Способы культивирования микроорганизмов.
Культивирование микроорганизмов можно поводить поверхностным или глубинным, периодическим или непрерывным методами, в аэробных или анаэробных условиях. Большое значение при выборе способа культивирования имеет отношение выбранного культивируемого микроорганизма к молекулярному кислороду и конечная цель культивировании, которой может быть либо накопление биомассы клеток, либо получение определенного метаболита (спирта, кислорода, фермента и т.д.). настоящем Здесь мы рассмотрим, в основном методы, используемые в технологии пищевых и микробиологических производств с использованием аэробных микроорганизмов.
Поверхностное культивирование. При поверхностном культивировании микроорганизмы развиваются на поверхности питательной среды. Среды могут быть плотными, сыпучими или представлять собой тонкий слой жидкой среды. Практически метод применим только для культивирования аэробных микроорганизмов. В этом случае микроорганизмы получают кислород непосредственно из воздуха. Важным условием реализации метода является большая площадь соприкосновения поверхности питательной среды с окружающим воздухом. В жидких средах аэробные микроорганизмы часто растут, образуя на поверхности пленку. Факультативные анаэробы развиваются не только на поверхности, но и в толще жидкой среды, вызывая более или менее равномерное ее помутнение.
Этим методом ранее в промышленных масштабах получали лимонную кислоту и некоторые ферментные препараты для собственных нужд на заводах малой мощности. В настоящее время в промышленности его почти не применяют и подобная технология считается устаревшей. Поверхностное культивирование микроорганизмов используют в основном, в лабораторной практике в научных исследованиях и в музеях чистых культур.
Глубинное культивирование. Глубинный метод культивирования является более совершенным по сравнению с поверхностным. При этом микроорганизмы растут и развиваются во всем объеме питательной среды, а не только на ее поверхности. Осуществляют его, применяя жидкие питательные среды. Метод можно использовать как при культивировании аэробов, так и анаэробов.
Совокупность остатков питательной среды, растущих в ней микроорганизмов и продуктов их жизнедеятельности, образующихся при глубинном культивировании, называется культуральной жидкостью.
При культивировании аэробных микроорганизмов необходимо обеспечить большую поверхность соприкосновения питательной среды с кислородом воздуха, так как при глубинном культивировании в жидких средах микроорганизмы используют растворенный в среде кислород. Вместе с тем растворимость кислорода в воде невелика, поэтому для обеспечения роста аэробных микроорганизмов в толще среды, ее необходимо постоянно аэрировать — подводить кислород во всю толщу жидкой среды. В результате питательная среда насыщается кислородом воздуха и создаются благоприятные условия для развития аэробов.
В лабораторной практике способ глубинного культивирования реализуется путем использования специальных установок – качалок, обеспечивающих встряхивание или вращение колб и пробирок со скоростью 100-200 об/мин и более. Чем больше скорость вращения, тем больше поверхность соприкосновения среды с воздухом и выше насыщение ее кислородом. Помимо перемешивания, аэрировать питательную среду можно продуванием (барботированием) через ее толщу стерильного воздуха. Этот способ также используется в лабораторных исследованиях, но особенно широкое применение он нашел в промышленной микробиологии, где его применяют при получении микробной биомассы, в производстве антибиотиков, ферментов, витаминов, кислот. В промышленных масштабах глубинное культивирование осуществляют в специальных аппаратах – ферментаторах.
Ферментатор представляет собой цилиндрический аппарат сосферическими крышкой и днищем, снабженный мешалкой, отбойниками и устройством для диспергирования стерильного воздуха – барботером. Снаружи ферментатор снабжен рубашкой, в которую подается теплоноситель (обычно это вода) для поддержания в ферментаторе необходимой температуры. Иногда с этой же целью внутри ферментатора устанавливают змеевик.
Глубинное культивирование имеет ряд преимуществ по отношению к поверхностному:
— улучшаются санитарно-гигиенические условия труда;
— сокращаются производственные площади;
— появляется возможность автоматизации технологического процесса;
— удобство выделения целевого продукта из культуральной жидкости;
— возможность осуществления процесса непрерывного культивирования.
