Методы культивирования микроорганизмов
Для культивирования микроорганизмов применяют поверхностный или глубинный способы.
При поверхностном способе микроорганизмы выращивают чаще всего на твердых (рыхлых, увлажненных до 30-80%, например, отрубях) или жидких (реже) питательных средах. В первом случае рост идет на поверхности твердых частиц и в порах, заполненных водой или воздухом, перемешивание отсутствует. Если среда жидкая, то кюветы с ней помещают в вентилируемые воздухом камеры. Культура микроорганизмов потребляет кислород непосредственно из газовой фазы __ воздуха.
Поверхностным способом выращивают аэробные микроорганизмы (например, плесневые грибы).
Глубинный способ характеризуется тем, что микроорганизмы развиваются во всей толще жидкой питательной среды в специальных аппаратах (ферментаторах). Метод применим как для выращивания аэробных (аэрация среды обязательна), так и анаэробных микроорганизмов. Во всех случаях проводят перемешивание питательной среды мешалками.
Культивирование глубинным способом может быть периодическим или непрерывным.
Сущность периодического способа заключается в том, что весь объем питательной среды загружают в аппарат сразу, добавляют культуру микроорганизмов и при оптимальных условиях ведут процесс до тех пор, пока не накопится нужное количество биомассы (например, при выращивании чистой культуры дрожжей, бактерий; в производстве хлебопекарных дрожжей) или продуктов жизнедеятельности микроорганизмов — метаболитов (например, спирта).
При периодическом культивировании изменяется состав среды (уменьшается концентрация питательных веществ и увеличивается количество метаболитов); скорость роста; морфологические и физиологические свойства культуры. К тому же возникают технологические трудности __ циклический ход операций, сменные технологические режимы, что затрудняет контроль и автоматизацию процесса. Эффективность данного способа низкая (70% времени приходится на непроизводительные стадии __ лаг-фазу и фазу отмирания).
Эти недостатки устраняются применением непрерывных способов культивирования.
Данные методы характеризуются непрерывным поступлением в ферментатор свежей питательной среды и непрерывным оттоком готовой культуральной жидкости вместе с клетками введенной культуры микроорганизма.
При непрерывном культивировании можно задержать культуру на логарифмической стадии роста (или любой другой), установки могут длительно работать без остановки на дезинфекцию, время производства сокращается, процесс легче автоматизировать.
Различают гомогенно- и гетерогенно-непрерывное культивирование.
Гомогенно-непрерывный способ отличается интенсивным перемешиванием содержимого в ферментаторе, благодаря этому все параметры в любой точке аппарата и в вытекающей из него среде одинаковы.
Гетерогенно-непрерывный способ характеризуется незначительным перемешиванием среды или полным его отсутствием. При этом состав среды в любой точке аппарата различен, однако показатели системы в целом не изменяются во времени.
Гомогенные методы культивирования чаще всего используют для накопления биомассы микроорганизмов, гетерогенные __ для проведения собственно процесса брожения.
Все непрерывные процессы осуществляют в одном аппарате или в батарее, соединенных последовательно между собой ферментаторов.
Источник
Поверхностный метод культивирования микроорганизмов
Микроорганизмы поистине являются вездесущими, и они по своей способности заселять объекты внешней среды считаются в экологическом отношении самыми распространенными организмами. На поверхностях различных материалов они образуют скопления, именуемые колониями. Способ выращивания микроорганизмов на поверхности плотных питательных сред называется поверхностным культивированием. Выращивание микробов на плотных питательных средах в бактериологических лабораториях различного направления является одним из основных методов изучения свойств микроорганизмов.
Дело в том, что на плотных питательных средах различные микроорганизмы образуют различные по величине, форме и другим признакам колонии. Колонии представляют собой скопления особей одного вида микроорганизмов, образующихся в результате размножения из одной или нескольких клеток. Колонии бывают плоскими, выпуклыми, куполообразными, вдавленными. Поверхность их бывает гладкой (S-форма, от английского слова smooth — гладкий), шероховатой (R-формой, от английского слова rough — шероховатый). Между S- и R-формами колоний имеются и переходные: О- и М-формы (промежуточные и слизистые). Края колоний могут быть ровными, зазубренными, волокнистыми, бахромчатыми. По величине колонии подразделяются на крупные(4—5 мм в диаметре), средние (2—4 мм), мелкие (1—2 мм) и карликовые (меньше 1 мм). Колонии отличаются и по консистенции, плотности, окраске. Они бывают прозрачными и непрозрачными, окрашенными и бесцветными, влажными, сухими и слизистыми.
