Дифференциальная окраска хромосом.
В зависимости от целей цитогенетического исследования используются различные методы окрашивания хромосом (см. рис. 9). Наиболее распространенными из них являются рутинная или обычная окраска и ряд методов дифференциального окрашивания хромосом: Q-, G, С-, R- и NOR- или Ag-окраска.В свою очередь, методы
дифференциального окрашивания делятся на две группы:
1) приводящие к образованию сегментов вдоль длины всех хромосом (например Q-, G- или R-сегменты);
2) приводящие к окрашиванию специфических хромосомных структур, в результате чего выявляется ограниченное число сегментов (С-, Т- или NOR-сегменты). Рис.9.Методы окрашивания хромосом (8)
Рутинная окраскахромосом достигается путем простого окрашивания полученных хромосомных препаратов красителем Романовского-Гимза (азурэозином) или 2% ацетоорсеином, или 2% ацетокармином, без какой-либо их предварительной обработки. Такая окраска приводит к равномерному и интенсивному прокрашиванию хромосом по длине, что не позволяет идентифицировать разные морфологически сходные хромосомы набора. Исторически рутинная окраска была самой первой используемой в цитогенетике человека окраской, активно применяющейся в течение 1959-1970 гг., до внедрения методов дифференциального окрашивания хромосом. В настоящее время она практически не применяется для диагностики конституциональных хромосомных нарушений, однако находит применение при анализе хромосомных аберраций в тестировании факторов среды на мутагенную активность. Такую окраску можно применять для выявления численных аномалий хромосом.
Q-окраска(от англ. Quinacrine — акрихин) выявляется на хромосомах в виде чередования ярко- и темно-флюоресцирующих полос с помощью флуоресцентной микроскопии хромосомных препаратов, окрашенных такими флюорохромами (флуоресцентными красителями) как производные акридина — акрихин дигидрохлорид (атебрин) или акрихин-иприт. Эти красители обладают способностью присоединяться к ДНК путем интеркаляции или с помощью внешних ионных сил. Q-окраска имеет свою кодировку (QFQ)по международной цитогенетической номенклатуре. Заслуга применения производных акрихина для получения Q-сегментов на хромосомах человека принадлежит шведскому цитогенетику Касперссону (1970 г.). В популяциях человека существует межиндивидуальная вариабельность отдельных участков хромосом, выявляемых с помощью Q-окраски — Q-полиморфизм хромосом. Он выражается в особенно ярко светящихся сегментах, локализованных в центромерных участках (сеn) хромосом 3 и 4, а также в коротких плечах (p11) и спутниках (р13) всех акроцентрических хромосом человека 13-15, 21 и 22. Кроме того, у лиц мужского пола ярко флюоресцирующейся областью является и дистальная часть длинного плеча хромосомы Y — сегмент q12. Этот участок Y-хромосомы обладает выраженным межиндивидуальным полиморфизмом и четко наследуется по мужской линии. Все перечисленные ярко флюоресцирующие участки хромосом являются областями локализации некодирующих повторяющихся гетерохроматиновых последовательностей ДНК, вариабельность которых не приводит к каким-либо фенотипическим изменениям. Указанные выше ярко флюоресцирующие Q-полиморфные хромосомные сегменты являются удобными цитогенетическими маркерами и могут быть использованы как для характеристики популяций, индивидов и клеточных линий, так и для решения некоторых судебно-медицинских проблем. Метод позволяет даже в интерфазном ядре идентифицировать У-хромосому человека по яркой флуоресценции.
G-окраска(от англ. Giemsa — Гимза) выявляется благодаря предварительной обработке хромосомных препаратов слабым раствором протеолитического фермента трипсина и последующей окраске красителем Гимза. При этом наблюдается полосатая исчерченность хромосом, где темные полосы в некоторой степени соответствуют гетерохроматиновым районам, а светлые -эухроматиновым. G-окраска имеет свою кодировку (GTG) по международной цитогенетической номенклатуре. Оптимальные условия окраски находят в каждой лаборатории эмпирическим путем. Методика G-окраски хромосом человека была впервые предложена английской исследовательницей М. Сибрайт в 1972 году и практически в неизменном виде используется до настоящего времени. По числу, величине и расположению выявляющихся сегментов рисунок G-окраски аналогичен рисунку при Q-окраске, где темно окрашенные G-сегменты соответствуют флюоресцирующим Q-сегментам. Различия состоят в том, что: а) несветящиеся гетерохроматиновые центромерные сегменты в хромосомах 1 и 16 хорошо прокрашиваются красителем Гимза; б) ярко флюоресцирующие при Q-окраске сегменты 3, 4, 13-15, 21, 22 и Y-хромосом не выделяются особой интенсивностью при G-окраске. На G-окрашенных метафазных хромосомах выделяется около 320 сегментов на гаплоидный геном. Преимущество метода в том, что он не требует использования флуоресцентного микроскопа и окрашенные препараты можно длительно хранить.