Периодическое культивирование. Глубинное культивирование микроорганизмов может быть периодическим и непрерывным.
При периодическом режиме культивирования весь объем питательной среды засевают посевной культурой, и выращивание ведут в оптимальных условиях определенный период времени до накопления нужного количества целевого продукта.
При таком режиме в течение всего периода культивирования непрерывно изменяется скорость роста культуры, ее физиолого-биохимические и морфологические показатели.
В связи с этим культура в своем развитии проходит несколько фаз роста и размножения, из которых можно выделить четыре основных (рис. 4.2).
g N
l
gN2
l
gN1
Рис. 4.2 Фазы развития культуры микроорганизмов при периодическом культивировании
Тут вы можете оставить комментарий к выбранному абзацу или сообщить об ошибке.
Источник
Способы культивирования
Для выращивания бактерий используют следующие способы их культивирования: стационарный, глубинный с аэрацией и с использованием проточных питательных сред.
Стационарный способ: питательные среды сохраняются постоянными, с ними никаких дополнительных манипуляций не производят. Однако при таком способе культивирования в жидких питательных средах, где преобладают анаэробные энергетические процессы, выход биомассы незначителен. Поэтому в связи с развитием микробиологической промышленности были разработаны принципиально новые способы культивирования, позволяющие получать гораздо больший выход биомассы или биологически активных соединений. К их числу относятся метод глубинного культивирования с аэрацией и метод использования проточных сред.
Метод глубинного культивирования с аэрацией. Для выращивания с помощью этого способа применяют специальные устройства – реакторы. Они представляют собой герметические котлы (приспособленные автоклавы), в которые заливается жидкая питательная среда. Реакторы снабжены автоматическими приспособлениями, позволяющими поддерживать постоянную температуру, оптимальные рН иrН, дозированное поступление необходимых дополнительных питательных вещест 2 в. Однако главная особенность таких реакторов в том, что они постоянно продуваются стерильным воздухом и в них установлены мешалки, с помощью которых среда постоянно перемешивается. Поэтому во всей питательной среде создается такая концентрация свободного кислорода, при которой энергетические процессы происходят в аэробных условиях, т. е. достигается максимальное использование энергии, заключенной в глюкозе, а следовательно, и максимальный выход биомассы. Для примера: выход биомассы при стационарном методе культивирования E. coli в МПБ через 18 – 20 ч составляет 1 – 2 млрд клеток на 1 мл среды, а при глубинном методе через 12 – 14 ч – 50 – 60 млрд клеток/мл среды.
Использование проточных питательных сред позволяет создать условия, при которых клетки имеют возможность длительное время находиться в определенной фазе роста (экспоненциальной) при постоянной концентрации питательных веществ и в одних и тех же условиях, обеспечивающих непрерывный рост культуры. Методы получения непрерывных культур основаны на том, что в аппарат, где растут клетки, непрерывно добавляют свежую питательную среду и одновременно из него удаляют соответствующее количество бактерий.
Различают два типа таких аппаратов: хемостаты и турбидостаты. Хемостат – аппарат, в который постоянно из особого резервуара добавляется свежая питательная среда. Благодаря механическому перемешиванию и аэрации среды в ней создаются оптимальные условия для снабжения бактерий кислородом и вновь добавляемыми питательными веществами, по мере поступления которых часть популяции бактерий из аппарата удаляется.
Принцип работы турбидостата основан на поддержании постоянной плотности (мутности) бактериальной популяции в аппарате. Степень мутности контролируется с помощью фотоэлементов, которые через систему реле регулируют поступление питательных веществ в аппарат. Все питательные вещества в ней содержатся в избытке, и скорость роста приближается к максимальной. В таких аппаратах непрерывного культивирования микроорганизмов (АНКМ) все необходимые параметры для роста соответствующего вида микроорганизма задаются и поддерживаются с помощью специальных автоматических приборов. Благодаря сохранению неизменных условий среды непрерывная культура постоянно находится в наиболее желательной фазе роста, при которой обеспечивается максимальный выход биологически важных соединений (антибиотики, витамины, аминокислоты и т. п.) либо биомассы. Таким образом, в соответствии со способами культивирования различают периодические (при стационарном и глубинном методах культивирования) и непрерывные (при проточном способе) культуры микроорганизмов. Кроме того, при определенных условиях получают синхронные культуры, т. е. культуры, в которых все клетки одновременно (синхронно) делятся. Однако такая синхронность сохраняется, как правило, в течение 2 – 3 циклов деления, а затем она нарушается. Синхронные культуры используют в основном для изучения тех или иных стадий клеточного цикла бактерий и роли отдельных генов (и их продуктов) в их осуществлении.
