Питательные среды характеристика основные способы приготовления

Питательная среда

Питательная среда – жидкий, полужидкий или плотный субстрат, используемый для выращивания микроорганизмов (грибов, бактерий и прочее) в лабораторных и производственных условиях [4] .

Содержание:

При культивировании микроорганизмов важно создать оптимальные условия для их роста. Одним из основных факторов успешного культивирования является состав и свойства питательной среды. Универсальной питательной среды, пригодной для роста и развития всех без исключения микроорганизмов не существует, поскольку конструктивные и энергетические процессы микробов различны [3] [1] .

Питательные среды

1. Жидкая питательная среда (мясо-пептонный бульон или МПБ) [2] .; 2. Полужидкая среда (мясо-пептонный желатин или МПЖ) [2] .; 3. Плотная питательная среда (мясо-пептонный агар или МПА) [2]

Виды питательных сред

По составу питательные среды делят на:

1. Синтетические – представляют собой водные растворы химически чистых соединений в установленных дозировках. Состав таких питательных сред полностью известен, но используются они для немногих видов нетребовательных к питанию микроорганизмов [1] .
2. Натуральные или естественные – состоят из продуктов животного или растительного происхождения. Химический состав таких сред сложен и точно не определен. К ним относят мясопептонный бульон и агар, солодовое сусло, сусло-агар, обезжиренное и гидролизованное молоко, отвары овощей [1] .

По целевому назначению питательные среды делят на:

1. Основные – применяются для выращивания многих бактерий. К ним относят мясопептонный бульон (МПБ), триптические гидролизаты рыбных, мясных продуктов, казеина. Основные среды служат для приготовления сложных питательных сред. К ним добавляют молоко, сахар, кровь и прочие ингредиенты [1] .
2. Селективные (избирательные) – предназначены для выделения и накопления микроорганизмов определенных видов или групп из объектов, содержащих разнообразную микрофлору. Сопутствующие микробы или совсем не растут на селективных средах или развитие их сильно подавляется. Разработка таких питательных сред основывается на биологических особенностях конкретных микроорганизмов, отличающих их от многих других [1] .
3. Дифференциально-диагностические – позволяют быстро устанавливать и отличать группы микроорганизмов друг от друга. Их состав подбирается с расчетом четкого выявления характерных свойств конкретного вида. Во многих случаях это достигается введением в среды специальных красителей-индикаторов, окрашивающих колонии определяемых микробов в конкретные цвета [1] .

По физическому состоянию питательные среды делят на:

1. Жидкие (бульоны) – используют для накопления биомассы микробов, продуктов их метаболизма, а так же для выявления физиолого-биохимических особенностей микроорганизмов [1] .
2. Полужидкие – питательные среды, содержащие от 0,08 до 0,7% агара [1] .
3. Плотные – готовятся из жидких питательных сред, путем добавления желирующих веществ – агара или желатина (1,5–2,0%). Данные вещества при растворении в горячей воде формируют коллоидный раствор, дающий при охлаждении плотный гель (студень). Студеобразные среды возможно расплавить при помощи нагревания. Плотные среды используют для выделения чистых культур микроорганизмов: в диагностических целях, для количественного учета микроорганизмов, определения протеолитической и антагонистической активности [1] .
4. Сухие – выпускаются специализированными предприятиями, используются в микробиологических целях. Перед использованием в них добавляют воду и стерилизуют [1] .

Культура бактерии Xanthomonas axonopodis

Селективная питательная среда [5]

Требование к питательным средам

Для культивирования микроорганизмов используют различные по составу питательные среды. Но все они должны соответствовать ряду общих требований:

• содержать полный набор веществ необходимых для питания, выращиваемого микроорганизма, в легко усвояемой форме;
• обладать оптимальной влажностью, вязкостью, кислотностью среды (pH);
• быть изотоничными ( с осмотическим давлением равным осмотическому давлению внутри клетки);
• по возможности – быть прозрачными [3][1] .

Основные компоненты любой питательной среды – источники азота и углерода. Их количественное отношение является определяющей характеристикой большинства сред [3] .

Автотрофные микробы требовательны к наличию углекислого газа, поскольку его концентрация в воздухе составляет только 0,03 %. Для обеспечения питательных сред углекислым газом вносят обычно карбонат кальция (СаСО₃), иногда – гидрокарбонат натрия (NaHCO₃), либо другие карбонаты. В некоторых случаях через среду продувают воздух, искусственно обогащенный углекислым газом до 1–5% [3] .

Гетеротрофные организмы успешно развиваются на средах, содержащих источники углерода в виде органических соединений. В зависимости от индивидуальных особенностей гетеротрофные микроорганизмы используют разнообразные органические соединения – спирты, органические кислоты, углеводы, углеводороды, ароматические соединения. Обычно в лабораторной практике в качестве источника углерода применяют глюкозу, поскольку именно это соединение углерода легче всего утилизируется микробами [3] .

Потребности в источниках азота удовлетворяются азотосодержащими соединениями, с разной степенью восстановленности азота. В основном, это соли аммония, вносимые в питательную среду в форме сульфатов и хлоридов. При использовании этих веществ необходимо учитывать их высокую физиологическую кислотность, влияющую на кислотность среды и развитие микроорганизмов. Кроме того, потребность в азоте удовлетворяется нитратами. Нитриты используются очень редко, поскольку токсичны для многих микроорганизмов [3] .

