Получение рибофлавина микробиологическим способом

Получение рибофлавина микробиологическим способом

Строение и свойства рибофлавина [19, 134]

Рибофлавин (витамин В₂), 7,8-диметил-10-(1′-D-рибитил)-изоаллоксазин имеет незаменимое значение для человека и животных. Мировое производство рибофлавина в настоящее время превышает 3000 т/год [135].

Рибофлавин (17, РФ) относится к флавинам, в основе строения которых лежит гетероциклическая изоаллоксазиновая система (рис. 15.7.17), представленная тремя конденсированными циклами: ароматическим (А), пиразиновым (В) и пиримидиновым (С). К азоту пиразинового кольца присоединен спирт рибит.

Рис. 15.7.17. Строение рибофлавина

РФ (С₁₇Н₂₀N₄O₆) кристаллизуется из 2 н. уксусной кислоты, спирта, воды или пиридина в виде оранжево-желтых игл, температура его разложения 278–282 °С. Витамин имеет горький вкус. Он хорошо растворим в этаноле; не растворим в ацетоне и неполярных растворителях; растворимость в 100 мл воды составляет 10–13 мг при температуре 25–27,5 °С, 19 мг при 40 °С, 230 мг при 100 °С. РФ является амфотерным соединением; константы диссоциации: K _a = 6,3 × 10 –12 ; K _b = 0,5 × 10 –5 ; изоэлектрическая точка соответствует рН 6,0; [α]=70 (0,06% раствор в 0,1 М NaOH, в нейтральных растворах оптическое вращение не наблюдается). В водных растворах λ _max составляют 445, 347, 268 и 223 нм ( e равно 12,3 × 10 3 ; 10,8 × 10 3 ; 31,4 × 10 3 ; 30,1 × 10 3 , соответственно).

РФ флуоресцирует в желто-зеленой области с наибольшей интенсивностью при рН = 6÷ 8. В кислой среде РФ стабилен, в щелочной быстро разрушается.

Биологическая роль РФ определяется его участием в качестве предшественника флавинмононуклеотида (ФМН) и флавинадениндинуклеотида (ФАД) — флавиновых коферментов, которые входят в большое число окислительно-восстановительных ферментов (флавопротеидов).

Рибофлавин в значительных количествах содержится, мг/100 г: в яйцах — 0,80, твороге — 0,4–0,5, печени и почках — 3,64–4,66, гречневой крупе — 0,24, дрожжах — 2,1–4,0.

В медицине витамин В₂ применяют при недостаточном содержании его в рационе в виде витаминных препаратов, а также путем инъекций ФМН и ФАД при патологических явлениях, связанных с нарушением обмена флавиновых нуклеотидов [7]. Кроме того, препараты РФ применяют при кожных заболеваниях, вяло заживающих ранах, заболеваниях глаз, нарушении функции желудочно-кишечного тракта, диабете, анемиях, циррозе печени. В качестве препаратов пролонгированного действия используют сложные эфиры РФ. Они имеют стимулирующее влияние на углеводный и липидный обмены.

РФ в комплексе с тиамином и ниацином используют для витаминизации обедненной в ходе переработки муки первого и высшего сортов. В пищевой промышленности РФ используют также для окраски продуктов в оранжево-желтый цвет [125].

Основные способы получения рибофлавина [7, 128]

РФ относится к числу витаминов, для которых разработаны как микробиологический, так и химический способы промышленного синтеза. Выбор метода зависит от состояния и перспектив сырьевой базы и других конъюнктурных условий.

При химическом синтезе в качестве исходных компонентов используются 3,4-диметиланилин и рибоза [19]. Поскольку одним из методов получения D-рибозы (Т_плав 87 °С) является микробиологический синтез, можно получать РФ и комбинированным (химико-биотехнологическим) методом.

Получение рибозы [136]. Для биосинтеза рибозы в основном применяются транскетолазные мутанты (tkt-мутант) Bacillus Species, Penicillium brevi-compactum и Pseudomonas reptilivora. В качестве источника углерода при культивировании микроорганизмов используются глюкоза или крахмал; в среду также вносятся соли аммония, калия (фосфаты), магния и в некоторых случаях дрожжевой или кукурузный экстракт.

В случае Bacillus Species D-рибоза начинает накапливаться пропорционально потреблению глюкозы на 1–2 день и заканчивается на 4 день. Максимальный выход достигается при температуре 36,6 °С. Выделение и очистку рибозы осуществляют (после отделения микробных клеток центрифугированием) колоночной хроматографией с использованием сильноосновного анионита (боратная форма) и последующей кристаллизацией.