Данный текст является ознакомительным фрагментом.
Источник
Способы культивирования микроорганизмов
ЛЕКЦИЯ 4
Микроорганизмы, используемые в промышленных производствах
1. Требования к промышленным микроорганизмам и параметры их роста
Способы культивирования микроорганизмов и устройство ферментера
Микробиологическое производство биологически активных веществ
Промышленное производство органических кислот, растворителей, лечебных препаратов
Требования к промышленным м-мам и параметры их роста
Благодаря широкому набору разнообразных ферментных систем м-мы способны образовывать в процессе метаболизма различные продукты обмена, которые являются ценными для человека. Кроме того, м-мы также способны трансформировать природные и химически синтезированные продукты в в-ва, необходимые человеку.
Микробиологические производства в последние годы приобрели особенное развитие благодаря детальному изучению физиолого-биохимических и генетических свойств м-мов. В промышленных пр-ах используют разные м-мы: наиболее широко – дрожжи, реже – плесневые грибы, а также аэробные и анаэробные бактерии.
Так, различные расы дрожжей р.Saccharomyces cerevisiae используют для приготовления вина, пива, хлеба и получения этилового спирта. Дрожжи р.Candida используют для пр-ва белка и витаминов (на непищевом сырье).
Плесневые грибы используют для получения органических к-от: лимонной (Aspergillus niger), глюконовой (A. niger, Penicillium chrysogenum), итаконовой (A. tereus), фумаровой (Rhizopus nigricans); антибиотиков пенициллина (P.chrysogenum, P.notatum) и цефалоспорина (Cephalosporium sp.); препаратов витамина В2 (Eremothecium ashbyii) и β-каротина (Blackeslea trispora).
Среди бактерий промышленное применение имеют прокариоты различных таксономических групп. Они применяются для пр-ва пищевых продуктов (солений и маринадов – Leuconostoc, Pediococcus, Lactobacillus, кисломолочных – Lactobacillus, Streptococcus , уксуса – Acetobacter aceti); пищевых и кормовых добавок (аминокислот – Corynebacterium, Brevibacterium, инозиновой к-ты — Corynebacterium, витаминов – Bacillus subtilis); ферментов (протеазы – Bacillus licheniformis, амилазы – B. amiloliquefaciens, B. licheniformis, глюкозоизомеразы – Streptomyces sp.); растворителей (этанола – Zymomonas mobilis, бутанола и ацетона – Clostridium acetobutylicum, молочной к-ты – Lactobacillus sp.); полисахаридов (ксантана – Xanthomonas campestris, декстрана – Leuconostoc mezenteroides, альгинатов – Azotobacter vinelandii); лечебных средств (стероидов — , антибиотиков – Bacillus sp., аминокислот — Bacillus); бактериальных препаратов (удобрительных — Rhizobium, для защиты растений – Bacillus thuringiensis).
Штаммы-подуценты м-ов, используемых в промышленности, должны обладать следующими св-ами:
1)способность расти в чистой культуре (в частности, бактерии – без фагов) и быть генетически стабильными;
2)отсутствие патогенности и токсинообразования;
3)высокая скорость роста при массовом культивировании и способность синтезировать продукт в большом к-ве за период не более 3-х суток;
4) устойчивость к загрязнению.