Не маловажными для построения веществ микробной клетки являются соединения фосфора, серы, калия, магния, кальция и других элементов, которые так же должны содержаться в питательной среде в доступной форме. Их потребность удовлетворяется за счет минеральных солей [3] .

Потребность в сере удовлетворяются сульфатами. В фосфоре – солями фосфорной кислоты. Все необходимые металлы и прочие элементы – в форме катионов или анионов неорганических солей. В частности, источник магния – сульфат магния (MgSO₄), натрия – хлорид натрия или поваренная соль (NaCl), кальция – хлорид кальция (CaCl₂) или карбонат кальция (CaCO₃).

Для нормального развития микробов, в том числе бактерий, необходимы так называемые факторы роста (аминокислоты, азотистые основания, витамины, жирные кислоты, железоприны и многие другие соединения). Их добавляют в питательные среды в значительно меньшем количестве, чем макроэлементы [3] .

Потребность в нескольких аминокислотах удовлетворяют, добавляя гидролизат белка. Для его получения используют белки животного или растительного происхождения. В первом случае это мясо, рыба, желатин, казеин. Во втором – семена сои, подсолнечника, кукурузы. Источником аминокислот могут служить клетки микроорганизмов – дрожжи, водоросли, бактерии [3] .

Гидролиз проводится с использованием протеолитических ферментов, кипячением крепких щелочей или минеральных кислот. Некоторые натуральные вещества (дрожжевой или кукурузный экстракт) содержат несколько факторов роста (минеральные соли, витамины, аминокислоты) [3] .

Использование питательных сред

Питательные среды используются для:

• выделения чистых культурбактерий из биогенных и абиогенных объектов;
• для определения культуральных и ферментативных свойств микробов;
• для определения устойчивости микробов к химическим, биологическим и физическим факторам;
• для накопления микробной биомассы и продуктов биосинтеза;
• для хранения музейных культур [4] .

Источник

ГК «Униконс»

Продвижение и реализация комплексных пищевых добавок, антисептиков и др. продукции.

«Антисептики Септоцил»

Септоцил. Бытовая химия, антисептики.

«Петритест»

Микробиологические экспресс-тесты. Первые результаты уже через 4 часа.

«АльтерСтарт»

Закваски, стартовые культуры. Изготовление любых заквасок для любых целей.

• Вы здесь:
• Библиотека технолога
• Пиво и напитки
• Г.С. Качмазов — Дрожжи бродильных производств

6. ПИТАТЕЛЬНЫЕ СРЕДЫ

6.1. СРЕДЫ ОБЩЕГО НАЗНАЧЕНИЯ

Учитывая отраслевые сырьевые особенности, в качестве основного компонента питательных сред может быть использовано зерновое, виноградное, плодово-ягод­ное или мелассовое сусло. Однако наиболее универсаль­ным и сбалансированным следует признать солодовое неохмеленное сусло с содержанием 8–10% СВ.

6.1.1. СОЛОДОВОЕ СУСЛО

Для приготовления сусла в лаборатории используют ячменный солод крупного помола с высокой осахаривающей способностью. В 1 л воды вносят 250 г солода и нагре­вают до 50°С. Через 30 мин температуру повышают до 55°С, а еще через 30 мин постепенно поднимают до 62,5–63°С. При этой температуре выдерживают до исчезнове­ния реакции на крахмал (йодная проба).

Полученное сусло отделяют от дробины путем фильт­рации через марлю и вату, раз­бавляют водой до нужной концентрации, разливают по колбам и стерилизуют при 112°С 30 мин. Если рН ниже 5,5, то сусло подщелачива­ют 10%-ным раствором соды или едкого кали до получе­ния рН 5,6–6,0. Полученное таким образом сусло жела­тельно очистить от примесей кизельгуром или отстаива­нием в холодильнике и фильтрацией через бумажный фильтр.

В отсутствие солодового вполне применимо зерновое сусло, осахаренное комплексом ферментных препаратов с обязательным внесением дрожжевой золки и 0,3–0,5% дрожжевого автолизата перед автоклавированием[1].

Для приготовления жидкой питательной среды осахаренное и отфильтрованное сусло разливают в колбы или пробирки на 1/2–3/4 объема, закрывают ватно-марлевыми пробками и автоклавируют 20 мин при 0,1 МПа.

6.1.2. МЕЛАССОВОЕ СУСЛО

Густую мелассу отвешивают на технических весах в количестве 200–300 г, смешивают с водой в соотношении 1:3 и нагревают до 75°С, затем насыпают 4% суперфосфата и повышают температуру до 85°С при постоянном помеши­вании. 33%-ный раствор едкой щелочи в количестве 0,8% по объему к исходной мелассе разводят в 30–50 см 3 воды, до­бав­ляют к нагретой мелассе и хорошо перемешивают. В результате происходит выпадение осадка трикальцийфосфата, который увлекает за собой коллоиды мелассы и бо­лее крупные частицы, осадок быстро оседает на дно, и ме­ласса осветляется. После этого к мелассе добавляют 2,5% сернокислого аммония и 2% суперфосфата в виде вытяж­ки (1 г суперфосфата и 10 см 3 воды нагревают до кипения и фильтруют через бумажный фильтр). Мелассу перемеши­вают с питательными солями и фильтруют через бумаж­ный фильтр, лучше под вакуумом на воронке Бюхнера.

