Полусинтетический способ получения пенициллинов
В настоящее время большое значение имеет так называемый полусинтетический (биологический + химический) способ получения аналогов природного пенициллина, обладающих рядом ценных свойств. Исходным продуктомполучения аналогов природного пенициллина в синтезе служит 6-аминопенициллановая кислота
Кислоту получают в результате биосинтеза, при развитии штаммаплесени Penicillium chrysogenum, в специфических условиях его культивирования (при отсутствии предшественников в среде) или чаще путемферментативного дезацилирования бензилпенициллина с участием пенициллинацилазы. При этом образуется 6-АПК и фенилуксусная кислота.
Ацилированием аминогруппы 6-АПК получен ряд новых полусинтетических антибиотиков, которые кислотоустойчивы в желудке, неподвергаются деструкции в организме пенициллиназой, обладают болеешироким спектром действия:
Химический синтез природного бензилпенициллина был проведенв 1957 г. Дж. Шееном с сотрудниками, однако он был многостадиен, давал низкий выход бензилпенициллина и поэтому не нашел практического применения.
Таблица 1. Полусинтетические пенициллины
| Препараты | Медицинское название антибиотика |
| Пенициллиназоустойчивые препараты | Тропициллин Фенбициллин |
| Кислотоустойчивые препараты | Метициллин Оксациллин Ампициллин |
Получение цефалоспоринов
Цефалоспорины относятся к группе b-лактамных антибиотиков,близких по структуре к пенициллину. Основной продуцент этого антибиотика – гриб Cepholosporium acremonium.
Цефалоспорин подавляет развитие грамположительных и грамотрицательных бактерий, но антибиотическая активность гораздо ниже,чем у пенициллина. Структура b-лактамного кольца его также неустойчива, и гидролизуется ферментом цефалоспориназой.
Полусинтетические аналоги цефалоспорина
В последнее время методом смешанного (биологического и химического) синтеза получено большое число аналогов цефалоспорина.
Многие из этих соединений имеют важное практическое значение.
Основой полусинтеза цефалоспоринов служит 7-аминоцефалоспорановая кислота, которая получается в результате отщепления ацильного остатка от цефалоспорина С под действием ферментаацилазы. Модификация основного ядра цефалоспорина может происходить с двух сторон молекулы.
Химическим или биотехнологическим (ферментативным) путемможно отщепить правую ацетоксигруппу (–ОСОСН3) 7-аминоцефалоспорановой кислоты с образованием 7-аминодеацетоксицефалоспорановой кислоты и на ее основе синтезировать полусинтетические антибиотики, широко применяемые в медицинской практике.
В табл. 2 приведены некоторые медицинские препараты,полученные на основе полусинтетических цефалоспоринов.
Таблица 2. Полусинтетические цефалоспорины
| Медицинское название антибиотика | Цефалоридин, Цефокситин, Цефалексин Цефотаксим |
Получение стрептомицина
Ярко выраженной способностью вырабатывать антибиотическиевещества обладают, помимо плесеней и микробов, также и лучистыегрибки – актиномицеты, обычно обитающие в почве. Сравнительно быстрая гибель большинства патогенных микробов при попадании в почвутесно связана с явлением антагонизма актиномицетов и бактерий. Изучение этого явления привело к открытию в 1943 г. С. Ваксманом второго после пенициллина антибиотика – стрептомицина, устойчивого нетолько к грамположительным, но и к грамотрицательным, и кислотостойким бактериям.
В этом смысле он превосходит пенициллин, который почти не активен к последним двум группам возбудителей инфекции. Особенноважным свойством стрептомицина является его высокая активность квозбудителю туберкулеза.
В своей структуре стрептомицин содержит (а) N-метил-D-глюкозамин, (б) – стрептозу и (в) – стрептидин и является сильным органическим основанием. В практике применяют его соли с кислотами(соляной, серной и др.)