Большинство м-ов, используемых в микробиологических процессах, являются прототрофами. Прототрофы– м-мы, которые синтезируют все необходимые для них органические в-ва, в том числе и факторы роста. Ауксотрофы – м-мы, не способные синтезировать факторы роста. Факторы роста – органические соединения (витамины, аминок-ты, азотистые основания), необходимые в очень малых к-вах.
Многие микробиологические пр-ва базируются на использовании растущих культур соответствующих видов. Однако, для получения некоторых продуктов используют суспензии отмерших клеток, а также иммобилизованные клетки м-ов.
При культивировании м-ов в промышленных условиях определяют ряд параметров, влияющих на процессы роста или образование определенных метаболитов. Различают физические, химические и биологические параметры.
Физические: температура, давление энергозатраты, вязкость, скорость потока воздуха и жидкости, мутность, масса ферментера.
Химические: рН, растворенный кислород, кислород и углекислый газ в выходящем газе, окислительно-восст. потенциал, конц-ция субстрата, конц-ция продукта, ионная сила раствора.
Биологические: метаболиты, активность ферментов, содержание ДНК и РНК, содержание АТФ и НАДН2 , содержание белка.
Кроме этого учитываются количественные параметры: удельная скорость роста, время удвоения биомассы, урожай культуры (выход биомассы) и экономический коэффициент.
Выход конечного продукта по отношению к использованному субстрату характеризуют показателем экономического коэффициента (Y)и рассчитывают по источнику углерода, азота или фосфора.Он оценивает рост определенного вида м-мов на различных средах и в различных условиях культивирования. Эк. коэф. определяют соотношением:
Y= λx / λs
где: λx увеличение биомассы, соответствующее количеству использованного субстрата λs.
Удельная скорость роста — µ(прирост биомассы за единицу времени на единицу времени) является важной хар-кой как самого м-ма, так и условий его культивирования. Удельнуя скорость роста м-ма лимитирует концентрация субстрата и накопление продуктов обмена.
Время удвоения биомассы (время генерации) – g является критерием скорости роста микробной популяции:
g = t = —— = ———
µ µ
Это — время удвоения к-ва клеток или биомассы.Времягенерации для разных м-ов зависит от условий культивирования.
Урожай культуры (выход биомассы) –это мах количество клеток или биомассы, которую можно получить при определенных условиях в единице объема. Эта величина выражается в количестве клеток в 1мл или 1л среды. На величину урожая оказывают влияние условия культивирования (состав среды, аэрация, рН, температура и др.).
Способы культивирования микроорганизмов
и устройство ферментера
Различают два основных способа культивирования микроорганизмов – поверхностный и глубинный.
При поверхностном культивировании м-мы выращивают на поверхности тонкого слоя жидкой среды или твердого субстрата. Методы культивирования на твердом субстрате разделяют на 2 группы: 1) посев на поверхность тонкого слоя среды, 2) глубинный посев.
При тонкослойной схеме субстрат вносят толщиной 2-4см на металлическую или деревянную емкость и проводят культивирование в хорошо проветриваемых помещениях (для удаления тепла, образующегося при росте культуры). Для поверхностного культивирования в качестве сырья используют свекольный жом, виноградную мезгу, зерновую мякину, пшеничные или рисовые отруби и т.д. Влажность субстрата – 40-70%. Наиболее часто этот способ используют при выращивании грибов.
При глубинном посеве культуру вносят в субстрат, которым заполняют емкость на глубину 0,6 или 1,5-1,8 м. Как правило, эти операции автоматизированы.
Глубинное культивирование– главный способ микробиологического пр-ва, в котором различают открытые и замкнутые системы. В открытых системах клетки легко вымываются и образуются новые, в замкнутых – к-во клеток постоянно увеличивается (накапливается).
Глубинное культивирование имеет ряд преимуществ по сравнению с поверхностным: менее трудоемкое, требует меньших площадей, имеет меньшую вероятность инфицирования. Кроме того, существует возможность тщательного контроля пр-ва, его автоматизации и получение высокого выхода продукта.
Известно два вида глубинного культивирования: периодическое и непрерывное. При периодическом изменяется скорость роста, физиолого-биохимические и морфологические характеристики культуры.
