Производство инсулина биотехнологическим способом

Биотехнологическое производство рекомбинантного инсулина. Экономические аспекты. Создание рекомбинантных белков «второго поколения» на примере инсулина

Nbsp;

Биообъекты как средства производства лекарственных, профилактических и диагностических средств. Классификация. Характеристика. Основные группы получаемых биологически активных веществ.

Центральным и обязательным элементом биотехнологического производства, создающим его специфику, является биообъект.

Биообъектом может быть целостный сохранивший жизнеспособность многоклеточный или одноклеточный организм. Им могут являться изолированные клетки многоклеточного организма, а также вирусы и выделенные из клеток мультиферментные комплексы, включенные в определенный метаболический процесс. Наконец, биообъектом может быть индивидуальный изолированный фермент.

Функция биообъекта – полный биосинтез целевого продукта, включающий обычно ряд последовательных ферментативных реакций или катализ лишь одной ферментативной реакции, которая имеет ключевое значение для получения целевого продукта. Биообъект, осуществляющий полный биосинтез целевого продукта называется продуцентом. Биообъект, являющийся индивидуальным ферментом или выполняющий функцию одной ферментативной реакции используемой биотехнологом – именуют промышленным биокатализатором.

Таким образом, к биообъектам относятся как макромолекулы, так микро- и макроорганизмы. В качестве макромолекул в промышленном производстве используются все известные классы ферментов, но наиболее часто — гидролазы и трансферазы. Доказано, что использование ферментов в производстве в иммобилизованном виде, то есть связанных с нерастворимым носителем, является наиболее рациональным, так как в этом случае обеспечивается многократность их применения и стандартность

повторяющихся производственных циклов.

В любом технологическом процессе в биотехнологии используют биообъекты (источники сырья или биохимических каталитических процессов).

Биообъект – автономная саморегулирующаяся система.

— макроорганизмы из животного и растительного мира.

— культуры клеток эукариот.

— информационные макромолекулы (ДНК или РНК).

— функциональные макромолекулы (ферменты, биокатализаторы).

— человек (донор того или иного полупродукта).

Выращивание клеток высших растений возможно в виде:

— каллуса – нароста недифференцируемой меристемы на поверхности питательной среды.

— в виде суспензии в жидких средах.

Выращивание клеток высших животных возможно:

— на твердых носителях.

— в виде суспензии в жидких средах.

Преимущества использования биомасс и каллуса:

— возможность получения сырья с заданными характеристиками (стандартизация).

— повышение выхода полу- и конечного продукта.

— сокращение сроков культивирования.

— возможность промышленного получения редких растений и биоматериалов (раувольфия, диаскорея, унгерния).

Все биообъекты (микрообъекты) относятся либо к прокариотам (сине-зеленые водоросли, бактерии, вирусы, бактериофаги), либо к эукариотам (простейшие, водоросли, грибы).

Способы использования биомассы:

— получение биомассы с последующим её использованием в качестве полупродукта или искомого ЛП.

— использование продуктов жизнедеятельности биообъектов (производство аминокислот, антибиотиков, полисахаридов, витаминов).

— использование биообъекта для биотрансформации веществ (витамин С).

— повышенная стабильность и устойчивость к воздействиям окружающей среды.

— возможность создания непрерывных или полунепрерывных технологических потоков.

— снижение затрат на выделение и очистку продуктов реакции.

В природе существует огромное число микроорганизмов, которые способны синтезировать продукты или осуществлять реакции, которые могут быть полезны для биотехнологии. Однако практическое применение нашли не более 100 видов микроорганизмов (бактерии, грибы, дрожжи, вирусы, водоросли).

Дрожжи широко используют в хлебопечении, пивоварении, виноделии, получении соков, кормового белка, питательных сред для выращивания бактерий и культур животных клеток. Из 500 известных видов дрожжей используется только несколько видов – Saccharomyces cerevisiae, Saccharamyces carlsbergencis, Saccharomyces uwarum.

Среди бактерий чаще всего применяют в биотехнологии представителей следующих родов: Acetobacter, которые превращают этанол в уксусную кислоту и уксусную кислоту в углекислый газ и воду; Bacillus – для получения ферментов (B. subtilis), средств защиты растений (В. thuringiensis); Clostridium – для сбраживания сахаров в ацетон, этанол, бутанол; псевдомонады – например, P. Denitrificans – для получения витамина В₁₂, Corynebacterium glutamatum – для получения аминокислот и др.

Для получения разнообразных антибиотиков в биотехнологии применяют актиномицеты (род Streptomyces), грибы рода Penicillium и др.