При культивировании стрептомицина в качестве источника энергии требуется быстро метаболизируемый сахар (например, глюкоза),который вводят в начале процесса. Однако скорость его ассимиляциидолжна быть строго ограничена количеством присутствующего азота ифосфата, что в противном случае приводит к чрезмерному росту мицелия и снижению выхода антибиотика. На практике азот вводится в видесложных соединений (фильтрат барды и остатки масличного семени),которые в течение длительного процесса ферментации медленно разлагаются, выделяя аммиачный азот, рН среды 7,0–8,0, температура ферментации
28,5 оС. На стрептомицин не действует ни пенницилаза, нибольшинство микроорганизмов; если на более поздних стадиях процесса происходит инфицирование культуры, то образовавшийся стрептомицин не разрушается.
Типичные промышленные среды представляют смеси 2,5 %-й глюкозы, 4 %-й соевой муки с низким содержанием масла, 0,5 %-й барды и0,25 %-й поваренной соли; в некоторых случаях добавляют сухиедрожжи, мясные экстракты и кукурузный экстракт. В процессе ферментации могут использоваться масла и жирные кислоты (в качестве питательных компонентов либо в качестве пеногасителей). Процесс ферментации развивается так же, как и в случае производства пенициллина,причем образование стрептомицина в течение первых трех дней не происходит. За 6 дней концентрация стрептомицина достигает конечнойвеличины – 0,8 %.
Поскольку мицелий получается гораздо более мелкий, его нельзясобрать на волокнистом фильтре, поэтому для осветления субстрата используют кизельгур, в результате чего отфильтрованная масса делаетсяпригодной для скармливания скоту. Субстрат разделяют на ионообменной колонне.
Получение тетрациклинов
В 1948 г. из почвы был выделен новый вид актиномицета –Streptomyces aureofaciens, образующий антибиотики – хлортетрациклин, тетрациклин и другие вещества.
Как было найдено, эти антибиотики обладают широким антибиотическим действием в отношении грамположительных и грамотрицательных бактерий, риккетсий, спирохет, хламидий и т. д. Их применяют всельском хозяйстве как стимуляторы роста животных и птиц.
Хлортетрациклинбыл первым из выделенных тетрациклинов. Взависимости от свойств штамма в качестве источника энергии могутбыть использованы различные углеводы, однако для промышленногопроизводства представляют интерес лишь сахароза, крахмал и глюкоза.
Максимальные выходы антибиотика достигаются в результате ограничения содержания неорганического азота в среде и заменой его сложными веществами биологического происхождения (мукой масличныхсемян, арахисом, копрой – ядром кокосового ореха). В среду во многихслучаях добавляют кровяную муку, рыбную муку и гидролизованныйказеин. В ограниченных концентрациях используют кукурузный экстракт и барду при определенном содержании фосфатов. Содержаниефосфатов является важным фактором, поскольку пока весь неорганический фосфат полностью не будет преобразован в нуклеиновые кислотыи другие продукты обмена, образование тетрациклина не происходит.
Также в среде необходимо присутствие катионов микроэлементов (Со,Сu, Zn, Mn, Fe). Примерный состав питательных сред: крахмал (зерно вперемолотом и набухшем состоянии) 2–5 %, сахароза (в виде сахара илисвекольной патоки) 1–3 %, мука из масличного семени (отходы с низким содержанием жиров, арахис или соя) 1–3 %, мясные отходы (кровяная или мясная мука) 0,2–0,5 %, кукурузный экстракт 0,2– 1,0 %, аммониевые соли 0,1–0,5 %, известь 0,5 %, поваренная соль 0,1–0,5 %, солимикроэлементов.
Для ферментации желательно применять ферментаторы, изготовленные из нержавеющей стали или другого стойкого материала. В течение четырех дней, пока длится процесс, среда должна аэрироваться.
Окончательное значение выхода продукта приближается к 1 %. Препарат может быть осажден добавлением извести до рН 8,8. Затем он отфильтровывается на фильтр-прессе, экстрагируется разбавленной кислотой и очищается посредством фракционного осаждения: после перекристаллизации можно получить продукт, достигающий 98 % чистоты.