Осветленную мелассовую среду разводят водой до тре­буемой концентрации 5–8% СВ по сахарометру и разли­вают в колбы, пробирки или бутылки; для приготовления твердых питательных сред добавляют агар.

Мелассовое сусло стерилизуют в автоклаве при избы­точном давлении 0,05 МПа 30 мин или в аппарате Коха при 100°С в течение 1 ч трое суток подряд.

В химическом стакане в сусло (8–10% СВ) внести не­обходимое количество агар-агара (2,5 г на 100 см 3 ) и вы­держать 10–15 мин, не перемешивая до полного его увлажнения. Стакан поставить на слабый огонь и, постоян­но перемешивая, довести до кипения. Содержимое стака­на перелить в колбу до 1/2 объема, закрыть ее ватно-марлевой пробкой и автоклавировать 20 мин при 0,1 МПа.

Если питательная среда не требует внесения каких-либо термолабильных ингредиентов, то ее можно сразу после автоклавирования разливать в заранее приготов­ленные стерильные высушенные чашки Петри. Если же предполагается внесение антибиотиков, факторов роста или других чувствительных к температуре компонентов, то среду в колбе необходимо остудить до 40–45°С, сте­рильно внести нужные компоненты, перемешать и раз­ливать в чашки Петри. При этом желательно избегать образования комков для получения ровной поверхности питательной среды в чашках. После этого чашки со сре­дой не следует более перемещать, пока агар полностью не остынет. ***

Чтобы удалить образовавшийся конденсат и уменьшить его дальнейшее образование, чашки необходимо подсу­шить. Для этого чашки с агаром переворачиваются крыш­кой вниз, дно чашки с агаром извлекается и ставится на ребро крышки. В таком положении в боксе под УФ-лампой чашки выдерживаются ≈60 мин. Высушенные чашки закрываются и могут использоваться для работы либо хра­ниться в холодильнике завернутыми в полиэтиленовый пакет, чтобы исключить пересыхание или случайное об­семенение среды. Чашки, хранившиеся в холодильнике, перед работой следует некоторое время выдержать при комнатной температуре или в термостате.

6.1.4. СКОШЕННЫЙ СУСЛО-АГАР

Для приготовления скошенного сусло-агара доведен­ную до кипения среду (см. пп. 6.1.3) разливают в пробир­ки до 1/3 ее объема, закрывают ватно-марлевыми пробка­ми и автоклавируют 20 мин при 0,1 МПа. По окончании стерилизации пробирки с горячей средой раскладывают на наклонной поверхности для образования скоса нужной высоты и дают полностью застыть. Остывшие пробирки переносят в штатив и используют по назначению.

6.1.5. ПОЛУЖИДКИЙ СУСЛО-АГАР

В химическом стакане в сусло (8–10% СВ) внести не­обходимое количество агар-агара (0,5 г/100 см 3 ) и вы­держать 10–15 мин, не перемешивая до полного его ув­лажнения. Стакан поставить на слабый огонь и, посто­янно перемешивая, довести до кипения. Содержимое стакана разлить в пробирки до 1/3–1/2 объема, закрыть ватно-марлевыми пробками и автоклавировать 20 мин при 0,1 МПа.

По окончании стерилизации пробирки раскладывают вертикально в штатив и после полного их охлаждения ис­пользуют по назначению.

6.1.6. АЦЕТАТНАЯ СРЕДА ДЛЯ ВЫДЕЛЕНИЯ ПОСТОРОННИХ ДРОЖЖЕЙ

На 1000 см 3 водопроводной воды берут 10 г уксуснокис­лого натрия, 10 г хлористого аммония и 5 г глюкозы.

Дрожжевой автолизат добавляют в среду в количестве 3 см 3 .

Среду разливают в пробирки по 5 см 3 и стерилизуют в автоклаве при избыточном давлении 0,05 МПа в течение 30 мин.

6.1.7. СРЕДА С МОНОЙОДУКСУСНОЙ КИСЛОТОЙ

2%-ный сусло-агар после автоклавирования охлажда­ют до 50°С. В остывшую среду асептически вносят рабо­чий раствор монойодуксусной кислоты до концентрации 2,5% (97,5 см 3 + 2,5 см 3 кислоты). Приготовленную сре­ду тщательно перемешивают и разли­вают в чашки Петри. Конечная рН 5,8.

Посевы исследуемых проб инкубируют не менее 120 ч при 28–30°С.

На данной среде растут дрожжи, не относящиеся к роду Saccharomyces.

Рабочий раствор. В предварительно проавтоклавированную воду внести монойод­уксусной кислоты в количе­стве 7,44 мг на 1,0 см 3 .

К солодовому суслу концентрацией 8–10% СВ при­бавляют 15% желатина и через
30–40 мин, когда жела­тин набухнет, среду подогревают до 40–50°С, фильтруют через ватво-марлевый фильтр и разливают в пробирки или колбы.

Стерилизуют в аппарате Коха при 100°С по 30 мин трое суток подряд.