Производство РФ [134]. Микробиологический метод получения рибофлавина имеет такие существенные преимущества перед химическим методом, как использование доступного сырья, сравнительно несложной аппаратуры, осуществление процесса в одну технологическую стадию; при этом отсутствуют вредные выбросы в атмосферу.

В качестве промышленных продуцентов витамина используют микроскопические грибы Eremothecium ashbuii и Ashbyii gossypii, которые могут синтезировать более 1,5 мг/мл РФ. Методами генетической инженерии сконструирован штамм Bacillus subtilis, способный к сверхпродукции РФ [70].

Состав питательной среды. Продуценты РФ выращивают на средах, где источником углерода являются глюкоза, сахароза, крахмал, пшеничная мука. В качестве источника азота используют молочную сыворотку, бобы, рыбную и кукурузную муку или экстракт, соевую муку, казеин. Необходимым условием культивирования является аэрация.

Развитие гриба-продуцента стимулируется добавлением ненасыщенных жирных кислот, биотина, тиамина, инозита, ростовых веществ, содержащихся в зародыше пшеницы, картофельном соке и дрожжевом автолизате.

Пуриновые и пиримидиновые основания (аденин, гуанин, гипоксантин, мочевая кислота и особенно ксантин) также могут использоваться для интенсификации биосинтеза.

Биосинтез РФ грибом Er. ashbyii стимулируют липиды [137]. Так, при добавлении в питательную среду кукурузного или соевого масла выход РФ увеличивается вдвое. Хороший эффект достигнут при использовании в концентрации от 0,5 до 1,0 % отходов масложировых комбинатов.

Условия культивирования. Для производства РФ используют поверхностный и глубинный способы культивирования.

РФ накапливается в клетках микроорганизмов либо в виде флавинадениннуклеотида, либо в свободном состоянии.

Для биосинтеза РФ основными продуцентами (Eremothecium ashbyii и Ashbya gossypii) начальный рН, необходимый для роста, лежит в диапазоне 6,0–7,0 (к концу процесса он может снизиться до 4,5, поэтому для эффективного синтеза РФ его повышают до 9,5). Оптимальная температура для обоих продуцентов составляет 26–28 °С.

Для производства РФ с использованием Er. ashbyii рекомендованы среды следующего состава [15, 70], %:

• сахара-сырца — 5, пептона — 3, пшеничных зародышей — 1, мясного экстракта — 0,3, KН₂РО₄ — 0,3, NaCl — 0,25; рН = 6,0, продолжительность культивирования 7 суток;
• мелассы, гидрола или глюкозы — 1–3; кукурузного экстракта или дрожжевого автолизата — 3–8 (с добавлением N, P₂O₅, K, Mg, Zn);
• соевой муки — 2–3, кукурузного экстракта — 3,0–3,6, свекловичного жома или яблочного порошка — 4–6, мела — 0,5–1,0.

Культивирование глубинным способом осуществляется при температуре 28–30 °С и постоянной интенсивной аэрации в течение 80–84 ч. При соблюдении оптимальных условий продуцент синтезирует до 1800 мкг РФ в 1 мл культуральной жидкости.

Вид продукта. Выпускаются два вида продуктов, содержащих РФ: кормовой препарат и кристаллический РФ.

Кормовой препарат витамина В₂ представляет собой порошок с влажностью не более 10 %. Для его получения по окончании процесса ферментации КЖ подвергают термообработке и упариванию под вакуумом до содержания сухих веществ 30–40 %. Упаренный концентрат сушат в распылительной сушилке. Готовый продукт содержит не менее 10 мг/г витамина В₂, а также другие витамины группы В (В₁, В₂, В₃, В₆, В₁₂) и никотиновую кислоту. Для животноводства можно получить кормовой РФ как отход производства ацетона. Продуцентами витамина при этом являются ацетонобутиловые бактерии.

Кристаллический РФ предложено получать несколькими способами:

1. В конце ферментации РФ насыщает питательный раствор и остается также в мицелии, из которого его экстрагируют паром. После фильтрации водный раствор РФ упаривают до концентрации около 2,5 %, из которого РФ кристаллизуется.

