Механизмы окрасок по Граму и Цилю-Нильсену
Метод Грама (Gram). Относится к сложным методам окраски и позволяет дифференцировать грамположительные и грамотрицательные бактерии, что является важным таксономическим признаком. Результат окраски определяется особенностями строения клеточной стенки бактерий. При окраске генцианвиолетом и последующем воздействии раствора Люголя образуется комплексное соединение генцианвиолета и йода с пептидогликаном, которое при обработке спиртом удерживается в клетках грамположительных бактерий, имеющий многослойный пептидогликан и вымывается из грамотрицательных бактерий, имеющих тонкий слой пептидогликана. При дополнительной окраске водным раствором фуксина грамотрицательные бактерии приобретают красный цвет.
Таблица 4 Метод Грама
| Этапы окраски | Цвет бактерий | |
| 1. | На фиксированный мазок поместить фильтровальную бумажку, пропитанную генцианвиолетом, смочить водой, 2-3 минуты | Все бактерии окрашиваются в фиолетовый цвет |
| 2. | Снять бумажку, слить с препарата оставшуюся краску и налить раствор Люголя на 1 минуту | Все бактерии остаются фиолетовыми |
| 3. | Для дифференцирования нанести на мазок этиловый спирт в течение 3-6 с, промыть водой | Грамположительные бактерии остаются фиолетовыми, грамотрицательные обесцвечиваются |
| 4. | Нанести фуксин Пффейфера (водный раствор фуксина) на 1-2 мин, промыть водой, высушить | Грамположительные остаются фиолетовыми, грамотрицательные окрашиваются в красный цвет |
Метод Циля-Нильсена. Относится к сложным методам окраски и позволяет дифференцировать кислотоустойчивые и некислотоустойчивые бактерии.
Таблица 5 Метод Циля-Нильсена
| Этапы окраски | Цвет бактерий | |
| 1. | На фиксированный мазок нанести карболовый раствор фуксина Циля через полоску фильтровальной бумаги и подогреть препарат в пламени горелки до появления паров (повторить 3-4 раза) | Все бактерии окрашиваются в красный цвет |
| 2. | Снять бумагу, промыть мазок водой | Все бактерии остаются красными |
| 3. | Для дифференцирования нанести 5% раствор серной кислоты на 1-2 минуты | Кислотоустойчивые бактерии остаются красными, некислотоустойчивые обесцвечиваются |
| 4. | Нанести водный раствор метиленового синего и докрасить 3-5 мин, промыть водой, высушить | Кислотоустойчивые остаются красными, некислотоустойчивые окрашиваются в синий цвет |
Кислотоустойчивые бактерии имеют особое строение клеточной стенки, содержащей большое количество сложных липидов (миколовая и фтиоловая кислоты, воск D, глико- и фосфолипидовы), что делает эти бактерии кислото-, щелоче- и спиртоустойчивыми. Клеточная стенка этих бактерий плохо воспринимает анилиновые красители и обычные способы окраски. Высокая температура в процессе окраски методом Циля-Нильсена расплавляет липиды, фенол разрыхляет клеточную стенку и краситель проникает внутрь клетки. После остывания препарата липиды вновь затвердевают, прочно удерживая краситель, поэтому кислотоустойчивые бактерии не обесцвечиваются серной кислотой и остаются красными. Некислотоустойчивые бактерии обесцвечиваются и их докрашивают контрастным красителем — метиленовым синим. В основном, метод используется для окраски бактерий, относящихся к роду Мусоbacterium (М.tuberculosis, М.bovis, М.leprae и др.)
III. План практической работы
1. Изучить механизм и этапы окраски по Граму, приготовить мазок из смеси бактерий и окрасить по Граму, заполнить таблицу в рабочей тетради.
2. Изучить механизм и этапы окраски по Цилю-Нильсену, приготовить мазок из сапрофитных микобактерий, окрасить по Цилю-Нильсену, заполнить таблицу в рабочей тетради.