R-окраска(от англ. Reverse — обратная) отличается противоположностью рисунка G-окраске. Темноокрашенными здесь являются эухроматиновые участки хромосом, а светлыми — гетерохроматиновые. Существует несколько модификаций метода R-окраски и каждый из них имеет свою кодировку по международной цитогенетической номенклатуре. Одним из них является обработка препаратов Ва(ОН)2 с контролируемой тепловой денатурацией и последующей отмывкой в дистиллированной воде и окрашиванием раствором красителя Гимза. Кодировка R-окраски, полученной таким способом — RHG.
С-окраска(от англ. Constitutive heterochromatin — конститутивный гетерохроматин) выявляется в виде вариабельных по величине темноокрашенных сегментов конститутивного гетерохроматина в прицентромерных районах хромосом, в то время как эухроматиновые участки хромосом прокрашиваются очень бледно. Методы получения С-окраски могут варьировать, но важным условием является предварительная обработка препаратов щелочью с последующей двухчасовой инкубацией препарата в двукратном стандартном солевом растворе при 65°С. Окраску препаратов производят красителем Гимза. С-окраска имеет свою кодировку (CBG) по международной цитогенетической номенклатуре. Конститутивный гетерохроматин построен преимущественно из многократно повторяющихся последовательностей ДНК, так называемой сателлитной ДНК, выявляемой во время градиентного центрифугирования хроматина. В популяциях человека, также как и в случае Q-окрашивания, существует межиндивидуальная вариабельность по определенным участкам хромосом, в данном случае по величине блоков С-гетерохроматина, выявляемых с помощью С-окраски (С-полиморфизм хромосом). По локализации выделяют четыре типа С-хроматина: 1) собственно центромерный, присущий всем хромосомам, с относительно небольшими по площади темноокрашенными блоками; 2) более крупные блоки гетерохроматина, располагающиеся в прицентромерных районах длинных плечей аутосом 1, 9 и 16, обладающие четко выраженным межиндивидуальным полиморфизмом; 3) большой блок гетерохроматина дистальной части длинного плеча Y-хромосомы, заметно варьирующий по величине у разных лиц мужского пола; 4) гетерохроматин коротких плеч акроцентрических хромосом. Метод выявления центромерного гетерохроматина позволяет прежде всего оценить хромосомный полиморфизм четырех хромосом набора -1, 9, 16 и Y, а также используется в практике клинической цитогенетики для уточнения характера структурных перестроек, затрагивающих данные хромосомы. По международной цитогенетической номенклатуре увеличенные или уменьшенные блоки гетерохроматина обозначаются как qh+ или qh- (h гетерохроматин). Например, запись кариотипа 46,XX,9qh+ означает, что у нормальной женщины имеется вариант хромосомы 9 с большим гетерохроматиновым блоком в длинном плече, а запись 46,XYqh- означает, что у мужчины имеется уменьшение длины гетерохроматинового блока на длинном плече Y-хромосомы.
NOR-окраска(от англ. Nucleolar Organizer Region — Ядрышко-Образующие Районы — ЯОР) или Ag-окраска (серебрение) применяется для выявления ядрышкообразующих районов, расположенных в коротких плечах (сегмент ql2 — спутничная нить) всех 5 пар акроцентрических хромосом человека (13, 14, 15, 21 и 22), с помощью окрашивания солями серебра. Известно, что районы ядрышковых организаторов содержат гены рибосомальной РНК (рРНК). Единица транскрипции генов рРНК содержит гены 5,8S, 18S и 28S РНК. Ряды рРНК транскрипционных единиц располагаются тандемно вдоль ДНК и отделяются друг от друга нетранскрибируемыми последовательностями — спейсерами. Транскрибируемый район и нетранскрибируемый спейсер тандемно повторяются примерно 40 раз в каждой из 5 пар акроцентрических хромосом, составляя около 400 копий рибосомных генов на геном. В настоящее время для визуализации этих районов на метафазных хромосомах применяют метод серебрения Хоуэлла и Блэка (1980 г.). С помощью этого метода сами хромосомы окрашиваются в желтый цвет, а в коротких плечах акроцентрических хромосом на спутничных нитях четко выделяются черные точечные образования — глыбки восстановленного металлического серебра. Размеры этих глыбок, отражающие активность ЯОР, которые функционировали в предшествующей интерфазе, на разных хромосомах существенно варьируют — от отсутствия заметной окраски — до достаточно крупных блоков серебра (Ag-полиморфизм). Тонкие механизмы окраски ядрышкообразующих районов хромосом пока неизвестны, но ясно, что красящим субстратом является не ДНК рибосомных генов и не рРНК, а кислые белки, связанные с ней. Для оценки данного типа хромосомного полиморфизма предложена полуколичественная 5-балльная система оценки активности ЯОР каждой из пяти пар акроцентрических хромосом генома человека (0 — отсутствие окраски, 1 — слабая, 2 — средняя, 3 — сильная и 4 — очень сильная окраска ЯОР хромосом, при которой размеры Ag-блока значительно превышают толщину хроматид). При сложении баллов отдельных ЯОР может быть оценена активность всех 10 ЯОР генома по критерию суммарной функциональной активности ЯОР, предложенному Н.А. Ляпуновой с соавт. (1988). В популяциях человека существует межиндивидуальный полиморфизм Ag-окрашенных хромосом, который выражается в специфичности степени окраски отдельных хромосом у разных индивидов, являющейся наследуемой характеристикой.