2. Нерастворимый материал удаляется центрифугированием, и раствор подкисляют до рН = 5,0÷5,5. При 20–30 °С добавляется 5 молей восстановителя (Na₂S₂O₄) на 1 моль РФ. Осадок отделяют, растворяют при нагревании в 75% водном изопропаноле и отфильтровывают; чистый фильтрат при охлаждении дает желтые игловидные кристаллы Рф, которые отделяют фильтрованием или центрифугированием.

3. РФ адсорбируют на активном угле с последующим элюированием 5–10% водным раствором пиридина.

Медицинский препарат РФ получают перекристаллизацией технического продукта в соляной кислоте.

Источник

Микробиологическое получение рибофлавина

Рибофлавин как витамин, который не синтезируется организмом человека. Теоретические основы производства рибофлавина (витамина B2). Основные и вспомогательные процессы на всех стадиях производства. Разработка и описание технологической схемы производства.

Рубрика	Химия
Вид	курсовая работа
Язык	русский
Дата добавления	10.02.2012
Размер файла	932,4 K

Отправить свою хорошую работу в базу знаний просто. Используйте форму, расположенную ниже

Студенты, аспиранты, молодые ученые, использующие базу знаний в своей учебе и работе, будут вам очень благодарны.

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Микробиологическое получение рибофлавина

Ключевые слова: Рибофлавин, Bacillus subtilis, биосинтез, биомасса, закономерности роста, ферментация, ферментер, сахароза.

Целью курсовой работы является проектирование типового производства рибофлавина (витамина B₂).

В курсовой работе рассмотрены теоретические основы производства. Описаны основные и вспомогательные процессы на всех стадиях производства рибофлавина. Также представлен эскиз и описание технологической схемы производства.

2. Литературный обзор

3.1 Условия культивирования

4. Характеристики процесса

4.1 Экспоненциальная фаза роста

4.2 Стационарная фаза роста

4.3 Выход рибофлавина от субстрата

5.1 Приготовление посевного материала

5.2 Производственный этап

5.3 Утилизация отходов

7. Список использованной литературы

Рис.1 Химическая структура рибофлавина

Рибофлавин, или витамин В2- один из наиболее важных водорастворимых витаминов, кофермент многих биохимических процессов. Название «рибофлавин» произошло от его внутренних составляющих: рибозы и природного жёлтого пигмента- флавина.

В начале ХХ века было замечено, что под воздействием тепла некоторые витамины группы В вели себя по-разному: одни разрушались, а другие оказывались более устойчивыми к высоким температурам.

Это наблюдение позволило отделить витамин В1, очень неустойчивый к действию тепла, от витамина В2, который легко переносит высокие температуры, совершенно не меняя своей молекулярной структуры. В 1933 г эту устойчивую к теплу молекулу выделили из вещества, окрашенного в жёлтый цвет, и назвали «лактофлавином». Затем это вещество искусственно синтезировали, и оно получило своё нынешнее название «рибофлавин».

В организме человека рибофлавин синтезируется кишечной микрофлорой. Как и все витамины группы В, витамин В2 является водорастворимым, легко всасывается и выводится из организма, не накапливаясь. Из всех форм витаминов группы В витамин В2 расходуется быстрее всего.

В промышленности рибофлавин получают химическим или более приоритетным биотехнологическим синтезом. Недостатком химического синтеза рибофлавина является сложность технологического процесса и низкий выход целевого продукта.

2. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

рибофлавин витамин производство

Рибофлавин (витамин В₂) является незаменимым витамином, то есть не синтезируется организмом человека и животных. Рибофлавин принадлежит к группе коферментных витаминов и участвует в синтезе окислительно- восстановитсльиых ферментов — флавопротеинов.

Биосинтез рибофлавина культурами Bacillus subtilis в настоящее время является наиболее перспективным способом получения данного витамина в промышленных целях.

В. subtilis является излюбленным объектом классической генетики и очень удобен для генно-инженерных манипуляцией. Кроме того, штаммы Bacillus subtilis обладают высокой степенью толерантности, т.е. могут расти в широком диапазоне значений температуры, рН и других важных физиологических параметров.

В конце 60-х годов появились первые работы, посвященные исследованию биосинтеза рибофлавина культурами Bacillus subtilis. Методами генетической инженерии были созданы высокопродуктивные рекомбинантные штаммы Bacillus subtilis, способные к сверхсинтезу рибофлавина. Штаммы Bacillus subtilis являются более технологичными и продуктивными по сравнению с культурами, использованными ранее. В последние годы высокопродуктивные рекомбинантные штаммы Bacillus subtilis были созданы в Институте генетики и селекции промышленных микроорганизмов (ГНИИгенетика).