Окситетрациклинбыл впервые изготовлен в 1950 г. при культивировании актиномицета Streptomyces rimosus. Среда и условия ферментации подобны используемым при производстве хлортетрациклина, за темисключением, что в качестве источника азота могут быть использованынитраты и кукурузный экстракт.
Окситетрациклин образует нерастворимый комплекс с солями четвертичного аммониевого основания, и этот комплекс может быть легкоотделен от субстрата, после чего его размягчают соляной кислотой и затем кристаллизуют в виде соли уксусной кислоты. Как и другие тетрациклины, этот препарат выпускается главным образом в виде таблетокили суспензии.
Тетрациклинбыл получен после хлортетрациклина и окситетрациклина, причем почти одновременно как путем направленной ферментации с помощью отобранных штаммов Streptomyces aureofaciens в условиях низкого содержания хлоридов в питательной среде, так и путемкаталитического восстановления хлортетрациклина.
В методе направленной ферментации используется ряд организмов,в том числе и Streptomyces vicidifaciens, при этом полученный штамм вадекватной среде может обеспечить большие выходы тетрациклина илиравные количества хлортетрациклина и тетрациклина пропорциональноколичеству присутствующих ионов хлора. В случаях, когда необходимоизбежать образования хлортетрациклина, содержание хлорида в средене должно превышать 17 ч./млн. Если необходимо использовать в качестве основных компонентов субстрата сложные биологические вещества, то в условиях промышленного производства для контроля уровняхлоридов имеются два способа:
1) удалять большую часть хлорида, пропуская компоненты, такие,как сахар-сырец и кукурузный экстракт через ионообменные смолы.Этот метод вполне эффективен, если применяется к разбавленным растворам;
2) вводить в среду вещества, замедляющие утилизацию хлорида,например, бромиды. Оказалось, что при концентрациях от 10 до 350ч./млн., ионы брома практически подавляют образование хлортетрациклина, даже в присутствии ионов хлора в концентрациях 1500 ч./млн. Напрактике применяют бромистый натрий (5 %).
Дата добавления: 2018-04-15 ; просмотров: 690 ; Мы поможем в написании вашей работы!
Источник
Технологическая схема производства пенициллина
Механизмы биосинтеза антибиотиков. Мультиферментные комплексы. Сборка углеродного скелета молекул β-лактамов, аминогликозидов, тетрациклинов, макролидов. Роль фенилуксусной кислоты при биосинтезе пенициллина. Фактор А и биосинтез стрептомицина.
Особенности получения антибиотиков
Процесс получения антибиотика включает в себя следующие основные стадии (рис. 1):
1. получение соответствующего штамма — продуцента антибиотика, пригодного для промышленного производства;
2. биосинтез антибиотика;
3. выделение и очистка антибиотика;
4. концентрирование, стабилизация антибиотика и получение готового продукта.
Первая задача при поиске продуцентов антибиотиков — выделение их из природных источников. Биосинтез антибиотиков — наследственная особенность организмов, проявляющаяся в том, что каждый вид (штамм) способен образовывать один или несколько вполне определенных, строго специфичных для него антибиотических веществ.
Выявление потенциальной возможности образовывать в процессе жизнедеятельности антибиотики связано с условиями культивирования организмов. В одних условиях организм образует антибиотик, в других условиях тот же организм при хорошем росте не будет обладать способностью синтезировать антибиотическое вещество. Образование антибиотиков будет происходить только при развитии организма в специфической среде и при наличии особых внешних условий. Путем изменения условий культивирования можно получить больший или меньший выход антибиотика, или создать условия, при которых антибиотик вообще не будет образовываться. Можно также путем изменения условий культивирования продуцента добиться преимущественного биосинтеза одного из антибиотиков, при условии образования изучаемым организмом нескольких антибиотических веществ, или же получить новые формы антибиотиков, но только в пределах тех соединений, которые способны синтезироваться этим организмом.
Среды для культивирования микроорганизмов. Натуральные (комплексные) среды, состоящие из природных соединений и имеющие неопределенный химический состав (части зеленых растений, животные ткани, солод, дрожжи, фрукты, овощи, навоз, почва и т. д.), содержат все компоненты, необходимые для роста и развития микроорганизмов большинства видов. Используются следующие среды:
— мясопептонная среда, в состав которой одновременно с мясным экстрактом и пептоном входят хлорид натрия, фосфат калия, иногда глюкоза или сахароза; используется обычно в лабораторной практике.