3. Сравнить строение прокариотической и эукариотической клетки по ряду признаков, заполнить таблицу в рабочей тетради.
4. Изучить и перечислить в таблице основные таксономические категории на примере С.tetani и Т.pallidum или других бактерий.
Источник
7. Простые и сложные методы окраски
Простой метод окраски. Является одноэтапным и заключается в окраске микропрепарата одним красителем. Используют основные анилиновые красители, такие как, фуксин, генцианвиолет, метиленовый синий в виде водных растворов или пропитанных красителем фильтровальных бумажек, которые помещают на мазок и смачивают водой. Продолжительность окраски составляет 3-5 минут, после чего микропрепарат промывают водой, высушивают и микроскопируют. В препаратах, окрашенных простым методом, можно получить представление о форме, расположении и размерах микробных клеток.
Сложные методы окраски. Сложные (дифференцирующие) методы окраски (по Граму, Цилю-Нильсену и др.) включают последовательное использование нескольких красителей и дополнительных способов обработки препаратов. Эти методы позволяют дифференцировать бактерии в зависимости от строения их структур, чаще всего поверхностных. Например, метод окраски по Граму позволяет дифференцировать бактерии по строению их клеточной стенки: грамположительные (фиолетовые) с толстой и грамотрицательные (красные) бактерии с тонкой клеточной стенкой.
Существуют специальные сложные методы окраски, которые используют для выявления структурных компонентов бактериальной клетки: капсул, цитоплазматических включений, спор, жгутиков.
8. Механизмы окрасок по Граму и Цилю-Нильсену
Метод Грама. Относится к сложным методам окраски и позволяет дифференцировать грамположительные и грамотрицательные бактерии, что является важным таксономическим признаком. Результат окраски определяется особенностями строения клеточной стенки бактерий. При окраске генцианвиолетом и последующем воздействии раствора Люголя образуется комплексное соединение генцианвиолета и йода с пептидогликаном, которое при дифференциации спиртом удерживается в клетках грамположительных бактерий, имеющий многослойный пептидогликан и вымывается из грамотрицательных бактерий, имеющих тонкий слой пептидогликана. При дополнительной окраске водным раствором фуксина грамотрицательные бактерии приобретают красный цвет.
Таблица 4. Метод Грама
На фиксированный мазок поместить фильтровальную бумажку, пропитанную генцианвиолетом, смочить водой, 2-3 минуты
Все бактерии окрашиваются в фиолетовый цвет
Снять бумажку, слить с препарата оставшуюся краску и налить раствор Люголя на 1 минуту
Все бактерии остаются фиолетовыми
Для дифференцирования нанести на мазок этиловый спирт и обесцветить в течение 30-60 с, промыть водой
Грамположительные бактерии остаются фиолетовыми, грамотрицательные обесцвечиваются
Нанести фуксин Пффейфера (водный раствор фуксина) и докрасить 1-2 мин, промыть водой, высушить
Грамположительные остаются фиолетовыми, грамотрицательные окрашиваются в красный цвет
Метод Циля-Нильсена. Относится к сложным методам окраски и позволяет дифференцировать кислотоустойчивые и некислотоустойчивые бактерии.
Таблица 5. Метод Циля-Нильсена
На фиксированный мазок нанести карболовый раствор фуксина Циля через полоску фильтровальной бумаги и подогреть препарат в пламени горелки до появления паров (повторить 3-4 раза)
Все бактерии окрашиваются в красный цвет
Снять бумагу, промыть мазок водой
Все бактерии остаются красными
Для дифференцирования нанести 5% раствор серной кислоты на 1-2 минуты
Кислотоустойчивые бактерии остаются красными, некислотоустойчивые обесцвечиваются
Нанести водный раствор метиленового синего и докрасить 3-5 мин, промыть водой, высушить
Кислотоустойчивые остаются красными, некислотоустойчивые окрашиваются в синий цвет
Кислотоустойчивые бактерии имеют особое строение клеточной стенки, содержащей большое количество сложных липидов (миколовых кислот, восков, глико- и фосфолипидов), что делает эти бактерии кислото-, щелоче- и спиртоустойчивыми. Клеточная стенка этих бактерий плохо воспринимает анилиновые красители и обычные способы окраски. Высокая температура в процессе окраски методом Циля-Нильсена расплавляет липиды, фенол разрыхляет клеточную стенку и краситель проникает внутрь клетки. После остывания препарата липиды вновь затвердевают, прочно удерживая краситель, поэтому кислотоустойчивые бактерии не обесцвечиваются серной кислотой и остаются красными. Некислотоустойчивые бактерии обесцвечиваются и их докрашивают контрастным красителем – метиленовым синим. В основном, метод используется для окраски бактерий, относящихся к роду Mycobacterium (M.leprae, M.tuberculosis, M,bovis и др.)