Целью данной работы явилось изучение закономерностей роста и продукции рибофлавина штамма Bacillus subtilis — специализированного продуцента витамина В₂. Изучали культуру Bacillus subtilis при периодическом выращивании.

3. УСЛОВИЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ

В качестве продуцента рибофлавина в работе используется рекомбинантный штамм Bacillus subtilis Y51. Штамм содержит автономно реплицирующуюся плазмиду, несущую рибофлавиновый оперон В. subtilis и селективный маркер Ег г .

Посевной материал выращивали в жидкой среде LB при 37° и интенсивном перемешивании.

Ферментационная среда включает в качестве ростовых факторов пекарские дрожжи— 20 г/л, кукурузный экстракт- 6,2 г/л, а кроме того, сахарозу— 30 г/л; MgS0₄— 0,6 г/л; (NH)₄S0₄— 5 г/л; КН₂PO₄— 0,75 г/л; К₂НPO₄ — 2,5 г/л.

В течение процесса культивирования в ферментер подается подпитка, содержащую сахарозу (36%).

Скорость подпитки составляет 3,0 мл/ч при начальном объеме культуральной жидкости 300 мл.

Парциальное давление кислорода поддерживают в диапазоне 30-60%, изменяя частоту вращения мешалки (600-1100 об/мин) при постоянной аэрации (0,3 л/мин).

Культивирование проводится при 37°. Значение рН 7,2±0,2 поддерживали 6%-ным раствором (NH)₄OH и 5%-ным раствором H₂S0₄.

Концентрацию рибофлавина в культуральной жидкости определяют спектрофотометрическим методом.

Для определения абсолютно сухой биомассы (АСБ), последнюю отделяют от культуральной жидкости путем центрифугирования в градиенте концентрации сахарозы и глицерина. Разработанный метод позволяет с точностью не менее 5% определять концентрацию биомассы свыше 1,5 г/л в сложных по составу средах, содержащих нерастворимые компоненты (дрожжи, кристаллы рибофлавина и так далее).

4. ХАРАКТЕРИСТИКИ ПРОЦЕССА

На рис. 2 приведены данные, касающиеся типичного процесса ферментации штамма Bacillus subtilis.

Рис. 2 Концентрация биомассы и рибофлавина в зависимости от времени культивирования

Процесс проводили с принудительной подпиткой, которую начинали подавать после 6 часов культивирования с постоянной скоростью (3 мл/ч). Приведены концентрации биомассы (АСБ) и рибофлавина в зависимости от времени культивирования. Как видно из графиков на рис. 2, процесс разбивается на три ярко выраженных этапа:

1. Лаг-фаза (0—3 часа), при которой отсутствует как рост, так и сколько-нибудь значительный синтез рибофлавина;

2. Фаза экспоненциального роста (6—16 часов), в ходе которого рибофлавин синтезируется со значительной скоростью;

3. Стационарная фаза, в течение которой рост практически отсутствует, а скорость синтеза рибофлавина в ходе культивирования существенно снижается (16— 116 часов).

4.1ЭКСПОНЕНЦИАЛЬНАЯ ФАЗА РОСТА

На рис. 3 в полулогарифмическом масштабе изображены зависимости концентрации биомассы и рибофлавина от времени культивирования в экспоненциальной фазе роста. Как видно, концентрация рибофлавина (как и биомасса) экспоненциально возрастает с ростом времени культивирования.

Рис. 3 Концентрация биомассы (АСБ) и рибофлавина в экспоненциальной фазе роста в зависимости от времени культивирования; r- коэффициент корреляции

Рассмотрим рост культуры на среде с сахарозой в качестве основного источника углерода. Рост и синтез рибофлавина может быть описан следующим образом:

где t — время культивирования, ч; X — концентрация биомассы, г/л; R — концентрация рибофлавина в ферментере, г/л; S — концентрация сахарозы в ферментере, г/л; S_OP — концентрация сахарозы в подпитке, г/л; F — скорость подачи подпитки, мл/ч; V — объем культуральной жидкости, мл; — выход биомасса на единицу массы потребленного субстрата (сахарозы). г/г; — коэффициент конверсии, г/г; µ — удельная скорость роста, ч -1 ; q_R —удельная скорость синтеза рибофлавина, ч -1 .

