Методы определения содержания жиров (липидов) физико-химическими методами
Липиды — важные ингредиенты пищи человека, так как обладают высокой энергетической ценностью и являются источником пластического материала для тканей организма. Отдельные компоненты жира — некоторые жирные кислоты, фосфатиды, стеролы, жирорастворимые витамины — выполняют важные биологические функции в организме. Липиды — вещества растительного и животного происхождения, растворимые в органических растворителях и малорастворимые в воде, содержащие в молекуле высшие алкильные или ацильные радикалы.
При количественном определении липидов в исследуемом объекте предусматривается извлечение из него глицеридов и сопутствующих им веществ (пигментов, витаминов, свободных жирных кислот, фосфатидов и др.).
Существующие методы определения содержания жира в различных видах сырья и продуктов можно условно подразделить на две группы — одноступенчатые и двухступенчатые.
Одноступенчатые методы, основанные на использовании ультразвука, ядерно-магнитного резонанса, фотометрии и инфракрасных лучей, позволяют проводить количественное определение жира непосредственно в исследуемом объекте. Однако для этого требуется сложное и дорогостоящее оборудование, а применение некоторых из них (например, метод ядерно-магнитного резонанса) рекомендуется в случае невозможности использования какого-либо другого метода для установления количества определяемого вещества в объекте.
Большинство физико-химических методов (экстракционно-весовые, рефрактометрические и др.), применяемых для количественного определения жира, относятся ко второй группе. Характерной особенностью их является двухступенчатость — извлечение жира из объекта и количественное определение его. Для извлечения жира используются различные органические растворители — бензин, петролейный эфир. серный эфир, ацетон, хлороформ, монобром, монохлорнафталин, трикрезилортофосфат и др. Следует иметь в виду. что гидрофобные растворители (петролейный эфир, бензин и др.) извлекают вместе с глицеридами несколько меньше сопутствующих им веществ. Причем выделение их происходит селективно. Более быстро извлекаются глицериды, и медленнее — фосфатиды, свободные жирные кислоты и продукты окисления. В связи с этим, при применении гидрофобного растворителя процесс извлечения жира проходит длительно (2. 3 сут). Для ускорения и более полного выделения глицеридов и сопутствующих им веществ из анализируемого объекта рекомендуется использовать гидрофильные растворители (метиловый, этиловый эфиры и др.) или смесь гидрофобных и гидрофильных растворителей (бинарные растворители).
Некоторые наиболее часто применяемые методы определения содержания жира в рыбе, нерыбных объектах промысла и вырабатываемых из них продуктах рассматриваются ниже.
Метод определения содержания жира по Сокслету (арбитражный метод). Определение содержания жира проводится путем взвешивания его после экстракции из сухой навески в аппарате Сокслета.
Навеску средней пробы исследуемого продукта около 5. 10 г, взвешенную с погрешностью не более 0,001 г, следует поместить в фарфоровую ступку. Туда же добавить двойное-тройное по массе количество безводного сернокислого (или фосфорнокислого) натрия и смесь хорошо растереть пестиком. Обезвоженный продукт количественно перенести в пакет или патрон из фильтровальной бумаги и поместить в эксикатор аппарата Сокслета. Ступку протереть ватой, смоченной серным эфиром, которую затем присоединить к сухой навеске. К экстрактору присоединить предварительно высушенную при 105°С и взвешенную колбу и налить эфир с таким расчетом, чтобы количество его в 1,5 раза превышало объем экстрактора. Экстрактор с помощью пришлифованной пробки соединить с холодильником. До начала нагревания через холодильник начать пропускать воду и затем слабо нагреть колбу на водяной бане. Экстрагирование жира проводить в течение 10. 12 ч. Интенсивность нагревания должна быть такой, чтобы в течение 1 ч было не менее 5. 6 и не более 8. 10 сливании эфира.
Полноту выделения жира из навески анализируемого объекта следует проверять следующим образом. На чистое, обезжиренное стекло нанести каплю мисцеллы (растворителя). При полном выделении жира на стекле после испарения растворителя не должно появляться жирное пятно.