6.1.9. СРЕДА САБУРО ДЛЯ ВЫРАЩИВАНИЯ ДРОЖЖЕЙ

К 100 см 3 стерильной дрожжевой воды добавляют 5 г пептона, 4 г глюкозы, 1,8 г агара. После того как агар рас­плавится при нагревании, среду фильтруют и разливают в пробирки.

Стерилизуют 20 мин при избыточном давлении 0,05 МПа или в аппарате Коха дробной стерилизацией.

6.1.10. СИНТЕТИЧЕСКАЯ СРЕДА С ЛИЗИНОМ

Рецептура синтетической среды с лизином следующая.

Каждый компонент среды растворяют в воде отдель­но, смешивают в указанном порядке и доводят водопро­водной водой до 1000 см 3 .

В полученную жидкую синтетическую среду вносят агар (2,5%), расплавляют и разливают в пробирки по 10 см 3 . Среду стерилизуют 20 мин при давлении 0,05 МПа.

После автоклавирования пробирки ставят в штатив для получения скошенной среды.

6.1.11. СРЕДА 10 ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ И ПОДСЧЕТА
ЛАКТОБАКТЕРИЙ И ЛЕЙКОНОСТОКА

На 1000 см 3 неохмеленного солодового сусла (8% СВ) или 1000 см 3 дрожжевой воды добавляют 0,05 г MnSO₄·4H₂O, по 0,2 г MgSО₄·7H₂О, цистина или цистеина, Kh₂po₄, цитрата аммония, 2,5 г ацетата натрия, 20 г сахарозы, 10 г пеп­тона и 50 см 3 дрожжевого автолизата.

Каждый компонент среды растворяют в указанном порядке в солодовом сусле (для выращивания лактобактерий) или дрожжевой воде (для выращивания лейконостока). В первом случае рН среды 5,5, во втором – 6,0.

Растворив все компоненты и нормализовав рН, добав­ляют 2,5% агара и стерилизуют троекратно текучим паром.

Перед использованием в расплавленную среду добав­ляют стерильный мел (3% к объему среды), тщательно перемешивают и разливают в чашки Петри.

6.1.12. МОЛОЧНЫЙ АГАР БОГДАНОВА

Используется в качестве среды для выявления и учета гнилостных бактерий.

Обезжиренное молоко разливают в пробирки по 5 см 3 и троекратно стерилизуют текучим паром либо 20 мин при 0,05 МПа. Отдельно готовят 5%-ный водный агар, разли­вают его в пробирки по 4–5 см 3 и стерилизуют 30 мин при давлении 0,1 МПа.

Перед посевом водный агар расплавляют, соединяют с молоком, и смесь выливают в чашки Петри, куда предва­рительно была внесена исследуемая проба.

6.1.13. ВИНОГРАДНОЕ СУСЛО

Сусло помещают в колбу и нагревают до кипения в кипятильнике Коха, после охлаждения отфильтровы­вают от выпавших белковых веществ через бумажный складчатый фильтр и разливают в пробирки по 5 см 3 , стараясь не смочить горлышка, затем в пробирках пас­теризуют.

Предназначается для выращивания дрожжей.

6.1.14. ВИНО С САХАРОМ

В белое сухое вино добавляют 5–10% сахара. После его растворения среду фильтруют и разливают по пробиркам.

Среда используется для посева дрожжей и уксуснокис­лых бактерий.

6.1.15. ВИНО С СУСЛОМ

Среда состоит из виноградного сусла – 1/3 объема, сухого вина – 1/3 и водопроводной воды – 1/3 объема. Среду фильтруют и разливают в пробирки.

Рекомендуется для посева уксуснокислых бактерий.

6.1.16. ВИНОГРАДНОЕ СУСЛО РАЗБАВЛЕННОЕ

Сусло разбавляют водой до содержания сахаров 5%, добавляют 1% автолизата дрож­жей и доводят рН до 5–6 добавлением 1 Н раствора щелочи.

Среда рекомендуется для молочнокислых бактерий.

6.1.17. ЯБЛОЧНОЕ СУСЛО

В свежий или консервированный яблочный сок добав­ляют при необходимости сахар до массовой концентрации 10–12 г/100 см 3 . Концентрация титруемых кислот не долж­на превышать 6–7 г/дм 3 . При излишней кислотности сок разбавляют водой.

Стерилизуют в автоклаве текучим паром или в кипя­тильнике Коха однократно в течение 40–45 мин.

Применяют для культивирования дрожжей.

6.1.18. СМЕСЬ СОЛОДОВОГО СУСЛА С ЯБЛОЧНЫМ

В состав среды входят: солодовое сусло с 5% сухих ве­ществ – 1/2 объема и яблочное сусло – 1/2 объема. Сре­ду осветляют, стерилизуют текучим паром 3 дня подряд по 30 мин.

Предназначается для выращивания молочнокислых бактерий.

6.1.19. КАПУСТНАЯ СРЕДА

200 г измельченной капусты помещают в кастрюлю, заливают 1000 см 3 воды и кипятят в течение 10 мин, за­тем отжимают через двойной слой марли. Полученную жидкость фильтруют и в 2 раза разбавляют водой. К отва­ру добавляют 2% глюкозы и 1% пептона или 25 см 3 соло­дового сусла (10% СВ) и 1,25 см 3 кукурузного экстракта.

