Реакция кумбса микробиология способ постановки

49. Реакция Кумбса. Механизм. Компоненты. Применение.

Реакцию агглютинации для определения антирезусных антител (непрямую реакцию Кумбса) применяют у больных при внутрисосудистом гемолизе. У некоторых таких боль­ных обнаруживают антирезусные антитела, которые являются неполными, одновалент­ными. Они специфически взаимодействуют с резус-положительными эритроцитами, но не вызывают их агглютинации. Наличие таких неполных антител определяют в непрямой реакции Кумбса. Для этого в систему антирезусные антитела + резус-положительные эритроциты добавляют антиглобулиновую сыворотку (антитела против иммуноглобули­нов человека), что вызывает агглютинацию эритроцитов. С помощью реакции Кумбса диагностируют патологические состо­яния, связанные с внутрисосудистым лизисом эритроцитов иммунного генеза, например ге­молитическую болезнь новорожденных: эрит­роциты резус-положительного плода соединя­ются с циркулирующими в крови неполными антителами к резус-фактору, которые пере­шли через плаценту от резус-отрицательной матери.

Механизм. Сложность выявления неполных (моновалентных) антител связана с тем, что эти антитела, связываясь с эпитопами специфического антигена, не образуют структуру решетки и реакция между антигенами и антителами не выявляется ни агглютина­цией, ни преципитацией, ни другими тестами. Для выявления образовавшихся комплексов антиген — антитело приходится ис­пользовать дополнительные тест-системы. Для выявления непол­ных антител, например к резус-антигену эритроцитов в сыворот­ке крови беременной женщины, реакция ставится в два этапа: 1) к двукратным разведениям испытуемой сыворотки добавляют эритроциты, содержащие резус-антиген, и выдерживают при 37 °С в течение часа; 2) к тщательно отмытым после первого этапа эритроцитам добавляют кроличью античеловеческую анти-глобулиновую сыворотку (в заранее оттитрованном рабочем раз­ведении). После инкубации в течение 30 мин при 37 °С резуль­таты оценивают по наличию гемагглютинации (положительная реакция). Необходимо ставить контроль ингредиентов реакции: 1) антиглобулиновая сыворотка + заведомо сенсибилизирован­ные специфическими антителами эритроциты; 2) обработанные нормальной сывороткой эритроциты + антиглобулиновая сыво­ротка; 3) обработанные исследуемой сывороткой резус-отрица­тельные эритроциты + антиглобулиновая сыворотка.

50. Реакция пассивной гемагглютинации. Механизм. Компоненты. Применение.

Реакция непрямой (пассивной) гемагглютинации (РНГА, РПГА) основана на использова­нии эритроцитов (или латекса) с адсорбиро­ванными на их поверхности антигенами или антителами, взаимодействие которых с соот­ветствующими антителами или антигенами сыворотки крови больных вызывает склеива­ние и выпадение эритроцитов на дно пробирки или ячейки в виде фестончатого осадка.

Компоненты. Для постанов­ки РНГА могут быть использованы эритроциты барана, лошади, кролика, курицы, мыши, человека и другие, которые заготавли­вают впрок, обрабатывая формалином или глютаральдегидом. Ад­сорбционная емкость эритроцитов увеличивается при обработке их растворами танина или хлорида хрома.

Антигенами в РНГА могут служить полисахаридные АГ микро­организмов, экстракты бактериальных вакцин, АГ вирусов и риккетсий, а также другие вещества.

Эритроциты, сенсибилизированные АГ, называются эритроцитарными диагностикумами. Для приготовления эритроцитарного диагностикума чаще всего используют эритроциты барана, обла­дающие высокой адсорбирующей активностью.

Применение. РНГА применяют для диагностики инфекционных болезней, определения гонадотропного гор­мона в моче при установлении беременности, для выявления повышенной чувствительнос­ти к лекарственным препаратам, гормонам и в некоторых других случаях.

Механизм. Реакция непрямой гемагглютинации (РНГА) отличается значительно более высокой чувствительностью и специфич­ностью, чем реакция агглютинации. Ее используют для иденти­фикации возбудителя по его антигенной структуре или для индикации и идентификации бактериальных продуктов — токси­нов в исследуемом патологическом материале. Соответственно используют стандартные (коммерческие) эритроцитарные анти­тельные диагностикумы, полученные путем адсорбции специфи­ческих антител на поверхности танизированных (обработанных танином) эритроцитов. В лунках пластмассовых пластин готовят последовательные разведения исследуемого материала. Затем в каждую лунку вносят одинаковый объем 3 % суспензии на­груженных антителами эритроцитов. При необходимости реакцию ставят параллельно в нескольких рядах лунок с эритроцитами, нагруженными антителами разной групповой специфичности.