В экспоненциальной фазе роста удельная скорость роста µ= 0,26 ч -1 = constant, а удельная скорость синтеза рибофлавина q_R = 0,29 ч -1 = constant.

В этом случае рост концентрации биомассы (X) описывается как:

Для концентрации рибофлавина R:

Интегрируя уравнение (1) получим:

Для вычислений в качестве исходных использованы следующие значения параметров: t₀ = 6 ч — время лаг- фазы; S₀ = 30 г/л — концентрация сахарозы в исходной среде; S_OP= 360 г/л — концентрация сахарозы в подпитке; F = 3 мл/ч — скорость подачи подпитки; V₀ = 300 мл — первоначальный объем культуральной жидкости; Х₀ = 1,5 г/л — начальная концентрация биомассы; R₀ = 0,03 г/л — начальная концентрация рибофлавина; = 0,4; = 0,045.

На рис. 4 приведены зависимость остаточной концентрации сахарозы, рассчитанная по уравнению (6), и экснерименгальные значения данной величины. Как видно, имеется вполне удовлетворительное соответствие расчетной величины с экспериментальными данными на экспоненциальном участке кривой роста.

4.2 СТАЦИОНАРНАЯ ФАЗА РОСТА

В стационарной фазе роста µ = 0. следовательно,

Предполагая, что изменение остаточной концентрации сахарозы мало (что по нашим данным соответствует действительности), а коэффициент конверсии Y_RS = constant, имеем = 0.

R_0l — концентрация рибофлавина в ферментере по завершении экспоненциальной фазы роста (1,8 г/л в нашем эксперименте).

Положим, = 0,1 = constant в течение стационарной фазы роста.

На рис. 5 представлены экспериментальная и рассчитанные по формулам (5) и (7) кривые зависимости концентрации рибофлавина от времени культивирования.

Рис. 5. Экспериментальная и теоретическая кривые зависимости продукции рибофлавина от времени культивирования

Как видно, на участке 6—50 ч культивирования наблюдается вполне удовлетворительное совпадение кривых. Однако к 72 ч расхождение экспериментальной и расчетных величин становится значительным (12,1 г/л в эксперименте против расчетной величины 16,5 г/л).

Последнее можно интерпретировать как снижение коэффициента конверсии на последней стадии культивирования клеток. Причины последнего неясны. Не исключено, например, что в процессе культивирования в среде накапливаются вторичные метаболиты, угнетающие синтез рибофлавина.

4.3 ВЫХОД РИБОФЛАВИНА ОТ СУБСТРАТА (Коэффициент конверсии)

Оценка выхода рибофлавина в расчете на потребленную сахарозу (коэффициент конверсии) является важной для выработки стратегии культивирования продуцентов рибофлавина.

Расчет искомой величины в стационарной фазе роста достаточно прост, поскольку в данном случае сахароза на рост биомассы не используется (расход на поддержание мы не учитываем за его малостью). Кроме того, остаточная концентрация сахарозы в культуральной жидкости в стационарной фазе роста пренебрежимо мала. Учитывая вышесказанное, средний коэффициент конверсии в промежутке времени t_n м t_n-1) можно рассчитать из следующего соотношения:

Где — концентрация рибофлавина и объем культуральной жидкости в моменты времени , соответственно.

Несколько сложнее рассчитать в логарифмической фазе роста, поскольку часть сахарозы здесь идет на рост биомассы.

В нашем случае = 0.42 (здесь приводится усредненная величина по времени на участке 6—14,5 часов), а величину можно определить из соотношений (2)—(3), переписав их в виде:

Учитывая, что dR = dX, имеем: , отсюда , или, используя уравнение (9),

На рис. 7 приведены расчетные значения выхода рибофлавина на единицу массы потребленной сахарозы. Расчеты были выполнены для логарифмической фазы (6—15 часов), исходя из соотношения (10), а для стационарной фазы (19—116 часов) использовано соотношение (8).

Рис. 7 Зависимость выхода рибофлавина по сахарозе (Коэффициент конверсии) от времени культивирования

Как видно, обсуждаемая зависимость имеет достаточно острый максимум в районе 19—24 ч, где выход достигает значения 0,16.

Этот участок соответствует концу логарифмической фазы и началу стационарной.