Многие микроорганизмы – бактерии, дрожжи, вирусы – используются в качестве реципиентов чужеродного генетического материала с целью получения рекомбинантных штаммов–продуцентов биотехнологической продукции. Получены рекомбинантные штаммы E. coli, продуцирующие интерфероны, инсулин, гормон роста, антигены вируса СПИДа; штаммы B. subtilis, вырабатывающие интерферон; штаммы дрожжей, продуцирующие интерлейкин–2, антиген вируса гепатита В; рекомбинантные вирусы осповакцины, синтезирующие антигены гепатита В, вируса бешенства, клещевого энцефалита и др.

Для получения вакцин и диагностических препаратов используют также патогенные микроорганизмы (брюшного тифа, коклюша, дифтерии, столбняка и др.).

Широкое применение в биотехнологии нашли культуры животных и растительных клеток. Известно, что строение, физиология и биотехнология животных и растительных клеток более сложные, чем у бактериальных клеток. Из культур животных и растительных клеток можно извлечь более широкий ассортимент продуктов сложной, цепной реакции, но процесс культивирования растительных и животных клеток более трудоемкий и дорогостоящий. Из культур тканей растений можно получать разнообразные соединения, используемые в медицине (алкалоиды, противовоспалительные вещества, противолейкозные и противоопухолевые, противобактериальные, сердечные и почечные средства, ферменты, витамины, опиаты и др.), сельском хозяйстве, химической и других отраслях промышленности. Животные клетки используют как для получения продукции, так и для выращивания в клетках вирусов с целью получения из них вакцин и диагностических препаратов.

Таким образом, в современном биотехнологическом производстве используют весьма широкий ассортимент биообъектов, классификация которых весьма сложна и наиболее рационально может быть выполнена на основе принципа их соразмерности. В таблице приведены биологические объекты, объединенные в 5 групп, причем, соразмерность в первых четырех имеет кратность в три порядка и только в пятой группе собраны биообъекты, отличающиеся по размерам от предшествующей (четвертой) группы всего на один порядок.

Биообъекты, используемые при биотехнологических способах производства лекарственных (диагностических, лечебных и профилактических) средств:

1.	Размер от 10 м до 1 см: человек, животные, растения-бионакопители сапонинов, алкалоидов и т.п.
2.	Размер от 1 см до 1 мм: гигантские водоросли, каллусные культуры меристемы, культуры тканей, культуры клеток.
3.	Размер от 1 мм до 1 мкм: клетки эукариот и прокариот в культуре, биопродуценты и биотрансформаторы.
4.	Размер от 1 мкм до 1 нм: бактериофаги, вирусы, липосомы.
5.	Размер менее 1 нм: ДНК, ферменты, макромолекулы-носители.

Требования, предъявляемые к биообъектам для реализации биотехнологических процессов: чистота, высокая скорость размножения клеток и репродукции вирусных частиц, активность и стабильность биомолекул или биосистем.

Биотехнологическое производство рекомбинантного инсулина. Экономические аспекты. Создание рекомбинантных белков «второго поколения» на примере инсулина.

Биотехнология рекомбинантных белков охватывает производство:

• вакцин (против гепатита В0

• пептидных факторов роста тканей

• рекомбинантных интерферонов (они представляют неспецифическую

защиту клетки от вирусов и злокачественных образований)

На первом месте среди них по значению стоит рекомбинантный инсулин,

составляющий около 30% от всего рынка рекомбинантной продукции.

В проблеме производства рекомбинантных белков очень важно, чтобы

используемые в этом случае микроорганизмы, в которые вносят чужеродные

гены, удовлетворяли бы следующим свойствам:

1. Метаболизм микроорганизма должен быть хорошо изучен, поэтому в

качестве продуцентов рекомбинантных белков используют именно

такие микроорганизмы: это Escherichia coli, Bacillus subtilis,

2. Микроорганизмы должны быть не патогенны.

3. Микроорганизмы должны хорошо и интенсивно размножаться в

4. Желательно, чтобы микроорганизм был способен выделять

секретируемый им чужеродный белок в среду. Это можно достичь, если

ввести в клетку реципиента ген, который синтезирует рекомбинантный

белок с дополнительной аминокислотной последовательностью,

состоящий из гидрофобных аминокислот. Роль гидрофобных

аминокислот состоит в том, что они перетаскивают белок в липидную

мембрану, в которой с помощью определенных ферментов (сигнальных

протеаз), гидрофобная последовательность отщепляется и образуется

нужный целевой продукт – это рекомбинантный белок, выходящий в

среду.5. Должна быть возможность сделать клетки микроорганизмов

компетентными для того, чтобы их клеточная стенка была бы

проницаема для плазмид.