Т-окраска(от англ. Telomere — теломера) — применяется для выявления теломерных районов хромосом в коротких и длинных плечах. Метод включает инкубацию препаратов хромосом при 87°С в течение 20-60 мин в растворе фосфатного буфера при рН 5,1 с последующей окраской раствором красителя Гимза.
Источник
Рутинный и дифференциальный методы окрашивания метафазных хромосом для последующего кариотипирования. их решающая способность.
Рутинный метод: краситель — ацетокармин, ацетоорсии; участки хромосом-равномерная окраска по всей длине хромосомы. Основные применения-групповая идентификация хромосом;
Дифференциальные методы- С-метод: краситель-гимза, орсеин, кармин; уч.хром-гетерохроматин; основ.прим-выявление структурного гетерохроматина.
G-метод: крас-гимза. Уч.хром-G-сегменты. Основ.прим-индивидуализация метафазных хромосом и их фрагментов.
Ag-метод: крас.-нитрат серебра. Уч.хром-ядрышкообраующие районы. Основ.прим-выявление полиморфизма хромосом по ядрышкообразующим районам.
Q-метод: крас.-акрихин,акрихин-иприт,пропил-акрихин; уч.хром-гетерохроматиновые районы. Основ.прим.-индивидуализация метафазных хромосом,определение ху полового хроматина.
FISH-метод: крас-флуорохромосомы; уч.хром-каждая хромосома окрашивается своим собственным цветом. Основ.прим-индивидуализация каждой хромосомы,явление хромосомных перестроек.
Понятие о жцк
Жизненный цикл — это время существования клетки от момента ее образования путем деления материнской клетки до собственного деления или естественной гибели.
У клеток сложного организма жизненный цикл клетки может быть различным. Высокоспециализированные клетки (эритроциты, нервные клетки, клетки поперечнополосатой мускулатуры) не размножаются. Их жизненный цикл состоит из рождения, выполнения предназначенных функций, гибели (гетерокаталитической интерфазы).Важнейшим компонентом клеточного цикла является митотический цикл. Он представляет собой комплекс взаимосвязанных и согласованных явлений во время деления клетки, а также до и после него. Митотический цикл — это совокупность процессов, происходящих в клетке от одного деления до следующего и заканчивающихся образованием двух клеток следующей генерации. Кроме этого, в понятие жизненного цикла входят также период выполнения клеткой своих функций и периоды покоя. В это время дальнейшая клеточная судьба неопределенна: клетка может начать делиться либо начать готовиться к выполнению специфических функций.
Митоз — это основной тип деления соматических эукариотических клеток. Процесс деления включает в себя несколько последовательных фаз и представляет собой цикл. Его продолжительность различна и составляет у большинства клеток от 10 до 50 ч. При этом у клеток тела человека продолжительность самого митоза составляет 1—1,5 ч, G2-периода интерфазы — 2—3 ч, S-периода интерфазы — 6—10 ч.
Основные периоды жцк,способных к делению. Их характеристика. пример.
Клеточный цикл состоит из двух периодов:
Период клеточного роста, называемый «интерфаза», во время которого идет синтез ДНК и белков и осуществляется подготовка к делению клетки.
Периода клеточного деления, называемый «фаза М».
Интерфаза состоит из нескольких периодов:
G1-фазы, или фазы начального роста, во время которой идет синтез мРНК, белков, других клеточных компонентов;
S-фазы, во время которой идет репликация ДНК клеточного ядра, также происходит удвоение центриолей.
G2-фазы, во время которой идет подготовка к митозу.
Например: Зигота, образовавшаяся после слияния яйцеклетки и сперматозоида, делится с образованием двух дочерних клеток. Затем, в результате последовательных делений, образуются четыре, восемь, шестнадцать клеток и так далее. Параллельно с увеличением численности на этапе эмбриогенеза происходит дифференцировка клеток – так образуются ткани
Источник