Следует иметь в виду, что особенности строения колоний для каждого вида микроба являются специфическими, что позволяет дифференцировать различные микробы по характеру роста их на плотных питательных средах. В качестве таковых сред чаще бывают агаровые. Кроме того, в пределах одного вида могут быть варианты микроорганизма с измененной формой колоний. Этот феномен получил название диссоциации. Она относится к проявлениям фенотипической изменчивости у микроорганизмов.
Следовательно, механизм и характер роста колоний для каждого микроорганизма имеют фундаментальное значение.
Теории и механизмы размножения микроорганизмов на поверхности каких-либо питательных сред менее изучены, чем при выращивании микробов глубинным способом.
Начало роста и размножения микроорганизмов в колониях на плотных питательных средах очевидно связано с анатомическими особенностями микробных клеток. Установлено, что у большинства микроорганизмов на поверхности клеточной оболочки имеются специальные отростки — фимбрии, с помощью которых микроорганизмы прилипают к поверхности объекта, в том числе и к поверхности плотной питательной среды. Прикрепившись к поверхности питательной среды, микробные клетки начинают размножаться. При этом скорость размножения микробов на поверхности питательной среды почти такая же, как и в жидких средах. Фазы роста и размножения микроорганизмов при поверхностном культивировании подчиняются тем же закономерностям, что и при глубинном культивировании. Что же касается механизма и скорости роста самих колоний микроорганизмов, то здесь имеются и неразрешенные вопросы. Однако считают (Pirt S. Y., 1967), что вначале, когда внесено небольшое количество клеток микроорганизма в качестве посевного материала для образования колоний на агаровой питательной среде, размножение протекает так, что почти все клетки в одинаковой степени участвуют в увеличении популяции. Соответственно рост всей популяции идет с максимальной экспоненциальной скоростью до тех пор, пока концентрация питательных веществ среды остается значительно выше константы насыщения и пока сама среда не ингибирует роста колоний. Потребление колонией питательных веществ создает в агаре градиент концентрации. В чашках Петри или другой емкости глубина концентрационного градиента питательной среды ограничена глубиной агара. В таком случае рост колоний по направлению вверх быстро падает почти до нуля из-за противодействия диффузии питательных веществ. Вконечном итоге рост колоний идет по периферической зоне радиально в сторону края колонии. В центре колонии скорость роста лимитирована диффузией субстрата настолько, что она практически равна нулю.
Метод поверхностного культивирования микроорганизмов широко используются в лабораториях и биологической промышленности для следующих целей:
— выделение чистых культур из объектов внешней среды;
— определение контаминации производственных штаммов микроорганизмов, из которых готовят биопрепараты;
— приготовление в лабораторных и промышленных условиях некоторых вакцин и большинства антигенов.
Источник
Поверхностное и глубинное культивирование, метод долива и пленок.
Поверхностное культивирование заключается в выращивании аэробных микроорганизмов на поверхности жидких и сыпучих питательных сред. При этом микроорганизмы получают кислород непосредственно из воздуха. При поверхностном культивировании на жидких средах микроорганизмы растут в виде пленок. Осуществляется поверхностное культивирование в специальных ваннах – кюветах. Поверхностное культивирование может быть только периодическим, в то время как глубинное культивирование может осуществляться и периодическим, и непрерывным способом.
Методы долива и пленок применяют при производстве лимонной кислоты при поверхностном культивировании.
Поверхностный способ реализуется на твердой сыпучей среде и в жидкой фазе. При жидкофазной поверхностной ферментации питательную среду разливают в кюветы слоем от 8 до 18 см. Кюветы размещают на стеллажах в предварительно простерилизованной парами формалина бродильной камере. Через специальные воздуховоды с током стерильного воздуха поверхность среды засевают исходной музейной культурой. В качестве посевного материала используют предварительно полученные также в условиях поверхностной культуры и высушенные споры (конидии) из расчета 50–75 мг конидий на 1 м2 площади кювет.