Промышленное производство рекомбинантного инсулина

Инсулин, как вы знаете, является регулятором углеводного обмена. В

организме человека инсулин синтезируется в бетаклетках островков Лангерганса

поджелудочной железы. При отсутствии или недостатке его синтеза развивается

такое заболевание как сахарный диабет (инсулинозависимый диабет – 1 типа).

При сахарном диабете повышается содержание глюкозы в крови и развиваются

патологические процессы. Диабет II типа (инсулинозависимый) возникает при

дефектах в структуре рецепторов, отвечающих за проникновение глюкозы в

клетку. Все эти сведения касаются этиологии такого заболевания как сахарный

Следующий вопрос, который надо рассмотреть, это структура инсулина.

Итак, инсулин это пептидный гормон, состоящий из двух пептидных цепей:

А-цепь состоит из 21 аминокислотных остатков.

В-цепь состоит из 30 аминокислотных остатков

Эти две цепи связаны бисульфидными SS связями, которые обеспечивают

пространственную структуру белка инсулина.

При синтезе инсулина в поджелудочной железе вначале образуется

предшественник инсулина, так называемый проинсулин. Этот проинсулин

состоит из А-цепи, В-цепи и С-пептида, состоящего из 35 аминокислотных

остатков.С-пептид отщепляется под действием карбоксипептидазы и трипсина и

проинсулин переходит в активный инсулин.

Есть разные способы получения инсулина. Мы остановимся на получении

инсулина биосинтетическим путем, с точки зрения преимущества этого метода.

Итак, преимущества получения инсулина биосинтетическим путем.

До внедрения в промышленность метода получения инсулина с

использованием рекомбинантных микроорганизмов существовал только один

способ получения инсулина – из поджелудочных желез крупного рогатого скота

и свиней. Инсулин, получаемый из поджелудочной железы крупного рогатого

скота отличается от инсулина человека на 3 аминокислотных остатка, а инсулин,

получаемый из железы свиньи, только на один аминокислотный остаток, то есть

он ближе к человеческому инсулину. Тем не менее, при введении белков,

отличающихся по структуре от белков человека даже в таком незначительном

выражении, возможно возникновение аллергических реакций. Такой инсулин,

как чужеродный белок, также может и инактивироваться в крови

Кроме того, для получения 1 килограмма инсулина требуется 35 тысяч голов

свиней (если известно, что годовая потребность в инсулине -1 тонна препарата).

С другой стороны, биосинтетическим путем можно получить такое же

количесвто инсулина, проведя биосинтез в 25 кубовом ферментере, используя

рекомбинантный микроорганизм Escherichia coli.

Биосинтетический метод получения инсулина стал применяться в начале 80-х

Остановимся на схеме получения рекомбинантного инсулина (фирма Eli Lilli-

Эли-Лилли, Соединенные Штаты Америки):

1. этап Путем химического синтеза были созданы последовательности

нуклеотидов, которые кодируют образование А и В цепей, то есть были

созданы синтетические гены.

2. 11 этап. Каждый из синтетических генов вводят в плазмиды (в одну

плазмиду вводят ген, синтезирующий цепь А, в другую плазмиду вводят

ген, синтезирующий цепь В).

3. 111 этап. Вводят ген, кодирующий образование фермента

бетагалактозидазы. Этот ген включают в каждую плазмиду для того,

чтобы добиться бурной репликации плазмид.

4. 1У этап. Вводят плазмиды в клетку Escherichia coli – кишечной палочки

и получают две культуры продуцента, одна культура синтезирует А-цепь,

5. V этап. Помещают две культуры в ферментер. В среду добавляют

галактозу, которая индуцирует образование фермента

бетагалактозидазы. При этом плазмиды активно реплицируются,

образуя много копий плазмид и, следовательно, много генов,

синтезирующих А и В цепи.

6. VI этап. Клетки лизируют, выделяют А и В цепи, которые связаны с

бетагалактозидазой. Все это обрабатывают бромцианом и отщепляют

А и В-цепи от бетагалактозидазы. Затем производят дальнейшую

очистку и выделение А и В цепей.

7. VII этап. Окисляют остатки цистеина, связывают и получают

Инсулин, полученный этим путем является человеческим инсулином по своей

структуре. Применение современных методов очистки исключает наличие в

инсулине эндотоксинов и пирогенных примесей.

Дата добавления: 2018-04-04 ; просмотров: 3050 ; Мы поможем в написании вашей работы!

Источник

Основоположники отечественной биофармацевтики: опытное биотехнологическое производство ИБХ

Конвейер медицинского биотеха: ферментёры (основные «сосуды» для производства фармакологических субстанций) разного объёма.