Таким образом, в наших условиях максимальная скорость синтеза рибофлавина имеет место в логарифмической фазе роста (q_R = 0,29 ч -1 ), при этом концентрация рибофлавина в ферментере растет экспоненциально. Переход в стационарную фазу роста сопровождается снижением удельной скорости синтеза рибофлавина.

На рис.7 приведена зависимость удельной скорости роста рибофлавина q_R от времени культивирования.

Рис. 7 Зависимость удельной скорости синтеза рибофлавина q_R от времени культивирования

Как видно из графика, величина q_R снижается с 0,29 ч -1 (6—16 ч) до 0,003 ч -1 за 96 ч культивирования.

Логарифмическая фаза роста характеризуется низкой эффективностью утилизации субстрата (сахарозы): выход рибофлавина по сахарозе на данном этапе составляет 3—5%, переход к ранней стационарной фазе приводит к значительному повышению выхода до 15—16% и существенному снижению скорости синтеза рибофлавина (см. рис. 6). В ходе стационарной фазы выход рибофлавина вновь снижается, достигая в поздней стационарной фазе значений 4—6%.

Рибофлавин — содержится в клетках различных микроорганизмов, будучи коферментом в составе флавопротеинов (прежде всего — соответствующих ферментов из класса оксидоредуктаз — ФМН, ФАД). Поэтому в качестве продуцентов рибофлавина (флавопротеинов) могут быть бактерии, дрожжи и нитчатые грибы. Однако наиболее заманчивыми являются те штаммы, которые образуют на жидких средах 0,5 г и более рибофлавина в 1 л среды. К подобным организмам относятся Bacillus subtilis, Eremothecium ashbyii и Candida guilliermondii. Учитывая изменчивость активных продуцентов названных видов по способности синтезировать витамин В2, необходим систематический отбор культур в процессе их эксплуатации на производстве. Обычно активные продуценты первых двух видов формируют яркооранжевые колонии на агаризованных средах. Методами генной инженерии удалось получить штамм сенной палочки, образующий около 6 г рибофлавина в 1 л среды, включающей мелассу, белково-витаминный концентрат и его гидролизат.

Высокий выход рибофлавина у Bacillus subtilis коррелирует с азотом пуринов и другими азотистыми источниками, содержание которых должно быть достаточным. В качестве источников углерода применяют глюкозу или сахарозу, практикуют использование дрожжевого и кукурузного экстрактов, соевой муки, масла (жира). Жидкие питательные среды для получения инокулюма и для основной ферментации могут несколько различаться между собой. Например, для получения посевного материала известна среда, содержащая сахарозу, пептон, кукурузный экстракт, калия дигидрофосфат, магния сульфат, подсолнечное масло, время выращивания продуцента на этой среде — 2 суток при 27-30 С О (в зависимости от штамма). Ферментационная среда обычно включает кукурузную и соевую муку, сахарозу, кукурузный экстракт, калия дигидрофосфат, кальция карбонат, натрия хлорид и ненасыщенный жир.

Обычно ферментацию проводят в течение 5 суток при рН 5,5- 7,7. После использования сахарозы (примерно через 30 часов) начинает заметно накапливаться витамин В2, вначале — в мицелии, а затем — в культуральной жидкости. Всю биомассу можно подвергнуть высушиванию и полученный сухой продукт с остаточной влажностью 8%, содержащий 1,5-2,5% рибофлавина, 20% белка, тиамин, никотиновую кислоту, пиридоксин, цианкобаламин, микроэлементы и другие вещества.

В случае высоких выходных показателей по рибофлавину, витамин можно выделять в индивидуальном состоянии и, наряду с синтетическим рибофлавином, использовать в медицине.

5.1 ПРИГОТОВЛЕНИЕ ПОСЕВНОГО МАТЕРИАЛА

Лабораторный этап заключается в приготовлении рабочего посевного материала. Для этого исходный штамм Bacillus subtilis, сохраняемый в состоянии анабиоза (высушенный на стерильной почве, песке, пшене путем лиофилизации или сублимационной сушки) оживляют добавлением стерильной жидкой питательной среды, а затем высевают на уплотненную питательную среду и проверяют на чистоту культуры. После оживления проводят пересев штамма на среду возрастающих объемов, переходя постепенно от пробирок к колбам (емкостью 1л), бутылям (емкостью 20 л). При этом следует соблюдать соотношение посевного и рабочего объемами 1:10. Коэффициент заполнения емкостей не должен превышать 0,5 — 0,6.

