6.3. Простые методы окраски
При простых способах окраски применяют какой-нибудь один краситель: метиленовый синий или водно-спиртовой раствор фуксина.
Простыми способами окраски пользуются для обнаружения в микроскопируемом материале микробов, определяя их количество, форму и расположение.
Препараты, содержащие, кроме бактерий, тканевые и клеточные элементы, красят метиленовым синим. При этом фон препарата окрашивается значительно слабее, чем тела микробных клеток.
6.3.1. Техника окраски мазков
Окраска мазков красящими бумажками по А.И. Синеву. Для окраски мазков пользуются растворами красок или красящей бумагой, предложенной А.И. Синевым. Простота приготовления, удобство применения, а также возможность хранения красящих бумаг в течение неограниченно долгого времени явились основанием для широкого их использования при различных способах окраски. Рецепты приготовления красок и реактивов, применяемых при окраске бактериальных препаратов, даны в Приложении (рецепт 26).
Окраска мазков красящей бумагой. На высушенный и фиксированный препарат наносят несколько капель воды, кладут окрашенные кусочки бумаги величиной 2×2 см. В течение всего времени прокрашивания бумага должна оставаться влажной и плотно прилегать к поверхности стекла. При подсыхании бумагу дополнительно смачивают водой. Продолжительность окрашивания мазка определяется видом окрашиваемого микроба. По окончании окраски бумагу осторожно снимают пинцетом, а мазок промывают водопроводной водой и подсушивают на воздухе или фильтровальной бумагой.
Окраска мазков растворами красителей. Для ориентировочной окраски высушенного и фиксированного над огнем мазка используют один из следующих красителей:
- на мазок наливают спиртово-водный раствор метиленового синего (рецепт 8) на 3–5 мин;
- водный раствор метиленового синего (рецепт 11) наливают на мазок на 5–10 мин;
- метиленовый синий Леффлера (рецепт 9) окрашивает 1– 2 мин;
- разведенный 1:10 карболовый фуксин (рецепт 18) наливают на фильтровальную бумагу, положенную на фиксированный высушенный мазок для задержки частиц красителя. Окрашивание препарата проводят не более 10–30 с.
Окрашенные препараты промывают водопроводной водой до тех пор, пока в воде не останется следов краски, затем препарат высушивают на воздухе и микроскопируют.
Источник
Простой способ окраски бактерий
Большинство красок, применяемых в микробиологии, принадлежат к производным бензола и добываются из каменноугольной смолы.
Красители применяемые в микробиологии, являются солями двух типов: 1) кислые красители – это те, у которых ион, придающий окраску (хромофор), является анионом (примером может служить эозин); 2) основные красители – те, у которых роль хромофора играет катион (примером может служить метиленовый синий).
Красители первого типа являются кислыми потому, что хромофор, будучи кислотой, при образовании придающей окраску соли, связывается с основанием (NaOH).
Красители второго типа называются основными потому, что хромофор, будучи основанием, при образовании соли связывается с кислотой (HCl)/
Как правило, кислые красители связываются более интенсивно с цитоплазменными (основными) компонентами клетки, а основные – с ядерными (кислыми).
Действие некоторых красителей не зависит от образования солей или других химических соединений с окрашиваемым материалом. Они просто покрывают поверхность, адсорбируясь, растворяясь или осаждаясь в материале.
В процессе окрашивания играют роль как физические, так и химические факторы
Существуют простые и сложные методы окрашивания микропрепаратов.
Простые методы окраски
Для простого метода окрашивания микропрепаратов чаще всего пользуются основными анилиновыми красителями. Очень широко применяют метиловый синий, основной фуксин, кристаллический фиолетовый, тионин.
Простой метод окрашивания может быть применен как для окрашивания убитых микробных клеток в фиксированных микропрепаратах, так и для прижизненной окраски микроорганизмов.
Прижизненной окраской следует считать лишь такую, при которой окрашенные организмы длительное время остаются живыми и способными к размножению. Существует несколько способов прижизненной окраски, в том числе и способ Nakanischi.
При этом способе чистое предметное стекло обливают насыщенным водным раствором метиленовой сини, высушиваю и обтирают сухой тряпочкой до тех пор, пока налет краски не примет светло – голубого оттенка. На покровном стекле приготовляют мазок из исследуемых микробов, после чего не высохший до конца препарат накладывают на предметное стекло с красителем. При помощи микроскопа можно наблюдать, как микробы, оставаясь живыми, не теряя своей активной подвижности (если таковой обладают), постепенно окрашиваются в синий цвет.