Для приготовления среды можно использовать сухую капусту. Измельченную капусту следует сушить в тени при температуре 20–35°С при потоке свежего воздуха. Для приготовления питательной среды 6–8 г сухой капусты кипятят в 1000 см 3 воды. Среду разливают в пробирки высоким столбиком по 5–10 см 3 , стерилизуют в автокла­ве при 121°С в течение 30 мин.

Среда предназначена для накопления и выделения молочнокислых бактерий, с добавлением спирта 0,95 см 3 на 5 см 3 среды.

6.1.20. КАРТОФЕЛЬНАЯ ВОДА

20 г очищенного от кожуры и протертого сырого кар­тофеля добавляют к 1000 см 3 водопроводной воды, настаи­вают 4 ч, кипятят 15 мин, фильтруют через складчатый фильтр, разливают в пробирки по 5 см 3 и стерилизуют при избыточном давлении 0,1 МПа в течение 20 мин.

6.1.21. ДРОЖЖЕВАЯ ВОДА

На 1000 см 3 водопроводной воды берут 80 г прессован­ных дрожжей или 20 г сушеных, смесь кипятят в течение 20 мин, разливают в бутылки и стерилизуют при избыточ­ном давлении 0,1 МПа в течение 30–40 мин.

После отстаивания в течение нескольких дней дрож­жевая муть оседает, а дрожжевая вода становится про­зрачной.

6.1.22. ДРОЖЖЕВОЙ АВТОЛИЗАТ

Вариант 1. Для приготовления можно использовать прессованные или сушеные пекар­ские дрожжи.

200 г прессованных дрожжей размешивают с 100 см 3 водопроводной воды или 100 г сушеных дрожжей с 400 см 3 воды, добавляют поваренной соли в количестве 0,15% к весу прессованных дрожжей и 0,5% к весу сушеных дрож­жей, смесь помещают в термостат при 50–­55°С на 48 ч, затем нагревают до кипения и фильтруют через складча­тый бумаж­ный фильтр, разливают в стеклянную посуду и стерилизуют при избыточном давлении 0,1 МПа в тече­ние 30 мин.

Вариант 2. Прессованные дрожжи заливают равным по массе количеством воды: полу­ченную суспензию кле­ток покрывают тонким слоем толуола и выдерживают трое суток при температуре 60°С, время от времени перемеши­вая. После этого суспензию несколько минут кипятят, дают остыть и с помощью 1 Н раствора КОН доводят зна­чение рН до 6, затем отстаивают. Надосадочная жидкость (дрожжевой автолизат) должна быть прозрачной, ее сли­вают и отфильтровывают через бумажный фильтр на во­ронке Бюхнера под разряжением.

Стерилизуют автоклавированием 20 мин при 112°С.

Таблица 6

Состав основных синтетических сред

6.1.23. СТЕРИЛЬНЫЙ МЕЛ

Имеющийся в продаже мелкоразмолотый мел насы­пают в стерильные пробирки с ватными пробками по 0,3–0,5 г и стерилизуют сухим жаром 1 ч при 170°С.

6.1.24. СТЕРИЛЬНАЯ ВОДОПРОВОДНАЯ ВОДА

Водопроводную воду разливают в пробирки по 10 или 9 см 3 и в колбы по 50 и 100 см 3 , закрывают ватными проб­ками и стерилизуют в автоклаве 30 мин при давлении 0,1 МПа или в аппарате Коха при 100°С по 1 ч трое суток подряд.

6.2. СРЕДЫ НАКОПИТЕЛЬНЫЕ ДЛЯ ДРОЖЖЕЙ

Приготовленные среды автоклавируются при 0,1 МПа в течение 20 мин. Могут использоваться как осно­ва для агаризованных сред.

При необходимости вносятся антибиотики.

Состав и количество ингредиентов накопительных сред показаны в таблице 7.

Таблица 7

Среды накопительные для дрожжей

6.3. СРЕДЫ ДЛЯ АСКОСПОРООБРАЗОВАНИЯ

6.3.1. СРЕДА ГОРОДКОВОЙ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ СПОР У ДРОЖЖЕЙ

Состав среды следующий.

Поваренная соль. 0,5 г

Вода. до 100,0 см 3

Иногда вводят еще 1% мясного экстракта.

Среду нейтрализуют содой (питьевой) до рН 7,3, дово­дят до кипения и кипятят до тех пор, пока не расплавится агар, фильтруют и разливают в пробирки по 5 см 3 .

Стерилизуют при избыточном давлении 0,05 МПа в течение 20 мин.

6.3.2. АЦЕТАТНЫЙ АГАР ФОУВЕЛЛА

На 1000 см 3 дистиллированной воды берут 5 г CH₃COONa·3H₂O и 20 г агара. рН среды должно быть 5–7. Автоклавируют 15 мин при 121°С.

6.3.3. АЦЕТАТНЫЙ АГАР МАК-КЛАРИ

Дрожжевой экстракт. 2,5 г

Дистиллированная вода до 1000,0 см 3

Автоклавируют 15 мин при 121°С.

6.3.4. СРЕДА С ДРОЖЖЕВЫМ ЭКСТРАКТОМ И ГЛЮКОЗОЙ

Дрожжевой экстракт. 5,0 г

Дистиллированная вода. до 1000,0 см 3

Автоклавируют 20 мин при 112°С.