Через 2 ч инкубации при 37 °С учитывают результаты, оценивая внешний вид осадка эритроцитов (без встряхивания): при отри­цательной реакции появляется осадок в виде компактного.диска или кольца на дне лунки, при положительной реакции — харак­терный кружевной осадок эритроцитов, тонкая пленка с неров­ными краями.

Источник

Реакция Кумбса

АГС производится путем смешивания сыворотки из крови лабораторных животных, иммунизированных иммуноглобулинами класса G человека, и моноклональных антител к одному из компонентов – C3D комплементу сыворотки человека. АГС вызывает агглютинацию эритроцитов, сенсибилизированных специфическими антителами. При отсутствии антител на эритроцитах под воздействием АГС положительная реакция не происходит.

Непрямая реакция Кумбса позволяет определить наличие:

• антигенов эритроцитов, выявляемых IgG-реагентами («неполными» антителами, например, моноклональными реагентами анти-D, анти-F_Y a , анти-F_Y b );
• антиэритроцитарных антител класса IgG.

Непрямой антиглобулиновый тест: выявление антигенов эритроцитов

Приводим методику непрямой реакции Кумбса на примере цоликлона анти-D IgG.

1. Промаркируйте чистую пробирку: укажите ФИО исследуемого лица.
2. Внесите в пробирку 2 капли (приблизительно 0,1 мл) цоликлона анти-D IgG.
3. Добавьте 2 капли 5 % взвеси предварительно отмытых физиологическим раствором анализируемых эритроцитов. Смешайте исследуемые образцы с цоликлоном.
4. Инкубируйте смесь на водяной бане или в термостате при 37 °С на протяжении 30 минут.
5. Добавьте в пробирку пастеровской пипеткой 5 — 10 мл физраствора.
6. Центрифугируйте пробирку с центробежным ускорением 1200 g при 18 – 25 °С на протяжении одной минуты.
7. Удалите физраствор.
8. Повторно проведите процедуру отмывки эритроцитов с помощью центрифугирования еще 2 – 3 раза.
9. Добавьте 2 капли антиглобулиновой сыворотки к осадку кровяных телец, выполните перемешивание.
10. Центрифугируйте пробирку с центробежным ускорением 1200 g в течение минуты при температуре 18 – 25 °С.
11. Добавьте с помощью дозатора или пастеровской пипетки 3 – 5 капель физраствора.
12. Ресуспендируйте осадок и визуально оцените наличие агглютинации. Выраженные агглютинаты на дне пробирки на фоне прозрачного раствора свидетельствуют об обнаружении антигена эритроцитов. Непрозрачная суспензия кровяных телец говорит об отсутствии антигена.

Источник

Антиглобулиновый тест. Прямая и непрямая реакция Кумбса.

• УЗИ
• Функциональная диагностика
• Рентген методы
• Эндоскопические методы

1. Что такое антиглобулиновый тест, или реакция Кумбса?

Антиглобулиновый тест, или реакция Кумбса проводится для того, чтобы выявить определенные антитела, которые атакуют красные кровяные клетки (эритроциты).

Антитела это белки, производимые иммунной системой. Как правило, антитела связываются с посторонними веществами, такими как бактерии и вирусы, и уничтожают их.

2. Зачем нужен тест на антитела?

Тест на антитела может проводиться в следующих случаях:

Перед переливанием крови

Вы наверняка знаете, что у человека может быть одна из четырех групп крови. И антиглобулиновый тест можно проводить для определения возможности переливания крови. Если вам делают переливание, кровь донора должна соответствовать вашему типу (иметь одинаковые антигены). Если при переливании антигены отличаются, иммунная система разрушит перелитые клетки. Это может привести к серьезным заболеваниям и даже смерти. Именно поэтому поиск нужного типа крови является столь важным фактором.

Для выявления риска резус-сенсибилизации

Резус это антиген. Его полное название — резус-фактор. Тест Кумбса используется для обнаружения антител к резус-фактору в крови у беременных женщин. Если женщина с отрицательным резус-фактором крови беременна ребенком с положительным резус-фактором (он может передаваться от отца), есть риск наступления резус-сенсибилизации. Резус- сенсибилизация происходит, когда кровь ребенка смешивается с кровью матери во время беременности или родов. Если группа крови матери несовместима с группой крови ребенка, то ее иммунная система может атаковать плод, воспринимая его чужеродным объектом. При этом может развиться тяжелое заболевание, именуемое эритробластозой плода. В редких случаях, если заболевание не лечить, плод или новорожденный могут погибнуть.