Источник
Механизмы окрасок по Граму и Цилю-Нильсену
Метод Грама (Gram). Относится к сложным методам окраски и позволяет дифференцировать грамположительные и грамотрицательные бактерии, что является важным таксономическим признаком. Результат окраски определяется особенностями строения клеточной стенки бактерий. При окраске генцианвиолетом и последующем воздействии раствора Люголя образуется комплексное соединение генцианвиолета и йода с пептидогликаном, которое при обработке спиртом удерживается в клетках грамположительных бактерий, имеющий многослойный пептидогликан и вымывается из грамотрицательных бактерий, имеющих тонкий слой пептидогликана. При дополнительной окраске водным раствором фуксина грамотрицательные бактерии приобретают красный цвет.
Таблица 4. Метод Грама
| Этапы окраски | Цвет бактерий |
| 1. На фиксированный мазок поместить фильтровальную бумажку, пропитанную генцианвиолетом, смочить водой, 2-3 минуты | Все бактерии окрашиваются в фиолетовый цвет |
| 2. Снять бумажку, слить с препарата оставшуюся краску и налить раствор Люголя на 1 минуту | Все бактерии остаются фиолетовыми |
| 3. Для дифференцирования нанести на мазок этиловый спирт в течение 3-6 с, промыть водой | Грамположительные бактерии остаются фиолетовыми, грамотрицательные обесцвечиваются |
| 4. Нанести фуксин Пффейфера (водный раствор фуксина) на 1-2 мин, промыть водой, высушить | Грамположительные остаются фиолетовыми, грамотрицательные окрашиваются в красный цвет |
Метод Циля-Нильсена.Относится к сложным методам окраски и позволяет дифференцировать кислотоустойчивые и некислотоустойчивые бактерии.
Таблица 5. Метод Циля-Нильсена
| Этапы окраски | Цвет бактерий |
| 1. На фиксированный мазок нанести карболовый раствор фуксина Циля через полоску фильтровальной бумаги и подогреть препарат в пламени горелки до появления паров (повторить 3-4 раза) | Все бактерии окрашиваются в красный цвет |
| 2. Снять бумагу, промыть мазок водой | Все бактерии остаются красными |
| 3. Для дифференцирования нанести 5% раствор серной кислоты на 1-2 минуты | Кислотоустойчивые бактерии остаются красными, некислотоустойчивые обесцвечиваются |
| 4. Нанести водный раствор метиленового синего и докрасить 3-5 мин, промыть водой, высушить | Кислотоустойчивые остаются красными, некислотоустойчивые окрашиваются в синий цвет |
Кислотоустойчивые бактерии имеют особое строение клеточной стенки, содержащей большое количество сложных липидов (миколовая и фтиоловая кислоты, воск D, глико- и фосфолипидовы), что делает эти бактерии кислото-, щелоче- и спиртоустойчивыми. Клеточная стенка этих бактерий плохо воспринимает анилиновые красители и обычные способы окраски. Высокая температура в процессе окраски методом Циля-Нильсена расплавляет липиды, фенол разрыхляет клеточную стенку и краситель проникает внутрь клетки. После остывания препарата липиды вновь затвердевают, прочно удерживая краситель, поэтому кислотоустойчивые бактерии не обесцвечиваются серной кислотой и остаются красными. Некислотоустойчивые бактерии обесцвечиваются и их докрашивают контрастным красителем – метиленовым синим. В основном, метод используется для окраски бактерий, относящихся к роду Mycobacterium (M.tuberculosis, M.bovis, M.leprae и др.)
