски

Для витального крашения применяют 0,2-0,001 % водные растворы метиленового и толуоидинового синего, нейтральрот и конго красный, которые добавляют в придавленную или висячую капли культуры.

Этим способом выявляют спирохеты, простейшие, определяют подвижность бактерий, иммунное набухание капсулы, но использование его требует строгого соблюдения правил, исключающих лабораторное заражение.

Поствитальные способы окраски

Способы крашения фиксированных препаратов разделяют на простые и сложные. При простых способах красящие растворы фуксина Пфейффера, щелочного метиленового синего наносят на фиксированный препарат, так, чтобы он полностью покрыл мазок, краситель сливают, препарат промывают струйкой воды, встряхивают, высушивают и микроскопируют.

Простые способы позволяют судить о величине, форме, локализации, взаимном расположении отдельных клеток, но с их помощью нельзя установить структуру микробов и часто их дифференцированное отношение к красителям.

Из сложных способов крашения бактерий в основном используют дифференцированный способ Грама, выявление кислотоустойчивости по Цилю — Нельсону, определение волютиновых зёрен по Леффлеру или Нейссеру, дифференцирующий способ Романовского — Гимзы, негативно-позитивный способ определения капсулы по Гинсу — Бурри, выявление спор по Пешкову или Цилю — Нельсону и др.

Для крашения простейших применяют способ Романовского — Гимзы и окраску гематоксилин-эозином.

Грибы исследуют неокрашенными или способами Грама, Циля — Нельсона, Леффлера, Романовского — Гимзы, а также раствором Люголя, лактофуксином и др.

Лекция: Простые и сложные методы окраски. Методы изучения подвижности бактерий

Окраска микроорганизмов (крашение микробов) — комплекс методов и приемов для исследования внешнего и внутреннего строения микроорганизмов, метод микробиологической техники, позволяющий различать виды микроорганизмов.

Метод широко используют в прикладной бактериологии для определения формы, размеров, строения, локализации, взаимного расположения микробов, структуры их органелл. Без окраски микробы, кроме некоторых грибов, в световой микроскоп практически не видны, вследствие их малой контрастности.

После обработки мембраны и/или органеллы микробов приобретают контрастирующую с фоном окраску.

// Общие сведения о методе

Препараты микробов подвергают действию химических реагентов, обычно — красителей, или тетраоксида осмия. В результате физико-химического процесса взаимодействия красителя с химическими соединениями объектов, с целью искусственного придания ему определённой окраски, появляется возможность определить вид микроорганизма, или хотя бы тип его мембраны (см. окраска по Граму).

Способы крашения разделяют на витальный, поствитальный и негативный, последний может быть витальным и поствитальным.

Витальный способ окраски

Для витального (прижизненного) крашения применяют 0,2-0,001 % водные растворы метиленового и толуоидинового синего, нейтральрот и конго красный, которые добавляют в придавленную или висячую капли культуры. Этим способом выявляют спирохеты, простейшие, определяют подвижность бактерий, иммунное набухание капсулы, но использование его требует строгого соблюдения правил, исключающих лабораторное заражение.

Поствитальные способы окраски

Способы крашения фиксированных препаратов (поствитальные) разделяют на простые и сложные. При простых способах красящие растворы фуксина Пфейффера (экспозиция 1-2 мин), щелочного метиленового синего (3-5 мин) наносят на фиксированный препарат, так, чтобы он полностью покрыл мазок, краситель сливают, препарат промывают струйкой воды, встряхивают, высушивают и микроскопируют.

Простые способы позволяют судить о величине, форме, локализации, взаимном расположении отдельных клеток, но с их помощью нельзя установить структуру микробов и часто их дифференцированное отношение к красителям.

Из сложных способов крашения бактерий в основном используют дифференцированный способ Грама, выявление кислотоустойчивости по Цилю — Нельсону, определение волютиновых зёрен по Леффлеру или Нейссеру, дифференцирующий способ Романовского — Гимзы, негативно-позитивный способ определения капсулы по Гинсу — Бурри, выявление спор по Пешкову или Цилю — Нельсону и др.

Для крашения простейших применяют способ Романовского — Гимзы и окраску гематоксилин-эозином.

Грибы исследуют неокрашенными или способами Грама, Циля — Нельсона, Леффлера, Романовского — Гимзы, а также раствором Люголя, лактофуксином и др.

Метод Грама — метод окраски микроорганизмов для исследования, позволяющий дифференцировать бактерии по биохимическим свойствам их клеточной стенки. Предложен в 1884 году датским врачом Г. К. Грамом.

По Граму бактерии окрашивают осно́вными красителями — генциановым или метиловым фиолетовым и др., затем краситель фиксируют раствором йода. При последующем промывании окрашенного препарата спиртом те виды бактерий, которые оказываются прочно окрашенными, называют грамположительными бактериями — в отличие от грамотрицательных (Грам (−)), которые при промывке обесцвечиваются.