Женщине с отрицательным резус-фактором крови могут провести инъекцию анти-Rh- гаммаглобулина (например, RhoGAM), используемого для предотвращения развития Rh- гемолитической болезни.

Для диагностики аутоиммунной гемолитической анемии

Аутоиммунная гемолитическая анемия является редким заболеванием, связанным с образованием антител к собственным антигенам эритроцитов.

3. Типы антиглобулиновой пробы

Существуют два типа антиглобулиновой пробы, или реакции Кумбса: прямой и непрямой.

Прямая реакция Кумбса, или прямой антиглобулиновый тест обнаруживает антитела, связанные с эритроцитами. Он используется для определения анемии. При этой болезни эритроциты разрушаются быстрее, чем производятся.

Непрямая реакция Кумбса, или непрямой антиглобулиновый тест проводится для поиска антител, не связанных с эритроцитами. Для пробы используется сыворотка крови, в которой и находятся антитела. Эта процедура достаточно редкая: в основном ее проводят для определения возможности переливания крови или как этап обследования беременных женщин.

4. Результаты реакции Кумбса

Отрицательный результат теста — антитела не обнаружены.

• Прямой тест Кумбса. Отрицательный результат прямого антиглобулинового теста означает, что ваша кровь не имеет антител, связанных с эритроцитами.
• Непрямой тест Кумбса. Отрицательный результат непрямого антиглобулинового теста означает, что ваша кровь совместима с кровью донора. Для беременной женщины такой результат означает, что ее организм не выработал антитела против резус- положительного типа крови своего ребенка (резус-сенсибилизации не произошло).

Отклонение от нормы:

• Прямой тест Кумбса. Положительный результат прямого антиглобулинового теста означает, что ваша кровь имеет антитела, которые борются против эритроцитов. Это может быть вызвано переливанием несовместимой крови или такими заболеваниями, как гемолитическая анемия или гемолитическая болезнь новорожденных (ГБН).
• Непрямой тест Кумбса. Положительный результат непрямого антиглобулинового теста означает, что ваша кровь несовместима с кровью донора. У беременной женщины такие результаты означают присутствие антител против положительного резус-фактора крови ребенка (резус-сенсибилизация). Если ребенок имеет положительный резус-фактор крови, мать будет внимательно наблюдаться врачом на протяжении всей беременности.

Источник

Реакция кумбса микробиология способ постановки

Реакция Кумбса. Метод выявляет неполные (одновалентные) AT, образующиеся при бруцеллёзе, резус-конфликте или системных коллагенозах. Реакция также известна как антигло-булиновый тест. Для постановки реакции необходима антиглобулиновая сыворотка, содержащая полные (как минимум двухвалентные) AT.

Неполные AT предварительно инкубируют с корпускулярным Аг и вносят антиглобулиновую сыворотку. Одна молекула полных AT взаимодействует с двумя молекулами неполных AT, связавших Аг, в результате происходит видимая агглютинация или гемагглютинация (рис. 10-15).

Рис. 10-15. Выявление неполных антител ( AT ) (проба Кумбса). Соединение неполных AT (А) с Аг (Б) не вызывает агглютинации (1). Добавление антиглобулиновой сыворотки (В) приводит к появлению видимой агглютинации (2).

Метод латекс-агглютинации. В последние годы ассортимент диагностикумов из убитых микробов дополнили так называемые суспензионные Аг и AT, сорбированные на различных инертных корпускулярных носителях. Среди них наибольшее распространение нашёл метод латекс-агглютинации, основанный на взаимодействии Аг (или AT) в образце с частицами латекса, нагруженными специфическими моноклональными AT (или Аг), что ведёт к быстрому образованию видимых агрегатов.

Учёт результатов проводят через 10-15 мин при косом освещении на тёмном фоне. Разработаны коммерческие диагностикумы для выявления Аг Streptococcus pneumoniae, стрептококков группы В, Haemophilus influenzae типа b и капсулированных штаммов менингококка в различных тканевых жидкостях (СМЖ, сыворотке крови, моче). Также имеются наборы для выявления Аг стрептококков группы А в мазках из зева; для первичной экспресс-идентификации колоний стрептококков групп А, В, С, F, энтерококков, Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae типов a-f, золотистого стафилококка, Neisseria meningitidis и Neisseria gonorrhoeae.

— Вернуться в оглавление раздела «Микробиология.»

Источник

Реакция кумбса микробиология способ постановки

При наличии неполных (блокирующих) антител на поверхности эритроцитов исследуемого пациента происходит агглютинация эритроцитов при инкубации их с антиглрбулиновой сывороткой (прямой тест Кумбса) или с разведениями сыворотки пациента в реакции с предварительно сенсибилизированными эритроцитами донора (непрямой тест).