Занятие № 2
ТЕМА: Специальные методы окраски. Устройство биологического микроскопа. Виды микроскопии. Порядок проведения иммерсионной микроскопии.
ЦЕЛЬ ЗАНЯТИЯ: знать различные методы окраски, используемые для выявления структур бактериальной клетки (спор, капсул, включений) и отдельных групп микроорганизмов; устройство биологического микроскопа и правила работы с ним; виды микроскопии (фазово-контрастная, люминесцентная, темнопольная, электронная); порядок проведения микроскопии с масляной иммерсией.
уметь выявлять наличие капсул у бактерий в препаратах, окрашенных методом Бурри-Гинса; выявлять наличие спор у бактерий в препаратах, окрашенных методом Ожешко; готовить препараты “раздавленной” и “висячей” капли из грибов и бактерий; определять подвижность у бактерий; определять включения бактерий (зерна волютина) в препаратах, окрашенных методом Леффлера; проводить микроскопию с масляной иммерсией.
1. Вопросы для самоподготовки:
1. Специальные методы окраски для выявления отдельных структур бактериальной клетки (Бурри-Гинса, Ожешко, Леффлера и др.)
2. Методы окраски отдельных групп про- и эукариот
3. Изучение подвижности микроорганизмов
4. Виды микроскопии (фазово-контрастная, люминесцентная, темнопольная, электронная)
5. Устройство биологического микроскопа
6. Порядок проведения иммерсионной микроскопии
2. Контрольные вопросы
1) Перечислить основные части биологического микроскопа ___________________________
2) Выписать какие структуры или свойства микробов определяются при следующих методиках окрасок:
по Граму — _________________________; по Цилю-Нильсену — ________________________;
по Ожешко — _______________________; по Бурри-Гинсу — __________________________;
при микроскопии в тёмном поле препаратов «раздавленная капля» и «висячая капля» — ________________________________________________________________________________
3) Выписать порядок проведения иммерсионной микроскопии:
______________________________________________________________________________ББазовый текст
Специальные методы окраски для выявления отдельных структур бактерий
Метод Бури-Гинса.Относится к сложным методам окраски и используется для выявления капсулы бактериальной клетки. Этапы окраски:
1. На предметном стекле смешать каплю взвеси микробных клеток с каплей туши, разведенной 1:10 и при помощи стекла со шлифованным краем сделать мазок таким же образом, как мазок крови, высушить и осторожно фиксировать в пламени горелки или горящим на мазке спиртом.
2. Нанести на мазок водный раствор фуксина на 1-2 мин.
3. Промыть водой, высушить на воздухе.
Метод Бурри-Гинса относится к негативным методам окраски: на первом этапе тушь, обтекая капсульные бактерии, создает черный или коричневый фон (соответствующий цвету туши) на котором хорошо видны неокрашенные бактерии, которые на втором этапе окрашиваются в красный цвет, а капсула остается бесцветной. Таким образом, капсулы бактерий хорошо видны на темном фоне туши виде неокрашенных зон вокруг красных бактерий.
Метод Ожешко (Ауэски). Относится к сложным методам окраски и используется для выявления спор бактерий. Этапы окраски:
1. На нефиксированный мазок нанести 0,5% раствор хлористоводородной кислоты (HCl) и подогреть в течение 2-3 мин на пламени (для протравливания плотной оболочки споры) до полного испарения кислоты.
2. Окрасить по методу Циля-Нильсена.
Споры бактерий будут окрашиваться в красный цвет (как кислотоустойчивые бактерии), а вегетативные формы в синий цвет (как некислотоустойчивые бактерии).
Источник