// Использование в диагностике

Окраска по Граму имеет большое значение в систематике бактерий, а также для микробиологической диагностики инфекционных заболеваний.

Грамположительны кокковые и спороносные формы бактерий, а также дрожжей, они окрашиваются в иссиня-чёрный (тёмно-синий) цвет.

Грамотрицательны многие неспороносные бактерии, они окрашиваются в красный цвет, ядра клеток приобретают ярко-красный цвет, цитоплазма — розовый или малиновый.

Техника проведения окраски

Окраска по Граму относится к сложному способу окраски, когда на мазок воздействуют двумя красителями, из которых один является основны́м, а другой — дополнительным. Кроме красящих веществ при сложных способах окраски применяют обесцвечивающие вещества: спирт, кислоты и др.

Для окраски по Граму чаще используют красители трифенилметановой группы: генциановый, метиловый фиолетовый или кристаллвиолет.

Грамположительные Грам (+) микроорганизмы дают прочное соединение с указанными красителями и йодом.

При этом они не обесцвечиваются при воздействии на них спиртом, вследствие чего при дополнительной окраске фуксином Грам (+) микроорганизмы не изменяют первоначально принятый фиолетовый цвет.

Грамотрицательные Грам (−) микроорганизмы образуют с основными красителями и йодом легко разрушающееся под действием спирта соединение. В результате микробы обесцвечиваются, а затем окрашиваются фуксином, приобретая красный цвет.

Подготовка материала для окраски

Исследуемый материал распределяют тонким слоем по поверхности хорошо обезжиренного предметного стекла. Приготовленный мазок высушивают на воздухе и после полного высыхания фиксируют. Гистологические срезы готовят по рутинной методике, фиксируя кусочки тканей в формалине и заливая в парафин.

При фиксировании мазок закрепляется на поверхности предметного стекла, и поэтому при последующей окраске препарата микробные клетки не смываются. Кроме того, убитые микробные клетки окрашиваются лучше, чем живые.

Различают физический способ фиксации, в основу которого положено воздействие высокой температуры на микробную клетку, и химические способы, предусматривающие применение химических средств, вызывающих коагуляцию белков цитоплазмы.

Физический способ фиксации

Предметное стекло с препаратом берут пинцетом или I и II пальцами правой руки за рёбра мазком кверху и плавным движением проводят 2—3 раза над верхней частью пламени горелки. Весь процесс фиксации должен занимать не более 2 с.

Надёжность фиксации проверяют следующим приёмом: свободную от мазка поверхность предметного стекла прикладывают к тыльной поверхности левой кисти. При правильном фиксировании мазка стекло должно быть горячим, но не вызывать ощущения ожога.

Химический способ фиксации

Для фиксации мазков применяют метиловый спирт, ацетон, смесь Никифорова (смесь этилового спирта 96 % и наркозного эфира в соотношении 1:1), жидкость Карнуа (этилового спирта 96 % — 60 %, хлороформа 30 %, ледяной уксусной кислоты 10 %), спирт-формол (40% формалин 5 мл, этиловый спирт 96° — 95 мл). Предметное стекло с высушенным мазком погружают в склянку с фиксирующим веществом на 10—15 минут и затем высушивают на воздухе. Применяется также фиксация в парах 40% формалина в течение нескольких секунд.

Процесс окрашивания мазков

На фиксированный мазок наливают один из осно́вных красителей на 2—3 минуты. Во избежание осадков окрашивают через фильтровальную бумагу.

Сливают краску, аккуратно удаляют фильтровальную бумагу. Мазок заливают раствором Люголя или йодистым раствором по Граму (водный раствор йодида калия и кристаллического йода в соотношении 2:1) на 1—2 минуты до почернения препарата.

Раствор сливают, мазок прополаскивают 96° этиловым спиртом или ацетоном, наливая и сливая его, пока мазок не обесцветится и стекающая жидкость не станет чистой (приблизительно 20—40—60 секунд).

Тщательно промывают стекла в проточной или дистиллированной воде 1—2 мин.

Для выявления грамотрицательной группы бактерий препараты дополнительно окрашивают фуксином или сафранином (2—5 мин).

Промывают в проточной воде и высушивают фильтровальной бумагой.

Техника окраски бактерий в гистологических срезах по Граму-Вейгерту

Депарафинированные срезы доводят до воды.

Окрашивают 20 мин в 1% растворе парарозанилина или основного фуксина в 1 % уксусной кислоте (раствор красителя нагревают до кипения, охлаждают и фильтруют).

Промывают в 3 сменах дистиллированной воды.

Окрашивают 5 мин в 1% кристаллического фиолетового в дистиллированной воде.

Быстро ополаскивают в 1% растворе хлорида натрия.

Обрабатывают 30 с в смеси: 1 часть йода + 2 части йодида калия + 100 частей дистиллированной воды.

Промокают фильтровальной бумагой.