Автор

Редакторы

В связи с последними событиями у всех на слуху слово «импортозамещение». Его применяют к месту и не к месту, под него выделяют огромное финансирование. Но мало кто помнит тех, кто ещё 10 лет назад были первопроходцами в деле реального создания конкурентоспособных технологий. Одним из таких центров является Опытное биотехнологическое производство ИБХ РАН, где в 2003 году начали выпуск генно-инженерного инсулина человека по первой в России технологии полного цикла, за что работавшие над этим сотрудники в 2006 году были удостоены премии Правительства РФ в области науки и техники. И с тех пор в ОБП был разработан целый ряд технологий производства биологических препаратов. Каких и в чём вообще заключается разработка — читайте в этой статье.

Обратите внимание

Нельзя объять необъятное. В рубрике «Места» мы рассказываем только о внутренней жизни лабораторий и их научной работе. За кадром остаются внешние трудности и конфликты, конкуренция между лабами, сложные политические решения и всё такое прочее.

Обычно выделяют четыре «цветных» направления биотехнологии: «красная», «синяя», «белая» и «зелёная». «Белая» — промышленная — является одной из самых старых отраслей. Она занимается крупнотоннажным производством различных химических соединений, применяемых в быту: витаминов, спирта и т.д. «Синяя» — морская — занимается приложением биотехнологии к проблемам рационального использования ресурсов океанов. К весьма перспективным направлениям относят «зелёную» отрасль — растительную, в которой генетически модифицируют деревья и сельхозкультуры, а также разрабатывают методы переработки растительного сырья и отходов в полезную для промышленности продукцию. В этом она близка «белой» и по сути является её развитием на более высоком уровне. Но больше всего развито «красное» направление, в котором создаётся продукция для медицинского применения, в основном — биофармацевтические препараты.

Страницы истории

Начало становлению медицинской биотехнологии было положено давно, ещё в начале 70-х годов прошлого века с изобретения технологии рекомбинантной ДНК. А уже в 1982 году был зарегистрирован первый препарат, полученный таким способом — инсулин. В Советском Союзе понимали перспективы этого нового направления, и по настоянию академика Ю.А. Овчинникова, директора Института биоорганической химии, в открытом в 1984 году новом здании института целых два корпуса было выделено под комплексную опытную установку. Основной её задачей являлась разработка технологий получения фармпрепаратов, в особенности биотехнологической природы. Оснащение для тех лет было вполне на мировом уровне, однако перестройка и развал Советского Союза наложили негативный отпечаток — в 90-е годы опытная установка стала не нужна, и большинство специалистов ушло.

Технология рекомбинантной ДНК

Рекомбинантная ДНК — ДНК, полученная лабораторными методами генетической рекомбинации. Таким способом можно создавать последовательности ДНК, не встречающиеся в природе. Соответственно организм, обладающий такой ДНК, будет обладать уникальными свойствами, которых нельзя достичь селекцией.

Возрождение началось в 2000-х в связи с возрастающим интересом государства к созданию импортозамещающих фармпроизводств; тогда же сформировался чёткий фокус на разработку технологий получения препаратов на основе рекомбинантной ДНК, и, соответственно, название подразделения было изменено на «Опытное биотехнологическое производство» (ОБП). Важной вехой на этом пути стало создание технологии получения инсулина и первого в России производства полного цикла этого препарата, которое в декабре 2003 открыл мэр Москвы Юрий Лужков (рис. 1). Главное, чего удалось в ходе этого добиться, — переоснащение производства для соответствия современным стандартам GMP, что позволяет производить небольшие партии биопрепаратов для проведения клинических исследований и даже для коммерческой реализации. ОБП пока далеко до роботизированных производств будущего, но в целом уровень оснащения весьма неплох:

• несколько ферментёров рабочими объёмами от 20 до 2000 л;
• лабораторные биореакторы объёмом 2 и 7,5 л;
• аналитические и препаративные хроматографы;
• промышленные парогенератор и высокотемпературные стерилизаторы;
• лиофильные сушки различного масштаба;
• планшетный флюориметр-люминометр;
• другое оборудование, необходимое для производства и контроля качества конечного продукта.

Рисунок 1. Прикладная наука не остается без внимания «верхушки». Слева: Посещение производства в ИБХ РАН мэром Москвы Ю.М. Лужковым. Справа: Научный руководитель производства академик А.И. Мирошников рассказывает о производстве В.В. Путину в рамках проведения в ИБХ РАН Совета по науке и технологии в феврале 2004 г.

GMP — good manufacturing practice, надлежащая производственная практика. Основной смысл такого подхода заключается в девизе «Всё, что не записано — не существует». Т.е. все, даже самые простейшие действия вроде запуска стерилизации и включения УФ-ламп, должны чётко протоколироваться. А по каждой серии препарата необходимо составлять досье, в которое включаются все протоколы, составленные в ходе её производства. Кроме того, этот подход регламентирует и техническую составляющую производства. Исповедуемый некоторыми прапорщиками принцип «сюда можно поставить шлагбаум или грамотного офицера» здесь неприемлем — нужен именно шлагбаум.