При использовании метода пленок через 7 суток после завершения кислотообразования сброженный раствор мелассы сливают из кювет, мицелий промывают стерильной водой и в кюветы заливают новую среду.
Бессменный способ с доливом характеризуется дробными добавками мелассы под пленку гриба на стадии кислотообразования (30–35 % от исходного объема), так называемый режим с подпиткой субстратом. Это позволяет повысить выход лимонной кислоты на 15–20 % с единицы поверхности при сокращении затрат сахаров на 10–15 % по сравнению сдругими методами.
Глубинное культивирование проводится на жидких питательных средах, в которых микроорганизмы развиваются во всем объеме питательной среды. Сочетание питательной среды и растущих в ней микроорганизмов называют культуральной жидкостью. Осуществляется глубинное культивирование в специальных аппаратах – ферментаторах, снабженных мешалками и системой подвода стерильного воздуха для обеспечения роста аэробных микроорганизмов. Аэрирование – продувание стерильного воздуха через культуральную жидкость. Глубинный способ является более выгодным для промышленности по сравнению с поверхностным способом, так как позволяет осуществлять полную механизацию и автоматизацию процесса, избегать инфицирования технологического процесса посторонней микрофлорой.
Начиная с 1950 года, промышленные процессы получения лимонной кислоты стали переводить в условия глубинной культуры. Стабильный процесс возможен при его организации в две стадии: рост мицелия на полной среде в ходе первой стадии и на второй (при отсутствии фосфора в среде) – образование лимонной кислоты. Глубинная ферментация проводится в аппаратах емкостью 50 м3 с заполнением на 70–75 %. В качестве посевного материала используют мицелий, подрощенный также в условиях глубинной культуры. В производственном аппарате, куда подрощенный мицелий передается по стерильной посевной линии, питательная среда содержит 12–15 % сахаров. Ферментацию проводят при 31–32 °С при непрерывном перемешивании. В ходе процесса кислотообразования (5–7 суток) реализуют интенсивный режим аэрации (до 800–1000 м3/ч) с дробным добавлением сахаров, 2–3 подкормки. Выход лимонной кислоты составляет от 5 до 12 %, остаточная концентрация сахаров – 0.2–1.5 %, доля цитрата – 80–98 % от суммы всех органических кислот.
Среды для получения органических кислот.
Разнообразны и субстраты, используемые в производстве органических кислот. Применяемые в начале века глюкоза и сахароза со временем стали заменять более доступными комплексными средами (мелассой, гидролизным крахмалом); в 60-е годы были разработаны новые процессы получения органических кислот на жидких парафинах нефти.
Питательные среды для культивирования продуцентов лимонной кислоты в качестве источника углерода содержат дешевое углеводное сырье: мелассу, крахмал и глюкозный сироп. Гриб Acetobacter niger чаще всего выращивают на мелассе. Гриб Trichoderma viride синтезирует значительные количества цитрата из глюкозы, что позволяет использовать для этого процесса целлюлозу. Предложены штаммы бактерий и дрожжей рода Candida, осуществляющие процесс на основе н-парафинов (С9-С30), которые пока широко не внедрены в промышленность.
В качестве сырья при промышленном производстве молочной кислоты используют сахарную и тростниковую мелассу и гидролизаты крахмала, при этом концентрация сахаров в исходной среде в зависимости от характера брожения составляет примерно от 5 до 20 %. Используют восстановленные формы азота, сульфаты или фосфаты аммония, а также солод и кукурузный экстракт в качестве источника факторов роста. Возможно использование сульфитного щелока.
При получении пропионовой кислоты в качестве субстрата брожения бактерии используют различные сахара (лактозу, глюкозу, мальтозу, сахарозу, органические кислоты – яблочную и молочную).
При производстве итаконовой кислоты среды содержат высокие концентрации сахаров, обычно используют мелассу, при дефиците фосфора и железа. Особенностью процесса получения данной кислоты является высокая потребность продуцента в солях цинка, магния и меди.
Дата добавления: 2018-08-06 ; просмотров: 3351 ; Мы поможем в написании вашей работы!
Источник
8.2. Способы культивирования микроорганизмов
Способ культивирования зависит от конечной цели культивирования (целью является либо накопление биомассы, либо получения определенного продукта жизнедеятельности — метаболита).