6.3.5. АГАРИЗОВАННАЯ ДРОЖЖЕВАЯ ВОДА

Готовят, добавляя к 1000 см 3 дрожжевой воды 15 г агара.

Автоклавируют 15 мин при 121°С.

6.3.6. СРЕДА СТАРКИ

Водопроводная вода . до 1000,0 см 3

Автоклавируют 15 мин при 112°С.

После стерилизации добавляют 6,0 см 3 этилового спирта.

6.3.7. ОВОЩНОЙ АГАР

Предварительно готовят экстракт овощей путем авто­клавирования 10 мин при 112°С равных частей промытых и мелко нарезанных моркови, сахарной свеклы, огурцов и картофеля в четырех частях воды, после чего экстракт отфильтровывают через ткань, отжимая осадок.

К 1000 см 3 полученного экстракта (4% СВ, рН 6,7) до­бавляют 20 г сухих дрожжей и 20 г агара.

Автоклавируют 15 мин при 121°С.

6.3.8. ГИПСОВЫЕ БЛОКИ

Восемь частей гипса (2CaSO₄·H₂O) смешивают с тремя частями воды и помещают пасту в цилиндрические фор­мы из бумаги или фольги высотой 3–4 см. Поверхность тщательно сглаживают. После застывания блоки освобо­ждают от форм, помещают в вы­сокие чашки и стерилизу­ют при 110–120°С в течение 2 ч. Перед посевом в чашки нали­вают стерильной воды слоем 1 см или раствор, содер­жащий 1% маннита и 0,5% K₂HPO₄.

На средах для спорообразования дрожжи инкубируют при температурах, несколько мень­ших в сравнении с оп­тимальными для вегетативного роста, – в большинстве случаев при 20–25°С.

Время инкубации составляет до 4–6 недель при еже­недельном микроскопировании.

Начинающие исследователи нередко затрудняются отличить аскоспоры от внутриклеточных бесполых спор (эндоспор) или от крупных глобул жира. В таких случаях можно прибегнуть к окраске (см. п. 4.2). Формы спор дрож­жей представлены на рисунке 16.

Рис. 16

Споры дрожжей:

а – споры Saccharomyces; б – споры Debaryomyces или Torulaspora; в – споры Zygosaccharomyces; г – шляповидные споры Ptchla membranaefaclens; д – са-турновидные споры Pichía spp. и Williopsis saturnus; е – бобовидные споры Kluyveromyces marxianus и Schizosaccharomyces spp.

6.4. ОСВЕТЛЕНИЕ СРЕД

Осветленные жидкие, агаризованные или жела­тиновые среды необходимы в диагностических исследова­ниях и для получения хорошо видимых признаков глубин­ного роста и изолированных колоний микроорганизмов.

В ряде случаев прозрачную среду можно получить, от­фильтровав ее от осадка через вату. Когда этого бывает недостаточно, среды осветляют с помощью белков кури­ных яиц. Для осветления 500 см 3 среды достаточно белка одного яйца. Белок тщательно отделяют от желтка и встря­хивают с равным объемом воды до образования густой пены. Взбитый белок выливают в предварительно расплав­ленную и затем остуженную до 45–50°С среду. Перед вне­сением белка проверяют значение рН среды и, если необ­ходимо, среду подщелачивают до рН 7,0–7,3. Среду с бел­ком тщательно перемешивают и прогревают в кипящей водяной бане в течение часа. Белок свертывается и адсор­бирует все взвешенные в среде частицы. Среду быстро от­фильтровывают в горячем виде через вату.

Синтетические агаризованные среды, внесение белка в которые нежелательно, осветляют следующим образом. Среду, налитую в химический стакан, автоклавируют и оставляют после стерилизации в закрытом автоклаве на 10–12 ч. При таком медленном остывании среды все взве­шенные частицы оседают на дно. Застывшую среду извле­кают из стакана, прозрачную часть среды срезают, поме­щают в колбу и вновь стерилизуют.

6.5. ПИТАТЕЛЬНЫЕ СРЕДЫ И УСЛОВИЯ ХРАНЕНИЯ ЧИСТЫХ КУЛЬТУР ДРОЖЖЕЙ

Длительное поддержание чистых культур мик­роорганизмов, без потери активности и производственных качеств, необходимо как при хранении в коллекциях и проведении научно-исследовательских работ, так и при эксплуатации в производстве.

Основной задачей при хранении чистых культур про­мышленных штаммов микро­организмов в музейных кол­лекциях является правильный выбор условий для сохра­нения их производственно ценных свойств. Общей тенден­цией при этом является максимальное замедление всех жизненных процессов, что достигается различными прие­мами. Жизнеспособность клеток при этом должна быть сохранена. Кроме того, способы хранения культур долж­ны быть по возможности менее трудоемки и надежны.

Из-за различий биологических свойств видов невоз­можно использовать с равно­ценными положительными результатами один общий способ хранения для разных культур дрожжей. Большой опыт по хранению культур микроорганизмов, в том числе и дрожжей, накоплен со­трудниками крупных национальных коллекций, в кото­рых имеется возможность проверять и оценивать разные методы хранения применительно к широкому набору дрожжевых организмов.