Вообще, к биологическим препаратам относят соединения, полученные из биологических источников, такие как полисахариды, нуклеиновые кислоты и наиболее часто белки и пептиды, представляющие собой цепочки аминокислот. Получают последние при помощи технологии рекомбинантной ДНК из различных клеток или микроорганизмов. Именно на создание подобных биопрепаратов и ориентировано опытное производство ИБХ. Так, на нашей площадке были созданы технологии получения инсулина, гормона роста, гранулоцит-колонийстимулирующего фактора, рекомбинантного гистона H1.3 (ОНКОГИСТа), а также дисахарида (фрагмента клеточной стенки Micrococcus lyzodeikticus) — полупродукта в производстве иммуномодулятора «Ликопид». Все эти препараты, кроме ОНКОГИСТа, прошедшего пока лишь вторую стадию клинических исследований, дошли до серийного производства и реализации. И сейчас ведётся много интересных работ с крупными российскими фармкопаниями, но это, увы, конфиденциальная информация. Также ОБП активно взаимодействует с другими структурными подразделениями института, решая задачи, связанные с масштабированием технологических процессов и производством стерильных лекарственных препаратов для клинических и доклинических исследований.

Инсулиновая история

Краеугольным камнем, вокруг которого в начале этого века вновь было выстроено ОБП, стала технология получения генно-инженерного инсулина полного цикла, т.е. начиная от сырья, из которого делают питательные среды, заканчивая готовым лекарством в упаковке. До сих пор в России крайне распространены фармпроизводства, на которых из импортной субстанции (основного действующего средства) делают готовые формы путём добавления вспомогательных веществ и фасовки их по флаконам или картриджам. При этом основная высокотехнологичная и наукоёмкая стадия осуществляется за рубежом. В 1996 году, когда впервые заговорили о необходимости создания отечественного производства инсулина, в ИБХ практически на голом энтузиазме (состояние дел на тот момент неплохо описано в статье «Несахарное производство» [1]) начали разработку технологии. Это привело к заключению в 2000 году соглашения с правительством Москвы о выпуске инсулина и первым его поставкам потребителям в феврале 2004. С тех пор опытное производство стало одним из основных поставщиков инсулина для нужд столицы.

Нельзя сказать, что такое положение вещей было нормальным, так как основная задача ОБП заключается больше в разработке технологий получения препаратов и пилотном производстве их для нужд доклинических и клинических исследований. Именно поэтому со временем встал вопрос о строительстве крупномасштабного производства, которое бы могло обеспечивать продукцией всю Россию. Была даже создана компания «Биоран» и разработан проект завода в г. Пущино, но до настоящего времени он не реализован.

Новое время

С тех пор многое поменялось. Российский сектор биофармацевтики пополнился новыми игроками, такими как «Биокад», «Р-фарм», «Генериум», «Фармстандарт». Если раньше ИБХ был практически единственным местом, где можно было производить биологические препараты, то сейчас это уже не так. Появляются новые производства и расширяются уже существующие, мощностей становится всё больше и больше. В такой реальности становится уже бессмысленно соревноваться с «большой фармой», имея оборудование, заточенное в большей степени под прикладные разработки и небольшие партии. И ОБП возвращается к истокам — созданию технологий производства биофармацевтических препаратов и вывод их на рынок при участии промышленных партнёров, которые заинтересованы в дальнейшем крупномасштабном производстве и реализации препаратов. Здесь образуется взаимовыгодное сотрудничество, когда каждый занимается своим делом: бизнес — промышленным производством, маркетингом и продажами, а учёные — фундаментальными и прикладными разработками.

Задачу, стоящую при таком положении дел перед опытным производством, можно разделить на две:

• технологическую — разработку метода получения медпрепарата;
• испытательную — доказательство качества, безопасности и эффективности получаемого лекарства.

Как устроено биотехнологическое производство

Рисунок 2. Подготовка клеток для банка в музее культур.

Первым этапом на стадии разработки способа получения биопрепарата является создание его продуцента, т.е. биологического объекта (микроорганизма, дрожжей, клеток млекопитающих или даже целого животного), способного производить нужное соединение в больших объёмах . Основным здесь является создание вектора — молекулы ДНК, которая кодирует нужный нам продукт и заставляет клетку-носитель производить его в количествах значительно бóльших, чем все остальные нужные ей белки [2]. Потом данный вектор интегрируется в клетки, и получается клеточная линия или штамм, который закладывается на хранение в музей культур — один из участков ОБП. Все остальные работы по созданию культуры выполняются Лабораторией биотехнологии ИБХ РАН.