При перерыве в работе для ускорения экстракции жира необходимо оставить эфир в экстракции в таком количестве, чтобы патрон с навеской был погружен в него. После окончания экстрагирования жира эфир из колбы отогнать, а затем высушить колбу с жиром в сушильном шкафу при температуре 50. 60°С (30 мин). Процесс лучше проводить в атмосфере углекислоты. Количество жира х (в %) рассчитывается по формуле:
где т2 — масса колбы с жиром после высушивания, г; т, — масса пустой колбы, г; т — масса навески исследуемого материала, г.
Расхождение между параллельными определениями не должно превышать 0,3%.
Метод определения содержания жира по обезжиренному остатку (стандартный метод). Количество жира в продукте определяется по уменьшению массы сухой навески продукта после экстракции растворителем. Навеску исследуемого объекта в количестве 2. 5 г, взвешенную с погрешностью 0,001 г, следует высушить в сушильном шкафу при температуре 100. 105°С и перенести в пакет из фильтровальной бумаги размером 8х9 см. Стенки бюксы протереть небольшим количеством ваты, смоченной в эфире. Вату вместе с навеской поместить в пакет из фильтровальной бумаги. Пакет с навеской вложить во второй пакет размером 9 х 10 см так, чтобы линии загиба пакетов не совпадали, и перевязать их ниткой. Наружный пакет пронумеровать простым графитовым карандашом, поместить в ту же бюксу, в которой ранее высушивалась навеска, и поставить в сушильный шкаф. Высушить до постоянной массы при температуре 100. 105°С. Можно сушить навеску непосредственно в пакете. Высушенный пакет с навеской должен быть помещен в экстрактор аппарата Сокслета. В один аппарат можно помещать несколько пакетов при условии, что все они полностью погружены в эфир и хорошо омываются им. Продолжительность экстрагирования 10. 12 ч. Окончание процесса устанавливается следующим образом. Каплю раствора (мисцеллы), вытекающего из экстрактора аппарата, следует нанести на часовое стекло. При полном извлечении жира из навески на стекле после испарения растворителя не должно быть жирного пятна. Пакеты с обезжиренной навеской перенести в ту же бюксу и выдержать в вытяжном шкафу 20. 30 мин для удаления эфира, а затем высушить в шкафу при температуре 100..105°С до постоянной массы. Длительность процесса от 1 до 3 ч.
Содержание жира Х (в %) рассчитывается по формуле:
где т2 — масса высушенных бюксы, пакета и навески продукта до экстракции, г; m1 — масса высушенных бюксы, пакета и навески продукта после экстракции жира.
Расхождение между параллельными определениями не должно превышать 0,5%.
Выделение индивидуальных липидов из исходного материала обычно включает несколько этапов. Первым этапом является разрушение ткани путем измельчения сухого сырья, следующим – экстракция нейтральных липидов, затем экстракция суммы фосфо- и гликолипидов с последующим фракционированием и выделением чистых веществ. Полноту извлечения липидов обеспечивает максимальное размельчение материала. Полярные растворители, такие, как метанол и этанол, которые разрушают водородные связи и ослабляют электростатическое взаимодействие липидов с белками, наиболее эффективно экстрагируют липиды. Использование спиртов для экстракции фосфолипидов удобно и тем, что они дезактивируют большинство липолитических ферментов, которые в активной форме вызывают деградацию липидов [4, 6]. Длительность экстракции и полноту экстрагирования, а также способ и условия проведения экстракции определяют в каждом конкретном случае.
На практике для выделения липидов чаще всего используют два основных рутинных метода экстракции, позволяющих количественно извлекать липиды практически всех классов из самой ткани и ее фракций. Наиболее распространенным является метод Фолча, согласно которому экстракцию проводят смесью хлороформ-метанол (2:1) из расчета 20 частей экстрагирующей смеси на одну часть ткани. Этот метод позволяет получить достаточно высокий выход нейтральных липидов, диацилглицерофосфолипидов и сфинголипидов. Лизофосфолипиды переходят в раствор лишь частично, а более полярные кислые липиды могут теряться при промывке экстракта растворами солей и водой. Однако при повторных экстракциях и ограничении промывок выход липидов можно повысить до количественного. Другой метод предложен Блайем и Дайером, когда экстракцию липидов осуществляют смесью хлороформ-метанол (1:1) из расчета две части смеси на одну часть ткани. Однако и в этом случае при промывке водой наиболее полярные кислые фосфолипиды и лизофосфолипиды переходят в водную фазу и теряются.