Посуда.

1. Пробирки химические.
2. Пастеровские пипетки.
3. Мелкие белые тарелочки.

Реактивы.

1. Раствор 5 % цитрата натрия.
2. 0,9 % раствор хлорида натрия.
3. Антиглобулинювая сыворотка (сыворотка . Кумбса) с титром преципитинов не ниже 1:256— 1:512.

Прямая реакция Кумбса.

Ход определения.

3 мл крови берут из локтевой вены исследуемого в одну пробирку с предварительно внесенным 1 мл 5 % раствора цитрата натрий. Эритроциты трижды отмывают в большом объеме изотонического раствора «атрия хлорида путем центрифугирования при 1500 об/мин, в течение 10 мин. Из отмытых эритроцитов готовят 5 % взвесь на изотоническом растворе (1 капля отмытых эритроцитов и 19 капель изотонического раствора). На сухую частую белую тарелку наносяткапяю антиглобулнновой сыворотки, к ней .добавляют каплю 5 % взвеси эритроцитов исследуемого. Сыворотку перемешивают с эритроцитами стеклянной палочкой. Рядом ставят, контроль, используя вместо сыворотки изотонический раствор. Каждую новую серию антиглобулиновой сыворотки ставят аналогичным путем со стандартными сенсибилизированными эритроцитами и с интактными донорскими эритроцитами различной группы. Перемешанные эритроциты с сывороткой слегка покачивают не более 10 мин.

Учет реакции.

Появление агглютинации указывает на наличие неполных антител на поверхности эритроцитов. Реакция может быть проведена в пробирках. В этом случае 2 капли (0,1 мл) различного разведения антиглобулиновои сыворотки (в зависимости, от титра преципитинов) помещают в пробирки и добавляют каплю отмытых эритроцитов. Осторожно встряхивают и инкубируют 30 мин при 37 °С.

Учет реакции проводят после центрифугирования при 1500 об/мин в течение 1 мин (центрифуга ЦЛК-1).

Непрямая реакция Кумбса.

Ход определения.

Из локтевой вены исследуемого берут 3 мл крови в чистую сухую пробирку.

Реакция идет в два этапа:

1. сенсибилизация стандартных эритроцитов неполными антителами, предположительно находящимися в исследуемой сыворотке;
2. агглютинация сенсибилизированных эритроцитов антиглобулиновои сывороткой.

Необходимо использовать троекратно отмытую в изотоническом растворе смесь эритроцитов различных аллотипов 0(I) группы резусположительных. Каплю этих эритроцитов вносят в пробирку и на них наслаивают 3 капли исследуемой сыворотки. Пробирки энергично встряхивают и помещают в термостат при 37 °С на 40 мин. Параллельно опыту ставят контрольные пробы. Первая: в пробирку с 2 каплями стандартных отмытых резусположительных эритроцитов 0(1) группы вносят 3 капли антирезусной сыворотки АВ (IV); вторая: в пробирку с 2 каплями отмытых стандартных резусотрицательных эритроцитов 0(1) вносят 3 капли сыворотки AB(IV). Контрольные пробирки помещают, так же как и опытные, в термостат при 37 °С на 40 мин.

После термостатирования из пробирок осторожно отсасывают сыворотку. Эритроциты трижды отмывают в изотоническом растворе натрия хлорида. На сухую чистую тарелку наносят в 3 точках по 1 капле антиглобулиновои сыворотки. В первую каплю добавляют эритроциты, сенсибилизированные сывороткой пациента, во вторую и третью — эритроциты контроля 0(I) резусположительных с антирезусной сывороткой AB(IV) и 0(I) резусотрицательные с антирезусной сывороткой AB(IV). Эритроциты тщательно перемешивают стеклянной палочкой с антиглобулиновои сывороткой. После этого осторожно покачивают тарелку в течение 10 мин, но не более.

Учет реакции.

При наличии в сыворотке пациента неполных антител в опытной смеси будет наблюдаться агглютинация. Контроль с резусположительными 0(I) эритроцитами должен дать агглютинацию. В контроле с резусотрицательными 0(I) эритроцитами агглютинации не должно быть. В ряде случаев неполные антитела вступают в реакцию при низкой температуре (4 °С), о чем необходимо помнить в исследованиях при подозрении на холодовую иммунную цитопению.

Клиническое значение.

Выявление антител к эритроцитам играет ведущую роль в диагностике аутоиммунных гемолитических анемий, эссенциальных или вторичных.

При системных заболеваниях (системная красная волчанка, хронический активный гепатит, болезнь Шегрена) бывает чаще положительной непрямая реакция Кумбса.

Источник