5.2 ПРОИЗВОДСТВЕННЫЙ ЭТАП

Дальнейшую подготовку посевного материала осуществляют в ферментаторах — инокуляторах, в которых наращивают посевной материал (рис.8). При этом культуру доводят до середины лаг — фазы (когда клетки делятся синхронно). Рабочую культуру подают в инокулятор, заполненный стерильной питательной средой, из расчета 8-10% к объему питательной среды. Во избежание утечки посевного материала в инокуляторах и биореакторах следует поддерживать избыточное давление.

Инокулятор должн отвечать следующим основным требованиям: конструктивные простота, удобство и надежность эксплуатации. Общий объем ферментатора заполняют инокулированной средой на 70 — 80%, 20-30% объема заполняют воздухом, так как культура аэробна.

Микроорганизм в виде суспензии подают из инокулятора в промышленный биореактор, в котором содержится стерильная жидкая питательная среда. При этом не должно произойти попадания каких-либо посторонних микробов в питательную среду вместе с продуцентом. Все соединения системы должны быть герметично закрытыми.

Стерильную питательную среду засевают с соблюдением правил асептики через запорно-регулирующее устройство (рис.9) с посевным материалом, выращенным в лаборатории, поддерживая оптимальный режим в аппарате (температуру, аэрацию и перемешивание) для развития культуры.

Рис.9 Запорно-регулирующее устройство в системе трубопроводов для засева промышленного ферментатора (2) из инокулятора (1); 3-10 — клапаны; 11 — ловушки конденсатора; АБ — отрезок трубопровода

Рис.8 Инокулятор: 1 — корпус; 2 — лаз; 3 — смотровое окно; 4 — аэратор; 5 — труба для перепуска посевной культуры в ферментатор; 6 — диффузор; 7 — рубашка; 8 — гильза для термометра; 9 — розетка аэратора; 10 — 12 — штуцера для манометра, гильзы термометра и трубы для передавливания; 13 — 17 — штуцера для загрузки среды, аэратора, выхода воздуха, отбора проб и выхода воды; 18 — штуцер для спуска жидкости

Последовательность операций стерилизации: открывают клапаны 4 и 7 (клапан 3 закрыт) и стерилизуют участок трубопровода АБ паром под давлением 1,055 кг/см 20 мин; конденсат собирают в ловушках 11; закрывают клапаны 7, 8, 9, 10 и открывают клапаны 4, 5, 6; ферментатор охлаждают под давлением очищенного стерильного воздуха, стерильная среда заполняет соединительный трубопровод; повышают давление в посевном аппарате до 0,7 кг/см 2 при его снижении в ферментаторе до 0,14кг/см , открывают клапан 3 и посевной материал переводят в ферментатор, после чего отключают инокулятор-ферментатор от системы подачи пара, закрыв клапаны 3 и 6; открывают клапаны 7 и 8, спускают пар и конденсат при частично открытых клапанах 4 и 5.

При достижении требуемых стадий развития и количества биомассы посевной материал передавливают стерильным сжатым воздухом по посевному коллектору в посевной аппарат большей вместимости.

На второй ступени выращивания посевного материала стремятся получать больше биомассы клеток, чтобы в ферментаторе можно было создать необходимую для данного штамма продуцента исходную плотность популяции. Если это требование выполнимо без второй ступени, то ферментационную среду засевают непосредственно из инокулятора.

Все ферментаторы цеха соединены между собой несколькими коллекторами: посевным, благодаря которому можно засевать среду в любом ферментаторе из любого посевного аппарата; коллектором подачи стерильной питательной среды; коллектором подвода стерильного сжатого воздуха к индивидуальным фильтрам; коллектором отработанного воздуха, выходящего из ферментатора; коллектором перекачивания культуральной жидкости из ферментатора. В случае проведения ферментаций в заведомо нестерильных условиях питательную среду и воздух для аэрации не стерилизуют, но посевной материал всегда выращивают на стерильных питательных средах в асептических условиях.

При микробиологическом синтезе рибофлавина используют ферментаторы периодического действия из групп ФЖГ (рис.10). Его конструкция обеспечивает стерильность ферментации в течение длительного времени (несколько суток) при оптимальных условиях для роста и жизнедеятельности продуцента.

Как видно из рисунка, это цилиндрический вертикальный аппарат со сферическим днищем, снабженный аэрирующим, перемешивающим и теплопередающим устройствами. Воздух для аэрации поступает в ферментатор через барботер, установленный под нижним ярусом мешалки.