В зависимости от химической природы липидов используют модифицированные методы извлечения. Заменив смесь хлороформ-метанол на смесь хлороформ-2 %-ный раствор уксусной кислоты в метаноле, можно повысить выход полярных липидов. Впоследствии для этих же целей была применена смесь хлороформ-метанол-1М соляная кислота (4:2:3).
При экстракции нейтральных и общих липидов часто используют неполярные растворители, такие, как хлороформ, гексан, диэтиловый эфир. Естественно, что при этом теряется большое количество полярных липидов. При выделении нейтральных липидов из семян лекарственных растений, в том числе из «маральего корня» (Rhaponticum carthamoides), использовали гексан [3]. При этом был получен высокий выход (20 %) общих липидов (ОЛ), сравнимый с выходом растительных масел (подсолнечное, маковое). При экстракции ОЛ из семян R. carthamoides хлороформом был получен такой же высокий выход (20 % сухой массы семян) ОЛ [7].
Источник
Определение жира (жиров)
Во многих пищевых продуктах, применяемых в качестве сырья в производстве пищевых концентратов, содержится жир. Кроме того, жир вводят в состав большинства концентратов первых и вторых блюд в количестве от 2 до 15% как один из компонентов смеси, значительно повышающих калорийность готового продукта. Содержание жира в концентратах первых и вторых блюд нормируется техническими условиями, поэтому этот показатель систематически контролируют в готовой продукции.
Количество жира в сырье и концентратах определяют методом экстракции различными растворителями, рефрактометрическим методом или центрифугированием с предварительной обработкой исследуемого материала концентрированной кислотой.
В качестве растворителей обычно применяют этиловый (серный) и петролейный эфиры (температура кипения соответственно 35,6 и 50-60° С); жир можно извлекать также бензолом (80,3°С), хлороформом (61,2°С), дихлорэтаном (60°С), трихлорэтиленом (88° С), бензином (80-110° С) и некоторыми другими растворителями.
В жире, извлекаемом растворителем, содержатся свободные жирные кислоты, фосфатиды, эфирные масла и эфиры, альдегиды, кетоны, различные органические кислоты, красящие вещества и другие соединения, частично или полностью экстрагируемые растворителем. Поэтому жир, определяемый методом экстракции, принято называть «сырым» жиром. Количество примесей в «сыром» жире увеличивается, если применяется необезвоженный серный эфир, растворяющий до 2% влаги, такой эфир легко извлекает сахара, содержащиеся в пищевом сырье (овощах, крупах и т.д.). Спирт, содержащийся в серном эфире, хорошо растворяет многие органические соединения. Ввиду этого серный эфир, применяемый для извлечения жира, предварительно промывают водой для удаления спирта и обезвоживают прокаленным хлористым кальцием; после удаления примесей эфир перегоняют.
Для ускорения экстракции и полного извлечения жира исследуемый продукт тщательно измельчают и подсушивают, так как чем крупнее и влажнее частицы, тем медленнее извлекается жир; кроме того, из влажных объектов жир полностью не экстрагируется.
Определение жира непрерывной экстракцией (по Сокслету)
Жир экстрагируют из исследуемого продукта серным эфиром в аппарате Сокслета, состоящего из экстрактора с сифонной трубкой, шарикового обратного холодильника и приемной колбы. Навеску тщательно измельченного продукта в количестве 5-10 г (в зависимости от предполагаемого содержания жира в продукте) отвешивают с точностью до 0,0001 г в патрон из фильтровальной бумаги. Перед экстракцией взятую навеску продукта подсушивают при температуре 100-105° С в течение 2 ч.