— картофельные среды с глюкозой и пептоном, часто используемые в лаборатории для культивирования многих видов актиномицетов и бактерий;
Рис. 1 — Схема производства антибиотиков в процессе микробного биосинтеза
Поскольку натуральные среды не позволяют получать строгие количественные данные для изучения физиологических и биохимических особенностей организма, применяют синтетические среды, которые подбирают для отдельных продуцентов индивидуально.
Источниками углерода могут быть органические кислоты, спирты, углеводы, сочетания различных углеродсодержащих соединений. При промышленном получении ряда антибиотиков в качестве источников углерода нередко применяют картофельный крахмал, кукурузную муку или другие растительные материалы.
Источники азота оказывают большое влияние на образование микроорганизмами антибиотических веществ. Обычно в средах для культивирования микроорганизмов источником азота служат соли азотной (реже азотистой) кислоты, аммонийные соли органических и неорганических кислот, аминокислоты, белки и продукты их гидролиза.
Обычно наиболее благоприятным для микроорганизмов является соотношение C/N = 20. Однако для образования антибиотика такое соотношение не всегда оптимально. Поэтому для каждого продуцента необходимо подбирать соответствующее соотношение углерода и азота.
Источниками минерального питания служат фосфор, сера и другие макро- и микроэлементы.
Продуценты антибиотиков по отношению к концентрации фосфора в среде можно разделить на три группы:
— высокочувствительные продуценты, для которых оптимальная концентрация фосфора в среде составляет менее 0,01 % (продуценты нистатина, тетрациклинов, флоримицина, ванкомицина);
— продуценты средней чувствительности, для которых оптимальная концентрация фосфора составляет 0,010–0,015 % (продуценты стрептомицина, эритромицина, циклосерина, неомицина);
— малочувствительные продуценты, для которых оптимальная концентрация фосфора составляет 0,018–0,020 % (продуценты новобиоцина, грамицидина, олеандомицина).
Сера входит в состав некоторых антибиотиков, образуемых грибами (пенициллин, цефалоспорин, глиотоксин и др.), бактериями (бацитрацины, субтилины, низины) и актиномицетами (эхиномицины, группа тиострептона). Обычно источником серы в среде служат сульфаты. Однако при биосинтезе пенициллина лучшим источником серы для продуцента служит тиосульфат натрия.
Кроме того, для биосинтеза антибиотиков необходимы и отдельные микроэлементы. Так, продуцент альбомицина S. subtropicus образует антибиотик при значительной концентрации железа в среде. Железо необходимо для образования хлорамфеникола и других антибиотиков.
Биосинтезу ряда антибиотических веществ (хлорамфеникола, стрептомицина, пенициллина и др.) способствуют ионы цинка.
Стимулирующее влияние на биосинтез гентамицина, курамицина А, фософономицина оказывают ионы кобальта.
Ионы галогенов входят в состав некоторых тетрациклиновых антибиотиков и хлорамфеникола.
Влияние рН среды. Многие бактериальные организмы, синтезирующие антибиотики, лучше развиваются при рН около 7,0, хотя некоторые, например молочнокислые стрептококки, продуцирующие низин, лучше развиваются в среде при рН = 5,5÷6,0.
Большинство актиномицетов хорошо развиваются при начальных значениях рН среды в пределах от 6,7 до 7,8; в большинстве случаев жизнеспособность актиномицетов при рН ниже 4,0–4,5 подавлена.
Температура. Для большинства бактериальных организмов температурный оптимум развития лежит в диапазоне 30–37 °С. Для продуцента грамицидина С оптимальная температура для развития и биосинтеза равна 40 °С.
Актиномицеты, как правило, культивируются при температуре 26–30°С, хотя некоторые виды стрептомицетов могут развиваться как при пониженных (от 0 до 18 °С), так и при повышенных (55–60 °С) температурах.