Наиболее широко применяемый способ – это поддер­жание культур путем их перио­дических пересевов. В пос­ледние два десятилетия получили распространение так­же методы хранения микробных культур под минераль­ным маслом и лиофильная сушка. Так как эти три метода применяются уже много лет, то имеется возможность срав­нительной оценки их пригодности для хранения разных видов дрожжей. Другие, менее широко используемые или недавно разработанные методы можно рекомендовать лишь для проверки с обязательным дублированием культур, ко­торые поддерживаются обычными способами.

6.5.1. ПЕРИОДИЧЕСКИЕ ПЕРЕСЕВЫ

Обычно культуры поддерживают, пересевая их на агаризованных средах в двойной повторности. Одна пробир­ка, которую после засева совсем не открывают, служит кон­трольной, а из второй по мере надобности делают отсевы.

Частота пересевов. Сроки пересевов определяют для большинства культур дрожжей скоростью высыхания сре­ды. Она зависит от температуры и влажности помещения, где хранят пробирки.

Промежутки между пересевами можно увеличить за счет более плотного заку­поривания пробирок и снижения температуры хранения. Так, использование пробирок с завинчивающимися металлическими крышками вместо обычных ватных пробок предохраняет от высушивания, но хуже обеспечивает чистоту сохраняемых культур. При­менение вазелинового масла для снижения скорости вы­сыхания культур также имеет свои недостатки, о чем речь будет идти ниже. Поэтому хорошо сделанные ватные проб­ки (их можно сверху заливать парафином) все же остают­ся лучшим средством закрывания пробирок. Они обеспе­чивают достаточный газообмен, хорошо предохраняют от микроб­ного загрязнения и легко изготовляются.

Ватные пробки, однако, не предохраняют культуры от заражения их микофильными клещами (mites). Для про­филактики используют следующий прием. Перед посева­ми или пересевами культур пробку слегка выдвигают из пробирки и наносят на нее каплю раствора, содержащего 10 г сулемы, 50 см 3 глицерина, 500 см 3 этилового спирта и 450 см 3 воды. Затем пробку вдвигают в пробирку и не­сколько раз проворачивают ее, чтобы смочить внутренние стенки пробирки. В раствор можно добавить какой-либо краситель для контроля равномерности смачивания.

Температура. Если хранение ведется при температуре в пределах 15–20°С, то после пересева пробирки сразу же помещают в коллекционное помещение, за исключением тех культур, которые требуют для роста более высокой температуры. Психрофильные дрожжи выращивают и хранят при 3–4°С в холодильнике. При низкой темпера­туре после появления хорошего роста можно хранить и все другие дрожжи.

Среды. Во многих лабораториях и коллекциях дрож­жи поддерживают и хранят на сусло-агаре. Было показа­но, однако, что на этой сложной среде при длительном хра­нении происходит изменение физиологических свойств, характерных для вида, за счет адаптации или стабилиза­ции мутантов. В связи с этим для хранения более пригод­на среда следующего состава, которую используют для гол­ландской коллекции.

Дрожжевая вода
рН 5,8-6,0. до 100,0 см 3

Для винных дрожжей предложена среда, на которой дрожжи хорошо спорулируют и долго хранятся.

Морковь тертая. 125 г

Вода . 1000 см 3

Настоять 1 ч, довести
до кипения, кипятить 10 мин,
отфильтровать через вату, рН 5.

Пивоваренные дрожжи лучше поддерживать на сус­ло-агаре или среде следующего состава.

Дрожжевой экстракт . 3%

На дрожжевых и спиртовых заводах, работающих на мелассе, для хранения производственных культур лучше использовать среду следующего состава.

Мелассовое сусло 5% СВ. 100 см 3

Солодовое сусло 12% СВ. 100 см 3

Дрожжевой автолизат. 2 см 3

В некоторых коллекциях дрожжи поддерживают в жидких средах (сусло с дрожжевым автолизатом, пепто­ном и глюкозой) с пересевами через 4 мес.

6.5.2. ХРАНЕНИЕ ПОД МИНЕРАЛЬНЫМ МАСЛОМ

Заливка агаровых культур минеральным маслом пре­следует цель задержать высыхание и тем самым увели­чить сроки пересевов.

Для заливки культур дрожжей наиболее пригодно высокоочищенное медицинское вазелиновое масло плотно­стью 0,8–0,9. Масло стерилизуют в автоклаве в течение 1 ч при 121°С, а затем прогревают для удаления влаги в сушильном шкафу при температуре не выше 150°С или выдерживают при комнатной температуре не менее 2–3 дней.

Дрожжи выращивают на сусло-агаре или другой сре­де, выбранной для хранения.

Среду готовят в пробирках таким образом, чтобы стол­бик был достаточно высоким, а скос небольшим.

Через 4–6 суток, когда штрих хорошо сформируется, культуры заливают маслом таким образом, чтобы слой его над верхним краем агарового косяка не превышал 1 см. После заливки культуры хранят в вертикальном положе­нии либо при комнатной температуре, либо в холодиль­нике при 4–6°С.

Пересев дрожжей из-под вазелинового масла произво­дят один раз в год. Для пересевов используют свежие ско­шенные агаризованные среды, на которых культуры хра­нились.