Для изготовления патрона прямоугольным кусочком фильтровальной бумаги несколько раз обертывают деревянную болванку или стеклянный цилиндр, диаметр которых несколько меньше диаметра экстрактора. Конец бумаги, выступающий за край болванки на длину ее диаметра, загибают складками и получают таким образом дно патрона; на него кладут кружок из фильтровальной бумаги и кусочек обезжиренной ваты. Навеску в патроне закрывают сверху кружком фильтровальной бумаги, обезжиренной ватой и свободные края патрона загибают складками. Высота патрона должна быть на 10-15 мм ниже верхнего колена сифонной трубки экстрактора.
Патрон с навеской помещают в экстрактор, который соединяют на шлифах с высушенной до постоянной массы (веса) приемной колбой и холодильником. В колбу предварительно наливают до 2/3 ее объема высушенного перегнанного серного эфира. В холодильник пускают воду и нагревают колбу с серным эфиром на водяной бане с закрытым электронагревателем или паровым нагревом или на специальной закрытой электрической плитке. Температура воды в бане должна быть не более 60° С. Пары растворителя, образующиеся в колбе при кипении, попадая в холодильник, сгущаются в жидкость, которая каплями стекает в экстрактор, где находится патрон с навеской продукта. Когда уровень растворителя в экстракторе поднимется несколько выше верхнего колена сифонной трубки, эфир с растворенным в нем жиром стечет в приемную колбу. После этого весь процесс повторяется снова.
Жир экстрагируют в течение 10-12 ч, при этом нагревание и кипение эфира должны быть отрегулированы так, чтобы в час происходило 6-8 сливаний при объеме экстрактора 100 мл. Для более полного извлечения жира навеску продукта перед экстракцией помещают для настаивания в растворитель в течение 6-8 ч; настаивание ведут в экстракторе, наполненном эфиром ниже сифонной трубки.
Когда экстракция закончится, патрон с навеской вынимают из экстрактора и растворитель из приемной колбы отгоняют в пустой экстрактор. Остаток жира в колбе высушивают в шкафу до постоянной массы (веса) при температуре 100-105° С; первый раз колбу с жиром взвешивают через 1 ч сушки, а затем через каждые 0,5 ч. Перед взвешиванием колбу охлаждают в эксикаторе в течение 30-35 мин и затем взвешивают с точностью до 0,0001 г.
Количество жира в процентах (х) рассчитывают по следующей формуле:
где G — масса (вес) колбы с жиром, г; G1 — масса (вес) пустой колбы, г; g — навеска исследуемого продукта, г.
Конечный результат выражают как среднее арифметическое двух определений. Расхождение между двумя параллельными определениями не должно превышать 0,3%.
Определение жира настаиванием с растворителем
Навеску исследуемого продукта в количестве 2 г берут с точностью до 0,01 г в коническую колбу емкостью 50-100 мл. Приливают 10 мл растворителя — бензина или дихлорэтана, закрывают колбу корковой пробкой и снова взвешивают для определения массы (веса) растворителя. Жир экстрагируют в течение 1 ч, периодически взбалтывая навеску с растворителем. Затем содержимое колбы фильтруют через бумажный фильтр в сухую колбу, предварительно взвешенную с точностью до 0,001 г. Колбу с фильтратом взвешивают с точностью до 0,01 г и по разности определяют массу (вес) фильтрата.
Растворитель отгоняют на песочной бане, приняв соответствующие меры предосторожности, колбу с остатком помещают в сушильный шкаф и высушивают при температуре 100-105° С. Затем колбу с жиром охлаждают в эксикаторе и взвешивают с точностью до 0,001 г.
Содержание жира в процентах (х) определяют по формуле
где G — количество растворителя, г; G1 — количество жира, г; G2 — количество фильтрата, г; g — навеска исследуемого продукта, г.
Конечный результат выражают как среднее арифметическое двух определений. Расхождение между двумя параллельными определениями не должно превышать 0,3%.