Поверхностное культивирование заключается в выращивании аэробных микроорганизмов на поверхности жидких и сыпучих питательных сред. При этом микроорганизмы получают кислород непосредственно из воздуха. При поверхностном культивировании на жидких средах микроорганизмы растут в виде пленок. Осуществляется поверхностное культивирование в специальных ваннах — кюветах.
Глубинное культивирование проводится на жидких питательных средах, в которых микроорганизмы развиваются во всем объеме питательной среды. Сочетание питательной среды и растущих в ней микроорганизмов называют культуральной жидкостью. Осуществляется глубинное культивирование в специальных аппаратах — ферментаторах, снабженных мешалками и системой подвода стерильного воздуха для обеспечения роста аэробных микроорганизмов. Аэрирование — продувание стерильного воздуха через культуральную жидкость.
При периодическом культивировании весь объем питательной среды засевают чистой культурой, которую выращивают в оптимальных условиях определенный период времени до накопления нужного количества целевого продукта. Следует отметить, что так как культивирование ведется на не возобновляемой питательной среде (в стационарных условиях), то клетки все время находятся в меняющихся условиях. Таким образом, периодическую систему можно рассматривать как замкнутую систему.
При непрерывном культивировании культура находится в специальном аппарате, куда постоянно притекает питательная среда и с такой же скоростью отводится культуральная жидкость. Для микроорганизма создаются неизменные условия среды, поэтому непрерывную систему можно рассматривать как открытую систему.
Поверхностное культивирование может быть только периодическим, в то время как глубинное культивирование может осуществляться и периодическим, и непрерывным способом.
8.3. Закономерности роста статической и непрерывной культуры
При периодическом способе культивирования популяция микроорганизмов проходит 7 стадий (фаз) роста (рис. 8.1).
Рис. 8.1 Кривая роста статической культуры
N — концентрация жизнеспособных клеток; τ – продолжительность культивирования
1. Лагфаза. В этот период культура адаптируется к новой среде обитания. Активизируются ферментные системы, возрастает количество нуклеиновых кислот, клетка готовится к интенсивному синтезу белков и других соединений. Клетки не размножаются (скорость размножения равна нулю). Концентрация живых клеток постоянна и равна количеству внесенных клеток. Продолжительность этой фазы зависит от физиологических особенностей микроорганизма и от состава питательной среды.
2. Фаза ускорения роста. Эта фаза характеризуется началом деления клеток, увеличением общей массы и постоянным увеличением скорости роста культуры. Эта фаза обычно непродолжительна.
3. Экспоненциальная (логарифмическая) фаза роста. В этот период микроорганизмы размножаются с постоянной максимальной скоростью. При этом логарифм числа клеток линейно зависит от времени. К концу этой фазы среда истощается вследствие катаболических и анаболических процессов, в среде накапливаются продукты жизнедеятельности микроорганизмов. Возникает и пространственная ограниченность, так как клетки мешают друг другу.
4. Фаза замедления роста. В этот период снижается скорость роста, небольшая часть клеток гибнет. Скорость роста выше скорости отмирания.
5. Стационарная фаза. Количество живых клеток достигает максимума. Скорость роста равна скорости отмирания клеток, поэтому концентрация жизнеспособных клеток остается постоянной.
6. Фаза ускорения отмирания. Количество отмерших клеток (скорость отмирания) становится больше количества образовавшихся клеток.
7. Фаза отмирания. Масса живых клеток значительно уменьшается, так как в среде нет питательных веществ, а запасные вещества клетки исчерпываются.
В основу способа непрерывного культивирования положено культивирование микробной популяции в условиях хемостата и турбидостата.
Рост в хемостате. Хемостат состоит из сосуда, в который вводят с постоянной скоростью питательный раствор. По мере поступления питательного раствора из него вытекает суспензия микроорганизмов с той же скоростью. При культивировании в условиях хемостата поддерживается постоянная концентрация одного из компонентов среды (например: углерода). Благодаря этому в условиях хемостата поддерживается постоянная скорость роста культуры. Культура микроорганизма находится в условиях динамического равновесия.
Рост в турбидостате. Работа турбидостата основана на поддержании постоянной концентрации живых клеток. В сосуде для культивирования все питательные вещества содержатся в избытке, а скорость роста бактерий приближается к максимальной.
Источник