Осенью на «биомолекуле» мы опубликовали статью студентки Пермского государственного национального исследовательского университета «Прикладная биотехнология и молекулярная микробиология. Практическое руководство для студентов, или как запатентовать биопрепарат» [3]. И хотя речь в ней не о разработке препарата для крупной промышленности, статья даёт представление обо всех этапах получения патента на определённый штамм микроорганизма, созданный биотехнологическим путём. — Ред.

Для задач непосредственно производства создаётся специальный рабочий банк из сотен ампул, каждая из которых предназначена для получения отдельной партии препарата. Этот банк также закладывается на хранение в музей культур (рис. 2).

Далее проводится разработка основной биотехнологической стадии — культивирования клеток. В её ходе выбирают оптимальный состав среды, на которой выращивают клетки, режим культивирования (непрерывный или периодический), его аппаратурное оформление и параметры (pH, температура, скорость подачи и состав подпитки). Основная цель, преследуемая на этом этапе, — повышение объёмной продуктивности, что позволяет получать на оборудовании небольшого масштаба большое количество продукта, достаточное для решения испытательной задачи. Кроме того, за счёт этого снижается и себестоимость получения продукта — в десятки, а то и сотни раз от первоначального лабораторного способа. Решением всех этих задач занимается цех экспериментальной ферментации опытного производства (рис. 3).

Рисунок 3. Контроль за ходом процесса в пилотном ферментёре рабочим объёмом 20 л в цехе экспериментальной ферментации.

В конце культивирования получается культуральная жидкость, содержащая помимо отработанной среды и биомассы клеток ещё и продукт, который необходимо выделить. В зависимости от выбранного вида клеток, продукт может либо выделяться в среду, либо синтезироваться внутри клеток, иногда в виде телец включения (агрегатов из белков). А если смотреть шире, то в случае клеточной или тканевой терапии продуктом будут сами клетки. При выделении сначала отделяют клетки (биомассу) от отработанной среды. Если продукт содержится в среде, то в работу идёт она, а клетки направляют на дезактивацию (в отходы).

Если же продукт получается в тельцах включения, то дезактивируют среду, а клетки разрушают, выделяют тельца и растворяют (солюбилизируют) их. Полученный раствор помимо продукта содержит ещё и белки, выделяемые клетками в среду или синтезирующиеся в виде телец включения, так что для достижения «фармацевтической» степени чистоты требуется несколько ступеней очистки. Чаще всего это несколько (от двух) различных типов хроматографических процессов: ионообменного, гидрофобного, обращённо-фазового, гель-фильтрационного (рис. 4). Для каждого продукта их последовательность и количество будут разные и требуют подбора на основе литературных данных, опыта и экспериментов. Кроме того, для каждого процесса нужно выбирать буферные растворы и стратегию их подачи на хроматографическую колонну. Конечная цель — это продукт высочайшей степени чистоты: иногда более 99,9%, а это означает, что все возможные примеси могут составлять не более 0,1% от массы активной фармацевтической субстанции — результата этой стадии. Очисткой и разработкой её стратегии в рамках опытного биотехнологического производства занимается цех выделения и очистки.

Рисунок 4. Производственное оборудование. Слева: Препаративный хроматограф и буферные растворы, применяемые для крупномасштабной очистки биопрепаратов. Справа: Кристаллизация инсулина в цехе выделения и очистки.

Однако для проведения доклинических и клинических исследований субстанции недостаточно, необходимо ещё изготовить готовую лекарственную форму (ГЛФ) — добавить вспомогательные вещества и упаковать во флаконы или картриджи для шприц-ручек. И если способ упаковки в основном зависит от аппаратного оформления конкретного производства, то вспомогательные вещества в большей степени зависят от препарата и для каждого подбираются отдельно. Хотя здесь не требуется сложных статистических методов и большого количества экспериментов, процесс получения ГЛФ довольно трудоёмкий, и им также занимается отдельное подразделение — цех готовых лекарственных форм (рис. 5).

Немного о терминах

Когда говорят о фармпрепаратах, часто произносят два термина: активная фармацевтическая субстанция (АФС) и готовая лекарственная форма (ГЛФ). АФС или просто субстанция — по сути, главное действующее вещество, которое и отвечает за основной эффект препарата. ГЛФ или готовая форма — это АФС вместе со вспомогательными веществами и в определённом виде: таблетки, капсулы, раствора во флаконе или картридже.