Для большинства мицелиальных грибов оптимальная температура составляет 25–28 °С.
Аэрация. Большинство изученных продуцентов антибиотиков являются аэробами. Для биосинтеза многих антибиотиков (пенициллин, стрептомицин и др.) максимальное их накопление происходит при степени аэрации, равной единице, при которой через определенный объем среды за 1 мин продувается такой же объем воздуха.
В процессе развития продуцента антибиотика в промышленных условиях потребность организма в кислороде меняется в зависимости от стадии развития, вязкости культуральной жидкости и других факторов. На определенных стадиях могут возникнуть ситуации, связанные с кислородным голоданием продуцента. В этих условиях следует принимать дополнительные меры, например, повышение концентрации окислителя добавлением пероксида водорода.
Наиболее перспективным методом выращивания микроорганизмов — продуцентов антибиотиков признан метод глубинного культивирования с использованием периодических процессов. В условиях глубинной культуры процесс развития организма и синтеза антибиотика проходит в две фазы.
В первой фазе развития культуры или, как ее иногда называют, тропофазе (фаза сбалансированного роста микроорганизма), наблюдается интенсивное накопление биомассы продуцента, связанное с быстрым потреблением основных компонентов среды и с высоким уровнем поглощения кислорода.
Во второй фазе развития, именуемой идиофазой (фаза несбалансированного роста микроорганизма), накопление биомассы замедлено или даже уменьшено. В этот период продукты метаболизма микроорганизма лишь частично используются на построение клеточного материала, они в основном направляются на биосинтез антибиотика. Обычно максимум продукции антибиотика в среде наступает после максимума накопления биомассы. Подробное описание технологического процесса на примере производства пенициллина приведено в следующей главе.
Производство пенициллина
Пенициллин был открыт в 1929 г. Александром Флемингом и был выделен в кристаллическом виде 1940 году. Установлено, что пенициллин оказывает антимикробное действие в отношении некоторых грамположительных бактерий (стафиллококков, стрептококков, диплококков и некоторых других) и практически неактивен в отношении грамотрицательных видов и дрожжей.
Способность образовывать пенициллин широко распространена среди многих плесневых грибов, относящихся к родам Penicillium и Aspergillus. Однако это свойство более характерно для группы Penicillium notatum-chrysogenum. Первые выделенные из естественных субстратов штаммы как наиболее активные продуценты пенициллина образовывали не более 20 единиц (12 мкг) антибиотика на 1 мл культуральной жидкости. В результате широкой научной работы по селекции новых активных штаммов продуцентов пенициллина получены различные штаммы Penicillium chrysogenum, которые, в отличие от исходных штаммов, обладают высокой продуктивностью и используются в промышленности. В настоящее время в промышленных условиях получают культуральные жидкости с содержанием пенициллина более 15000 ед/мл, а отдельные штаммы способны синтезировать антибиотик в количестве до 25 тыс. ед/мл.
Под названием «пенициллин» объединена обширная группа веществ, которые являются N-ацильными производными гетероциклической аминокислоты. Из природных пенициллинов применяются бензилпенициллин и феноксиметилпенициллин.
В процессе культивирования необходимо подобрать сбалансированное сочетание интенсивности аэрации среды (от 0,38 до 4,38 г O2(л/ч)) и концентрации входящих в неё веществ. Температура культивирования -40 °С. Развитие продуцента и синтез антибиотика может идти и при температуре 28 °С, но в этом случае максимальный биосинтез антибиотика наблюдается в первые 24 ч, в то время, как при температуре 40 °С — между 24 и 48 ч.
При выделение грамицидина С культуральную жидкость подкисляют кислотой хлороводородной до рН 4,5-5,0. В осадок выпадает ди-хлоргидрат грамицидина С вместе с бактериальными клетками продуцента. Из осадка антибиотик экстрагируют этанолом. Концентрат, содержащий 4 % грамицидина, используется в медицинской практике.
Технологическая схема производства пенициллина
Дата добавления: 2018-04-04 ; просмотров: 6463 ; Мы поможем в написании вашей работы!
Источник