Этот метод ценен тем, что при его применении отсутствует опасность образования искусственных продуктов обработки, в возможности выявления некоторых функциональных особенностей микробной клетки.
Среди простых методов окраски существуют как позитивные, так и негативные способы окрашивания.
К простым позитивным методам окраски относится окраска по методу Лнеффлера, а к негативным – окрашивание по методу Бури.
Для окраски по методу Леффлера (Loffler) можно применить раствор метиленового синего (краситель Леффлера), который позволяет выявить многие детали формы и структуры микроорганизмов. Краситель Леффлера представляет собой смесь двух растворов А и Б.
Раствор А: метиловый синий – 0,3г, этиловый спирт – 30,0мл.
Раствор Б: КОН (0,01%) – 100мл.
Смесь хорошо сохраняется во флаконе с притертой стеклянной пробкой.
Для получения более чистых препаратов, краску можно наливать на мазок покрытый фильтровальной бумагой, или использовать фильтровальную бумагу заранее пропитанную красителем и высушенную. В таком случае на фиксированный мазок накладывают полоску сухой пропитанной красилелем фильтровальной бумаги, а затем на бумагу пипеткой наносят несколько дистиллированной воды и пинцетом или шпателем прижимают фильтровальную бумагу к стеклу. Краситель вымывается из бумаги и окрашивает мазок. По истечении времени окрашивания, фильтровальную бумагу снимают, препарат промывают осторожно струей воды, высушивают и микроскопируют.
В правильно окрашенном и хорошо промытом препарате поле зрения остается светлым и чистым, а окрашенными будут только микробные клетки.
Помимо позитивных способов окраски в некоторых случаях применяются негативные (контрастные) способы. В этом случае микроорганизмы, в которые краситель не проникает, выглядят как светлые частички на равномерно окрашенном фоне.
Очень часто для негативного окрашивания микропрепаратов пользуются жидкой черной тушью («негативный способ» Burri).
По способу Бури фон препарата заливают жидкой тушью. Тушь не является истинным красителем, поэтому тела микробов остаются неокрашенными; вследствие чего получается как бы негативное их изображение.
При этом способе тушь разбавляют водой в соотношении 1:9, 1:1 или 1:2.
Поскольку тушь сама по себе может содержать бактерии, ее стерилизуют, добавляя несколько капель формалина или автоклавируют 30 минут при 110 градусах. Перед употреблением подготовленная тушь (разбавленная и стерильная) должна в течение двух – трех недель сохраняться в спокойном состоянии, чтобы осели взвешенные в ней частицы. При приготовлении тушевых препаратов используется верхняя часть отстоявшейся жидкости.
Каплю черной туши наносят на предметное стекло и тщательно смешивают с каплей микробной взвеси. Смесь тонким слоем размазываю по поверхности предметного стекла краем покровного стеклышка. Когда темный слой высохнет, препарат фиксируют и исследуют с помощью микроскопа. Микробные клетки видны в виде бесцветных телец а темном фоне препарата.
Кроме жидкой туши для негативного окрашивания можно использовать водные растворы конгорот (3%0, нигрозина (10%) и некоторых других красителей. Окрашивание негативными красителями можно проводить двумя способами: либо раствор красителя наносить на сухой фиксированный мазок, после промывки водой и высушивания микроскопировать; либо каплю исследуемой суспензии микробов смешивают с красителем, накрывают покровным стеклом и микроскопируют. И в том, и в другом случае микробные клетки будут бесцветными.
Сложные методы окраски
Простой метод позитивного или негативного способа окраски микроорганизмов очень удобен для самых разнообразных целей (изучение формы и расположения клеток, определение размеров, обнаружение капсул у микробных клеток в мазках – отпечатках из органов инфицированного организма и пр.).
Однако простой метод окраски не позволяет дифференцировать микроорганизмы (в том числе и бактерии) сходные по форме и размерам, но принадлежащие к различным видам, простой метод окраски не позволяет обнаружить зрелые споры и цисты, высыпавшиеся из клетки в окружающуюся среду, простой метод окраски не позволяет обнаружить клетки со сложной структурой оболочки и пр.