Определение жиров рефрактометрическим методом (метод ВНИИКОПа)
Метод основан на определении коэффициента преломления раствора жира в а-монобромнафталине, автоле или смеси монобромнафталина с машинным маслом, которыми предварительно извлекают жир из исследуемого продукта. Растворение жира в любом из указанных растворителей вызывает понижение его показателя преломления, прямо пропорциональное концентрации жира в экстракте.
а-Бромнафталин имеет высокий показатель преломления — 1,65, он мало летуч и не растворяет воду — все эти свойства делают его наиболее приемлемым растворителем при определении количества жира при помощи рефрактометра. При выполнении анализа применяют универсальный рефрактометр со шкалой, градуированной до nD = 1,75; сахарный рефрактометр, имеющий шкалу пD только до 1,54, непригоден для работы с монобромнафталином.
Методика определения жира с применением в качестве растворителя монобромнафталина. Навеску тщательно измельченного продукта в количестве около 2 г берут по разности с точностью до 0,0001 г в маленькую фарфоровую ступку (диаметром не более 5 см), добавляют из бюретки 1,3 мл мелкого прокаленного песка и около 6 г монобромнафталина, отвешенного по разности с точностью до 0,01 г. Тщательно растирают пестиком навеску с песком и растворителем в течение 5 мин. Затем содержимое ступки переносят на небольшой складчатый фильтр (диаметром 7 см) и полученный после фильтрования жировой экстракт собирают в маленький химический стаканчик.
Перемешав экстракт стеклянной палочкой, 2-3 капли его наносят на призму рефрактометра и определяют коэффициент преломления. Определение рефракции повторяют не менее 3 раз с новыми порциями экстракта и берут для расчета среднее арифметическое.
Показатель преломления чистого монобромнафталина и испытуемого жирового экстракта определяют при одной и той же температуре. Температура во время определения поддерживается постоянной, что достигается пропусканием воды через оправы призм.
Количество жира в процентах (х) рассчитывают по следующей формуле:
где H0 — показатель преломления чистого растворителя; H — показатель преломления испытуемого жирового экстракта; g — навеска растворителя, г; g1 — навеска исследуемого продукта, г; а — показатель отношения процентного содержания жира в растворителе к разности между показателями преломления растворителя и жирового экстракта. Для пищевых концентратов a равен 0,0368.
Методика определения жира с применением в качестве растворителей автола или смеси монобромнафталина и машинного масла (метод ВНИИКОПа). Около 5 г хорошо измельченного продукта отвешивают по разности с точностью до 0,01 г в небольшую фарфоровую ступку и добавляют 4 г взятых также по разности автола или смеси из 25 объемных единиц монобромнафталина и 75 объемных единиц машинного масла. Затем в ступку вносят 3 г мелкого прокаленного песка и полученную смесь тщательно растирают в течение 5-10 мин (более длительное растирание рекомендуется для пищевых концентратов с мясом).
Если в качестве растворителя применяют смеси монобромнафталина и машинного масла, то растертую массу переносят из ступки на складчатый фильтр, 2-3 капли отфильтрованного жирового экстракта наносят на призму рефрактометра и определяют показатель преломления. В случае применения в качестве растворителя автола смесь в ступке растирают при нагревании, погрузив ступку в сосуд с горячей водой. Растертую массу переносят из ступки на фильтр из двух слоев марли с тонкой прослойкой из ваты, отжимают несколько капель жирового экстракта, охлаждают его, наносят на призму рефрактометра и определяют показатель преломления.
Содержание жира вычисляют по формуле, приведенной в методике определения жира с растворителем монобромнафталином. Показатель а равен: в случае применения автола — 0,3; в случае применения смеси монобромнафталина и машинного масла — 0,19. Расхождение между параллельными определениями не должно превышать 0,3%.
Примечание. Для отмеривания песка используют бюретку без крана, на кончик которой надевают каучуковую трубку с зажимом Мора.
Рефрактометрический метод определения количества жира является одним из самых быстрых методов. Им широко пользуются при исследовании пищевых концентратов и другой продукции, содержащей жир.