Дифференцируют, нанося на срез смесь равных объемов анилина и ксилола (1 — 2 мл); растворы сливают до тех пор, пока облачка красителя не перестанут отходить от среза.

Проводят через 3 смены ксилола

Заключают в бальзам или любую смолу, растворенную в ксилоле.

Результат: грамположительные бактерии сине-черные, фибрин фиолетовый, ядра красные.

Метод Пешкова применяется для окраски эндоспор бактерий.

Высушенный препарат из культуры грамположительных бактерий фиксируют в жидкости Карнуа в течение 15 минут, затем промывают водой, наливают метиленовый синий по Леффлеру и нагревают до появления паров, кипятят 15-20 минут, после охлаждения препарата промывают и докрашивают 0,5% водным раствором нейтрального красного или фуксина по Пфейферу 30-60 секунд. Высушивают с помощью фильтровальной бумаги и микроскопируют.

В результате зрелые эндоспоры окрашиваются в голубой цвет, молодые — в темно-синий, цитоплазма красная, зерна хроматина окрашиваются в фиолетовый цвет.

Метод окраски по Цилю — Нельсену — метод окраски микроорганизмов для выявления кислотоустойчивых микобактерий (возбудителей туберкулёза, микобактериозов, лепры), актиномицетов и других кислотоустойчивых микроорганизмов.

Кислотоустойчивость микроорганизмов обусловлена наличием в их клетках липидов, воска и оксикислот. Такие микроорганизмы плохо окрашиваются разведёнными растворами красителей. Для облегчения проникновения красителя в клетки микроорганизмов нанесённый на препарат феноловый фуксин Циля подогревают над пламенем горелки.

Окрашенные микроорганизмы не обесцвечиваются слабыми растворами минеральных кислот и спирта.

Метод назван именами немецких медиков — микробиолога Франца Циля (1857—1926) и патологоанатома Фридриха Нельсена (1854—1898), которые разработали его в 1882—1883 гг.

1. Фиксированный мазок покрывают плоской фильтровальной бумагой и наливают на неё феноловый фуксин Циля. Мазок подогревают над пламенем горелки до появления паров, затем отводят для охлаждения и добавляют новую порцию красителя. Подогревание повторяют 2—3 раза. После охлаждения снимают фильтровальную бумагу и промывают препарат водой.

2. Препарат обесцвечивают путем погружения или нанесения на него 5%-го раствора серной кислоты или 3% солянокислого спирта и промывают несколько раз водой.

3. Окрашивают препараты водно-спиртовым раствором метиленового синего 3—5 минут, промывают водой и высушивают.

При окраске по методу Циля — Нельсена кислотоустойчивые бактерии приобретают интенсивно красный цвет, остальная микрофлора окрашивается в светло-синий цвет.

Окраска по Романовскому — Гимзе цитологический метод окраски простейших, бактерий, клеточных структур и тканей различных видов (в том числе крови) при световой микроскопии. Окрашивает ацидофильные образования в различные оттенки красного цвета, базофильные — в цвета от пурпурного до синего.

Готовый жидкий краситель перед окрашиванием мазков разводят из расчета 1-2 капли красителя на 1 мл дистиллированной воды. Мазки окрашивают 20 — 25 минут при 37 °C во влажной камере (закрытая чашка Петри с увлажнённым фильтром на дне). После окрашивания мазки промывают в проточной воде, сушат на воздухе и исследуют при масляной иммерсии.

Красящую смесь Романовского-Гимзы, которая имеет в основе краску Романовского Райта, в виде порошка (коммерческий краситель) растворяют в смеси равных объемов метилового спирта и глицерина (800 мг красителя на 100 мл растворителя).

Краситель растворяется плохо, поэтому лучше его растереть с растворителем в количестве 300 мг на 100 мл, а затем, помешивая, добавлять краситель до получения нужной концентрации. Приготовление красителя часто занимает несколько дней. Важно в качестве растворителей использовать химически чистый метиловый спирт и глицерин, так как примеси ухудшают свойства красителя.

Вместо метилового спирта можно применять 100 % этиловый спирт. Приготовленную красящую смесь хранят в сухом прохладном месте в плотно закрытом сосуде.

Мазки, фиксированные в метиловом спирте, окрашивают раствором (1 мл готовой жидкой краски + 2 мл основного буферного раствора + 47 мл дистиллированной воды) в течение 40—120 мин (продолжительность окрашивания подбирают эмпирически). Пользуются фосфатным буфером, но рН буфера зависит от вида мазка: для мазка костного мозга — 5,8 — 6,0, для мазка крови — 6,4 — 6,5, для выявления простейших — 6,8, малярийного плазмодия — 7,0 — 7,2.

Ополаскивают в дистиллированной воде, высушивают и исследуют при иммерсии.

Бактерии окрашиваются в фиолетово-красный цвет, цитоплазма клеток — в голубой, ядра — в красный. При окрашивании простейших их цитоплазма приобретает голубой цвет, а ядра — красно-фиолетовый.

Источник