Рисунок 5. Работа в «чистой» зоне. Слева: Разлив готовой формы биопрепарата в цехе готовых лекарственных форм. Справа: Контроль процесса разлива в цехе готовых лекарственных форм. Эффектный комбинезон совсем не для того, чтобы смотреться круто. Конечную форму производят в стерильных условиях в крайне чистой среде. Чтобы в окружающую среду не попадало лишних частиц, все части тела изолируются, а вся косметика перед входом в чистую зону смывается. Работать в таких условиях весьма непросто — несколько часов, и ты уже готов одним махом опустошить полуторалитровую бутылку воды. Не говоря уже о том, что всё это время ты будешь мечтать о дýше.

Казалось бы, дойдя уже до готовой формы, можно переходить непосредственно к доклиническим исследованиям, ведь именно это чаще всего является целью производства лекарственных веществ на мощностях ОБП. Однако прежде необходимо проанализировать полученный продукт, чтобы убедиться в соответствии его характеристик ожидаемым и заложить конкретные параметры в регистрационное досье, которое необходимо для регистрации препарата в регуляторных органах. На данном этапе важно показать, что количество примесей не превышает разрешённого, а полученное основное действующее вещество имеет структуру и активность, соответствующие ожидаемым. Спектр применяемых здесь методов довольно широк: вестерн-блот, изоэлектрофокусировка, хроматография, ЛАЛ-тест, масс-спектрометрия, имунноферментный анализ, ИК-спектроскопия и многие другие. Выбор конкретных методов зависит в первую очередь от природы биопрепарата и для каждого из них во многом индивидуален. Хотя есть и стандартные общие методы вроде электрофореза в полиакриламидном геле или изоэлектрофокусировки. В большинстве же методов, пусть они и являются стандартными в части общей последовательности действий, параметры проведения нуждаются в отдельной проработке для каждой готовой формы, так как вспомогательные вещества иногда влияют на аналитические характеристики основного.

Описанный этап является крайне важным, так как даёт оценку качественным характеристикам препарата и их постоянству от партии к партии. Технология — это не только получение какого-то конкретного продукта и достижение высокой эффективности процесса. Это ещё и умение стабильно обеспечивать высокое качество продукта. Помимо контроля конечного продукта осуществляют промежуточный контроль критических точек производственного процесса, чтобы как можно раньше выявить отклонения, способные повлиять на качество конечного препарата, и минимизировать время и затраты на их устранение. На опытном биотехнологическом производстве за этот этап отвечает отдел контроля качества при участии контрольно-аналитической лаборатории (рис. 6).

Рисунок 6. Важен контроль! Слева: Контрольно-аналитическая лаборатория — все в сборе. Справа: Микробиологический контроль образцов с производства в отделе контроля качества.

Разведка боем

Далее проводятся доклинические и три стадии клинических исследований, необходимые для подтверждения безопасности и эффективности препарата. При этом решение о допуске его на рынок принимается на основе баланса между оказываемым им полезным эффектом и отрицательными побочными эффектами. Для того чтобы начать испытания на людях, нужно сначала продемонстрировать действие препарата на лабораторных животных. При этом необходимо, чтобы проводилось исследование уже готовой лекарственной формы, полностью соответствующей той, что будет в дальнейшем испытываться на людях. Основную часть работы выполняет Лаборатория биологических испытаний в Филиале ИБХ в Пущино, имеющая необходимую аккредитацию. Задача производства на этом этапе — наработка достаточного количества доз препарата. В целом, здесь задействованы примерно те же подразделения опытного производства, за исключением цеха промышленной ферментации, который перенимает технологию у цеха экспериментальной ферментации и методично её воспроизводит от партии к партии (рис. 7). Получаемые сотни литров культуральной жидкости передаются в цех выделения и очистки, где на больших препаративных хроматографических колоннах выделяют субстанцию и отправляют её в цех готовых лекарственных форм, откуда уже выходят флаконы, которые и применяются в исследованиях.

Рисунок 7. Дезинтегратор в цехе промышленной ферментации для разрушения клеток по окончании процесса.

В случае успешного завершения испытаний по результатам составляется отчёт, который совместно с другими документами на препарат подаётся в орган, отвечающий за регистрацию лекарственных средств (в России — Министерство здравоохранения). Там документы рассматривают и в случае доказанной эффективности выдают разрешение на проведение клинических исследований на людях. Здесь уже в работу вступают медицинские учреждения, которые проводят испытания препарата на добровольцах по утверждённому уполномоченным органом плану.

Кадры решают всё

Аппаратурное обеспечение — необходимый, но далеко не самый главный элемент любого успешно функционирующего центра разработок, в том числе и опытного производства. Самое главное — сотрудники, которые благодаря своим знаниям и навыкам воплощают все планы в реальность. Как и в любом другом виде деятельности, эффективная работа невозможна без должной мотивации. В чём мотивация при занятии прикладными исследованиями?