Рис.10 Ферментатор периодического действия: 1- турбинная трехъярусная мешалка, 2 — охлаждающий змеевик, 3 — секционная рубашка, 4 — отражательная перегородка, 5 — барботер, П-пар; I -XI — материальные и вспомогательные трубопроводы с запорно-регулирующими устройствами (I — посевная линия, II -подача стерильного сжатого воздуха, III — подача пара, IV — удаление отработанного воздуха, V — загрузочная линия, VI — линия введения добавок, VII — подача пеногасителя, VIII — подача моющего раствора, IX — пробоотборник, X — выдача продукта, XI — выдача в канализацию через нижний спуск)

К концу процесса ферментации образуется около 5 — 6 г рибофлавина в 1 л питательной среды. Рибофлавин в культуральной жидкости находится в виде желтых кристаллов, которые легко отделяются центрифугированием.

5.3 УТИЛИЗАЦИЯ ОТХОДОВ

Все отходы биотехнологических производств подлежат анализу на содержание патогенных микробов. Нетоксичные сухие остатки используются либо в качестве кормовых добавок, либо для приготовления компоста, получения биогаза при метановом брожении. При метановом брожении почти все органические вещества (кроме лигнина) с помощью микроорганизмов преобразуются до метана и углекислоты.

Метан используют в виде топлива, углекислоту — в виде сухого льда. Оставшийся плотный осадок после брожения представляет собой органическое вещество, содержащее гумусовые вещества, которые используют в качестве органического удобрения.

В работе был описан наиболее рациональный метод производства рибофлавина культивированием Bacillus subtilis. Описаны наиболее благоприятные условия, среда и технологическое оборудование для получения высокого выхода витамина.

7. СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

1. Бреслер С.Е., Калинин B.Л., Кривичский B.C., и др. Генетика.1969. -М.: Мир-138 с.

2. Громова Н.Ю., Косивцов Ю.Ю., Сульман Э.М. Технология синтеза и биосинтеза биологически активных веществ: Учебное пособие. Тверь: ТГТУ, 2006. -84 с.

3. Соколов А.К., Гучько М.А., Жданов В.Г. Новый микробиологический способ биосинтеза рибофлавина. Результаты и перспективы научных исследований по биотехнологии и фармакологии. Тез. докл. -М.: Мир, 1989.- 22С.

4. Перт С. Дж.. Основы культивирования микроорганизмов и клеток. -М.: Мир, 1978. -331 с.

Размещено на Allbest

Подобные документы

Значение витамина С для организма человека. Строение и физико-химические свойства аскорбиновой кислоты, химическая схема производства. Характеристика стадий технологической схемы производства аскорбиновой кислоты. Выбор рационального способа производства.

курсовая работа [2,9 M], добавлен 12.12.2010

Описание технологической схемы производства и автоматизация технологического процесса. Материальный баланс установки. Организация основного и вспомогательного производства. Расчет материального баланса технологической установки производства метанола.

дипломная работа [362,8 K], добавлен 18.05.2019

Исходное сырье для производства этилового спирта и способы его получения. Физико-химическое обоснование основных процессов производства этилового спирта. Описание технологической схемы процесса производства, расчет основных технологических показателей.

курсовая работа [543,6 K], добавлен 04.01.2009

Характеристика химического продукта и методы его получения. Физико-химические основы процесса, описание технологической схемы, отходы производства и проблемы их обезвреживания. Перспективы совершенствования процесса получения химического продукта.

курсовая работа [2,1 M], добавлен 20.06.2012

Исследование технологического процесса производства серной кислоты как объекта управления. Физико-химические основы получения продукта, описание схемы производства и выбор обоснования параметров контроля и управления уровня в сборниках кислоты.

реферат [752,4 K], добавлен 25.03.2012

Разработка и внедрение синтетических методов производства витаминов в СССР. Промышленный способ получения кислоты аскорбиновой. Синтез ретинола (витамин А) ацетат и ретинола пальмитат. Механизм образования кальциферолов. Варианты синтеза тиамина.

реферат [2,5 M], добавлен 20.05.2011

Титан как металл, элемент IV группы Периодической системы, его физические и химические свойства. Описание технологической схемы производства в металлургическом цехе. Восстановление тетрахлорида титана магнием. Расчет конструкционных размеров аппарата.

курсовая работа [142,2 K], добавлен 14.11.2013

Источник