Определение жира центрифугированием
Метод применяется для определения жира в сухих молочных продуктах: молоке, сливках, масле, а также в яичном порошке и молочных смесях (продукты детского питания). Сущность метода заключается в том, что исследуемый продукт обрабатывают концентрированной серной кислотой в присутствии изоамилового спирта при нагревании и центрифугировании. При действии серной кислоты белок молочных продуктов переходит в растворимое соединение — H2SO4-NH2R(COOH)6, в результате чего происходит отделение жира. Изоамиловосерный эфир, образующийся при добавлении изоамилового спирта, снижает поверхностное натяжение жировых шариков и способствует слипанию их в сплошную массу. Нагревание и центрифугирование ускоряют этот процесс. Для определения служат стеклянные приборы — бутирометры (рис. 19), в градуированной части которых собирается отделившийся жир. Объем жира отсчитывают непосредственно по шкале бутирометра.
Примечание. Методика определения дана применительно к сухим молочным продуктам. Для работы могут быть использованы бутирометры для сливок или молока.
Определение жира в бутирометре для сливок (при исследовании сухого цельного молока, сухих сливок, сухого масла). Навеску продукта в количестве 2,5 г (сухое молоко, сухие сливки) или 2 г (сухое масло) берут с точностью до 0,01 г в химический стакан с носиком емкостью 25-50 мл, приливают 4-5 мл серной кислоты (относительной плотностью 1,5-1,55) и тщательно растирают стеклянной палочкой. Полученную однородную массу количественно переносят через маленькую воронку в бутирометр и смывают стаканчик несколько раз кислотой той же плотности порциями по 3-4 мл, следя за тем, чтобы общий объем кислоты в бутирометре составил 18-19 мл, а уровень содержимого бутирометра был ниже основания его горлышка на 7-8 мм. Затем приливают 1 мл изоамилового спирта.
Бутирометр плотно закрывают сухой каучуковой пробкой, обертывают полотенцем для предохранения рук от ожога и, придерживая пробку, энергично встряхивают и одновременно несколько раз переворачивают для лучшего смешивания содержимого. Затем бутирометр помещают пробкой вниз в водяную баню температурой 65-70° С, при этом уровень воды в бане должен быть несколько выше уровня жидкости в бутирометре. После полного растворения белковых веществ продукта, примерно через 7-8 мин, бутирометры вынимают и устанавливают столбик жира в градуированной части бутирометров, подкручивая пробку вверх или вниз. Затем бутирометры помещают симметрично в центрифугу узкими концами по направлению к центру и центрифугируют в течение 5 мин при 800-1000 об/мин.
После этого бутирометры снова ставят на 5 мин в водяную баню при температуре 65-70° С, вторично центрифугируют 5 мин и после выдержки в бане в течение 5 мин при той же температуре быстро отсчитывают число делений, занимаемых столбиком жира. При отсчете бутирометр держат в вертикальном положении против света. Для удобства отсчета нижнюю границу столбика жира устанавливают при помощи пробки на каком-либо делении шкалы прибора. Содержание жира в процентах находят умножая показание бутирометра на 2 при навеске 2,5 г и на 2,5 при навеске 2 г. Жир определяют в двух параллельных пробах, допускаемое расхождение — не более 0,5%.
Определение жира в бутирометре для молока. При исследовании цельного и обезжиренного молока или сухих сливок навеску продукта берут в количестве 1,5 г с точностью до 0,01 г в химический стакан с носиком емкостью 25-50 мл, приливают 4 мл горячей воды температурой 70-75° С, тщательно растирают и полученную однородную смесь без потерь переносят через маленькую воронку в бутирометр, в который предварительно наливают 10 мл серной кислоты (относительной плотностью 1,81-1,82); стаканчик 2 раза споласкивают дистиллированной водой порциями по 3 мл, присоединяя ее к содержимому бутирометра. Затем добавляют 1 мл изоамилового спирта. В остальном анализ выполняют так, как указано выше. При исследовании сухого обезжиренного молока применяют трехкратное центрифугирование.
Содержание жира в процентах (я) вычисляют по формуле
где а — показание бутирометра; l1-коэффициент для перевода показаний бутирометра в проценты; g — навеска продукта.
Расхождение между двумя параллельными определениями допускается не более 0,5%.
Источник