В силу этого большую ценность представляют сложные методы окраски, позволяющие получить представление не только о форме, размерах, расположении клеток друг относительно друга, по позволяющие дифференцировать микробы и определять структурные детали микробных клеток.
Среди сложных методов окраски большую ценность представляет способ окраски разработанный датским ученым Граммом, позволяющий дифференцировать микроорганизмы на две большие группы, называемые «грамположительными» и «грамотрицательными», что имеет большое значение при идентификации микроорганизмов.
Этот способ окраски называют дифференциальной окраской. В основе дифференциации микробов по Грамму лежит свойство клеточной оболочки и цитоплазматической мембраны.
Основой клеточной стенки грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов является пептидогликан. У грамположительных микробов пептидогликан имеет несколько слоев, у грамотрицательных — он однослоен.
У грамположительных микробов, обладающих плотным и многослойным пептидогликаном, образовавшийся комплекс при окраске кристаллическим фиолетовым и последующей обработке йодным раствором не вымывается спиртом, и клетки не обесцвечиваются и сохраняют фиолетовый цвет. В то время как грамотрицательные микробы, имея тонкий слой пептидогликана, обесцвечиваются спиртом. При дополнительной окраске фуксином или сапранином грамотрицательные клетки окрашиваются в сиреневато – красный цвет.
Микроорганизмы, которые сохраняют окраску, называются «грамположительными» и обозначаются «Г+», а обесцвеченные – «грамотрицательными» и обозначаются «Г-».
Показатели дифференциации грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов:
Грамположительные микроорганизмы не чувствительны к действию желудочного сока, имеют не сложную структуру. Резистентные к щелочам, чувствительны к лизоциму, пенициллину, йоду. Иммуногенные свойства выражены слабо, оптимум роста при относительно высоком рН. В живом состоянии более проницаемы для красителей, чувствительны к электролитам. Могут быть кислотоустойчивыми и могут образовывать споры. Имеют многослойный пептидогликан и могут содержать тейхоевые кислоты. Клеточная стенка пористая, содержит мало белков, пептиды по составу аминокислот однообразны. Липидов мало, много гликопротеидов (99%).
Грамотрицательные микроорганизмы в большинстве случаев растворяются под действием желудочного сока, растворяются в 1% растворе КОН, чувствительны к кислотам. Малочувствительны к лизоциму, пенициллину, йоду. Хорошо выражены иммуногенные свойства. Оптимум роста при низком рН среды. В живом состоянии плохо проницаемы для анилиновых красителей. Резистентны к слабым электролитам, спор не образуют. Основой клеточной стенки является однослойный пептидогликан, тейхоевая кислота отсутствует. Клеточная стенка малопористая, имеет сложную структуру, содержит все аминокислоты. Липидов много (до 22%), гликопротеидов мало (5 – 9%).
Растворы для окраски по методу Грамма:
1. Раствор А – кристаллический фиолетовый – 2,0г, этиловый спирт 95% — 20,0мл.
2. Раствор Б – щавелевокислый аммоний – 0,8г, дистиллированная вода – 80,0 мл.
Раствор А разводят дистиллированной водой (1:5) и затем смешивают его с равным объемом раствора Б.
3. Раствор Люголя – йод кристаллический – 1г, йодистый калий – 2,5г, дистиллированная вода – 80,0мл. Эту смесь оставляют на 24 часа для растворения йода.
4. Раствор для дополнительной окраски – сапранин или фуксин (2,5% раствор в 95% спирте) – 25 мл. Дистиллированная вода – 75мл.
Методика окраски по методу Грамма:
1. Фиксированный мазок, содержащий микробные клетки, окрасить генцианвиолетом (2 минуты).
2. Слить генцианвиолет, после чего нанести на препарат раствор Люголя (2 минуты).
3. Осторожно слить раствор Люголя и промыть препарат 95% этиловым спиртом (30 секунд. Клетки с многослойным пептидогликаном останутся окрашенными генцианвиолетом, с однослойным пептидогликаном – обесцветятся).
4. Препарат осторожно промыть струей воды.
5. Мазок окрасить раствором фуксина или сапранина (1 – 2 минуты).
6. Препарат осторожно промыть струей воды, высушить на воздухе при комнатной температуре или в потоке теплого воздуха над пламенем горелки, или осторожно промокнуть фильтровальной бумагой.
7. Препарат исследовать при помощи микроскопа.