Занимаясь биотехнологией, ты вынужден постоянно знакомиться с новыми передовыми научными достижениями в разных областях: молекулярной биологии, синтетической биологии, химическом приборостроении, IT и многих других. При правильном сочетании полученных знаний и рождается эффективная технология. Это трудный, кропотливый, но очень увлекательный процесс.

Но самые сильные, ни с чем, пожалуй, несравнимые чувства испытываешь, когда, используя инструментарий, созданный природой в ходе эволюции и модифицированный с помощью технологии рекомбинантной ДНК, удается получить конкретный лекарственный препарат, который, возможно, кому-то облегчит состояние, а кого-то и спасет. Это просто круто!

Сотрудник группы эукариотических продуцентов Даниил Павленко раскрывает этот вопрос несколько иначе:

Меня всегда привлекало ориентированное на практику творчество. Создание чего-то, что не просто работает, но ещё и делает это эффективно, т.е. с затратой минимума ресурсов, дарит массу положительных эмоций. Биотех хорош тем, что здесь простор для творчества просто огромен: можно заниматься разработкой сред для выращивания культур, можно основательно вложиться в разработку классного вектора, можно подбирать оптимальные настройки аппаратного обеспечения, можно менять метаболизм клеток-продуцентов, а уж какой простор открывается, если заняться созданием уникальных аппаратов и технологических линий. Впечатляют и возможные результаты: комбинация всех подходов может привести к понижению себестоимости производства на порядок, а то и два. Так, мы в своей технологии получения фолликул-стимулирующего гормона определенным изменением достигли увеличения продуктивности, а, следовательно, и уменьшения себестоимости, в 3,5 раза. И понимаем, куда надо двигаться, чтобы повысить продуктивность ещё раз в 5–10. Не удивительно, что от этого всего захватывает дух.

За науку

В прикладных исследованиях научные публикации — дело пусть и не десятое, но явно отходящее на второй план. Основными результатами деятельности являются патенты, ноу-хау, регламенты на конкретные препараты. Статьи же по прикладным исследованиям обычно публикуются в специализированных журналах с соответствующей тематикой, импакт-фактор у которых обычно не переваливает за 3. С фундаментальными исследованиями здесь конкурировать не выйдет, но это не значит, что на опытном производстве науки нет совсем. Например, коллективом ОБП были обнаружены такие явления как антимикробное действие шиконина [4] или эффект вытеснения [5] при очистке генно-инженерного инсулина человека. Хотя большинство статей посвящено разработке отдельных производственных стадий, методов анализа или целых технологий [6–8].

Не только работа

Несмотря на серьёзность задач и практическую ориентированность, сотрудники ОБП — живые люди и не прочь поболтать «за жизнь». Собираются обычно пятничными вечерами в кабинете начальника производства Василия Степаненко, который, понимая, что задуманное на остаток дня ему завершить уже не дадут, также включается в беседу. Хотя и тут всё начинается с обсуждения текущих дел и задач и, перетекая в обсуждение стратегии и состояния дел в России и мире, в итоге выходит на разговор о философских и мировоззренческих вопросах.

Обучение без отрыва от производства

Несмотря на высокий уровень ответственности, на ОБП есть успешный опыт выполнения работ студентами и аспирантами с защитой ими магистерских и кандидатских диссертаций. В основном на базе ОБП выполнялись работы вроде создания схем отдельных этапов в производстве какого-либо препарата, подбора условий проведения процессов с целью увеличения выхода, разработки и валидации аналитических методик. Но помимо задач, связанных непосредственно с разработкой технологий создания биологических препаратов, позиционирование производства как опытного подразумевает и возможность отработки различных технических решений. Так, сейчас начато сотрудничество с Университетом машиностроения по направлению разработки различных приборов и аппаратов, применяемых в биотехнологическом производстве.

При этом идей, куда можно двигаться, и каким будет будущее «красной» биотехнологии, предостаточно. Если смотреть глобально, то есть несколько возможных направлений:

• автоматизированное производство, работающее на основе непрерывных технологических процессов (в противовес существующим периодическим);
• использование технологий 3D-печати (т.н. «аддитивные») при прототипировании биотехнологического оборудования;
• бесклеточная система для получения широкого спектра белков, включающего многосубъединичные и белки с обширными пост-трансляционными модификациями [9];
• платформа для быстрого создания технологий производства биопрепаратов на основе стандартных решений синтетической биологии — «биоинженерных» блоков [10].

В каком направлении всё двинется? Пока сказать сложно, но во многом это будет зависеть от молодёжи, полной прорывных идей и мотивации к созиданию нового.

Источник