А. Периодическое (накопительное) культивированиехарактеризуется следующими чертами: а) полный цикл ферментации проходит в замкнутом объеме среды; б) скорость прироста биомассы лимитируется истощением питательной среды, накоплением шлаков – продуктов метаболизма.Используется в производстве аминокислот, витаминов, антибиотиков, ферментов, других БАВ.
В этих условиях м-мы проходят определенный цикл развития, для которого характерна смена фаз. Выделяют 4 основные фазы роста периодической культуры:
1.Лаг-фаза – фаза скрытого роста. С момента инокуляции. Клетки не размножаются. Идет адаптация к новой среде.
2.Логарифмическая (экспоненциальная) фаза. Скорость роста культуры максимальная: быстро увеличивается, высокая биохимическая активность
3.Стационарная фаза – количество нарождающихся клеток = кол-ву отмирающих: незначительный прирост биомассы. Накопление метаболитов и токсинов, исчерпание питательной среды.
4.Фаза массовой гибели клеток (отмирание): уменьшается к-во живых клеток, начинается их лизис под действием собственных ферментов (автолиз).
Б. Непрерывное культивирование характеризуется следующими чертами: а) периодическое (полупроточное) или непрерывное разбавление ферментирущей массы свежей питательной средой; в) скорость прироста биомассы не лимитируется. Используется для получения спиртов, кислот, растворителей.
Преимущества: использование спецоборудования, стабилизация во времени, улучшение качества продукта, возможность автоматизации.
Непрерывное культивирование осуществляется разными процессами: 1)Процесс полного вытеснения проводят в трубчатом ферментере, в который с одной стороны подается питательная среда и посевной материал, а с другой – вытекает культура. Такой процесс применяют в пищевой промышленности, в частности при пр-ве пива.
2)Процесс полного замещения проводят в ферментерах при интенсивном воздушном или механическом перемешивании. Этот способ часто называют гомогенно-непрерывным. В ферментере создаются условия, которые соответствуют определенной фазе роста м-ов. При быстром замещении среды – это условия экспоненциальной фазы, при медленном – стационарной.
В зависимости от используемого оборудования различают два вида непрерывного культивирования м-ов: хемостатный и турбидостатный.
Хемостат – аппарат для выращивания м-ов, в который с постоянной скоростью поступает питательная среда и с такой же скоростью происходит отток культуры. В хемостате длительное время поддерживается постоянный урожай культуры, скорость роста и концентрация питательной среды.
Турбидостат – в среде поддерживается постоянный уровень биомассы м-ов, который регистрируется по оптической густоте культуры специальным устройстврм с фотоэлементом. В этом оборудовании скорость накопления биомассы определяет скорость притока питательной среды (это основное отличие!).
Метод непрерывного культивирования приобретает все большее практическое значение, т.к. он позволяет получить высокий выход микробных продуктов и обеспечивает контроль производства.
Ферментер(биореактор) – это устройство для культивирования м-ов, которое обеспечивает оптимальные условия для их роста и метаболической активности, а также защиты от внешнего загрязнения.
Основные блоки ферментера (по Нетрусову): ротаметр (для подачи воздуха), снабженный бактериальным фильтром для стерилизации воздуха; магнитная мешалка; обратный холодильник; бактериальный фильтр для стерилизации выходящего воздуха; сосуд с дезраствором для стерилизации выходящих газов; стерильный пеногаситель; система для нагревания питательной среды в ферментере; емкость для суспензии м-ов; емкость для стерильной питательной среды; насос; блок управления.
С целью улучшения снабжения м-ов кислородом, проводят аэрацию питательной среды путем постоянного перемешивания на качалках разного типа. В производстве для культивирования аэробных м-ов используют ферментеры, оснащенные мешалками и нагнетателями воздуха.
Анаэробные м-мы культивируют в специальных аппаратах – анаэростатах,в анаэробных боксах в специальной герметической посуде в атмосфере азота или инертного газа (аргона).
Фототрофные бактерии выращивают в специальных устройствах: люминостатах:термостатах, оснащенных лампами дневного света.
Источник