К сложным дифференциально – диагностическим методам окраски относится также и окраска по методу Циль – Нильсена (Ziehl – Naelsen), позволяющая отличить кислотоустойчивые микроорганизмы от других, не обладающих этим свойством.
Этот метод применяется главным образом для выявления кислотоустойчивых микроорганизмов, имеющих своеобразный химический состав, а именно – высокое содержание в клетке липидов. Окраска по Циль – Нильсену применяется для окраски микобактерий туберкулеза и родственных им микроорганизмов из рода Mycobacterium.
Приготовление и окраска микопрепарата по Циль – Нильсену проводится следующим образом:
1. Готовят обычным способом фиксированный мазок из исследуемого материала (мокрота больного или чистая культура).
2. На фиксированный мазок кладут фильтровальную бумагу и на нее наливают раствор карболового фуксина. Предметное стекло зажимают в пинцет Корне и препарат в течение 4-х минут нагревают над пламенем горелки (по мере испарения жидкости раствор красителя добавляется).
3. Через 4 минуты (по окончанию прогревания) фильтровальную бумагу осторожно снимают с препарата и на мазок на 30 секунд наносится 5 – 10% раствор серной или соляной кислоты приготовленный на 95% этиловом спирте.
4. Через 30 секунд препарат осторожно промывают струей холодной воды и дополнительно докрашивают раствором метиленовой сини.
Механизм окраски кислотоустойчивых микроорганизмов по Циль – Нильсену можно объяснить следующим образом: во время нагревания препарата воск, входящий в состав оболочки, размягчается, и благодаря этому краситель проникает в бактериальную клетку. Остывая, этот воск удерживает краситель, поэтому спирт, с кислотой вымывают краситель только из клеток, не обладающих кислотоустойчивостью. При дополнительной окраске метиленовым синим окрашиваются обесцвеченные клетки и на этом синем фоне будут отчетливо видны кислотоустойчивые бактерии, окрашенные в красный цвет.
Растворы для окраски по Циль – Нильсену:
1. Раствор А – основной фуксин – 0,3г, этилдовый спирт 95% — 10,0мл.
2. Раствор Б – фенол (расплавленные кристаллы) – 5,0г, дистиллированная вода – 95,о мл.
3. Раствор метиловой сини Леффлера или бриллиантовой зелени.
Растворы А и Б смешивают (карболовый фуксин). Смесь хорошо сохраняется.
В микроскопической практике при изучении мазков – отпечатков из органов, мазки из крови, при изучении спирохет, простейших, хламидий, культур тканей широко применяется еще один сложный метод окраски – окраска по Романовскому – Гимза.
Методика окраски по Романовскому – Гимза:
1. Препарат высушивается, фиксируется в жидком фиксаторе (метанол 3 – 5 минут).
2. Препарат высушивают и помещают в стаканчик с рабочим раствором красителя (экспозиция 20 25 минут при 37 градусах , концентрация раствора краски и экспозиция должны быть титрованы). Перекрашенный мазок дифференцируется этиловым спиртом (50 – 60 градусным), споласкивается осторожно водой, высушивается и микроскопируется.
Растворы красителей для окраски по Романовскому – Гимза:
1. Вариант А. Готовят раствор – 3,8г сухой краски, состоящей из смеси эозина и метиленовой сини, растворяют в 250 мл чистого метилового или этилового спирта. Раствор оставляют на несколько дней, часто взбалтывая для лучшего растворения краски. Затем добавляют 250 мл чистого глицерина и оставляют на 3 – 5 дней часто взбалтывая. Полученный раствор – краска Романовского – Гимза.
Перед употреблением краску оттитровывают в разведениях 1:1, 1:2, 1:3 и т.д., приготовленных на дистиллированной воде в течении 20 – 25 минут.
2. Вариант Б. Применяют окраску азур – эозином.
а) 1 г сухой краски Романовского – Гимза (азур и метиленовая синь) растворяют в одном литре дистиллированной воды.
б) 1 г эозина растворяют в одном литре дистиллированной воды.
Эти два раствора хранят отдельно в темном месте в стеклянных емкостях с притертыми пробками.
Для окрашивания препаратов ex tempore готовят рабочий раствор:
10 мл дистиллированной воды
4 мл раствора эозина
8 мл раствора краски Романовского
Необходимым условием для получения хорошей окраски препаратов является качество воды (рН воды должно быть нейтральным).
Источник