Опыт многих коллекций свидетельствует об успешных результатах этого способа хранения дрожжевых культур. Для винных дрожжей, в частности, было показано, что при хранении под вазелиновым маслом с пересевами даже через 2–4 года они не теряют бродильных свойств и хо­рошо выживают. Имеются указания на сохранение жи­вых клеток дрожжей под маслом до 10 лет и более без пересевов.

К недостаткам этого метода хранения следует отнести следующие:

• при пересевах масло смешивается с инокулятом, и штрихи получаются хуже обычных;
• масло разбрызгивается при обжигании петли, и от этого возникает возможность инфицирования помещения;
• требуется специальная очистка использованных пробирок от масла;
• при стерилизации масла высокими температурами в нем могут образовываться токсичные для дрожжей ве­щества.

С учетом всех преимуществ при достаточном опыте персонала и правильной организации работы в лаборато­рии перечисленными недостатками можно пренебречь. ***

Лиофилизацией называют процесс высушивания под вакуумом из замороженного состояния. Техника лиофилизации и хранения лиофилизированных культур сильно варьи­рует в разных лабораториях. Вариации касаются сред и сроков выращивания, применения суспензионных жидкостей, температуры замораживания, условий хране­ния и восстанов­ления культур.

Дрожжи, подлежащие лиофилизации, выращивают в оптимальных условиях на средах, не слишком обогащен­ных питательными веществами. Для этой цели пригодна среда Сабуро или глюкозопептонная следующего состава.

Мясной и дрожжевой
экстракты по. 0,5 г

Вода. до 100,0 см 3

Дрожжи выращивают и на сусло-агаре. Из 2–5-суточных культур готовят густую суспензию в специальных суспензионных жидкостях, содержащих защитные веще­ства, которые можно разделить на три группы:

• коллоидные среды животного, растительного и ми­нерального происхождения, такие как сыворотка крови, плазма, желатина, снятое молоко, агар-агар, гель гидра­та окиси алю­миния и др.;
• среды с углеводами (чаще всего 10%-ный раствор сахарозы) и продуктами гидро­лиза белков – пептоном и аминокислотами;
• сложные среды, в состав которых входят вещества, образующие как коллоидные, так и истинные растворы.

Хорошие результаты получены в голландской коллек­ции (CBS, г. Дельфт) при использовании в качестве защит­ной среды раствора, содержащего 7,5% инозита, 2% глу­тамата натрия и 5% декстрина. рН такой среды доводят до 7,0 с помощью NaOH.

Ниже приведены 2 варианта сложных защитных сред.

Вариант 1.

Дрожжевой экстракт. 1%

Аскорбиновая кислота. 0,25%

Дистиллированная вода. до 100,0%

Вариант 2.

Бычья сыворотка. 100 см 3

Дистиллированная вода. 200 см 3

Использование 10–20%-ного раствора сахарозы дает хорошую выживаемость сразу после лиофилизации, но при длительном хранении жизнеспособность дрожжей резко снижается из-за высокой остаточной влажности материала.

Важным моментом в процессе лиофилизации являет­ся замораживание суспензии. Для дрожжей при лиофи­лизации обычно применяют охлаждение от –30°С до –70°С, однако температура около –15°С, способствующая медленному замораживанию, дает наилучшие результа­ты. Есть указания также на успешное использование ре­жима быстрого замораживания дрожжей при температу­ре смеси сухого льда и спирта –78°С и сверхбыстрого за­мораживания в жидком азоте при –196°С.

Замороженный материал не должен оттаивать в про­цессе высушивания. Продол­жительность высушивания меняют в зависимости от обрабатываемого материала, его объема, состава защитной среды и используемой аппарату­ры. Чем мельче кристаллы, образовавшиеся при замора­живании, тем быстрее проходит высушивание. Остаточная влажность сказывается на сохранении свойств лиофилизированных дрожжей и на продол­жительности последую­щего их хранения без потери жизнеспособности.

Сразу же после окончания процесса лиофилизации важно определить жизне­способность обработанной куль­туры, а в случае, когда была известна концентрация жи­вых клеток в исходной суспензии, можно установить и процентное отношение оставшихся живыми от начально­го количества клеток.

Реактивацию лиофилизированных культур произво­дят путем переноса части матери­ала либо сразу же в жид­кую питательную среду, либо путем предварительного 8-часового выдерживания в дистиллированной воде с по­следующим пересевом на сусло-агар.

Запаянные ампулы с лиофилизированными культура­ми хранят в темноте при комнатной температуре или в холодильнике с температурой 4–6°С. Последнее предпоч­тительнее, особенно для дрожжей с высокой остаточной влажностью материала.

Итоги 19–20-летнего хранения культур дрожжей – представителей 17 родов, всего 557 штаммов – в голланд­ской коллекции позволили установить разную пригод­ность этого метода хранения для отдельных видов. Дрож­жи с мелкими клетками и аскоспорами, такие как Pichia, Hansenula и Debaryomyces, показали хорошую выживае­мость, а крупно­клеточные слабоспорулирующие или неспорулирующие дрожжи родов Saccharomyces, Kluyveromyces, Dekkera и Brettanomyces выживали хуже.

Таким образом, и этот широко применяющийся сей­час метод хранения микробных культур не следует рас­сматривать как универсальный, одинаково пригодный для разных видов дрожжей.

6.5.4. МЕТОДЫ КРИОГЕННОГО ХРАНЕНИЯ

Замораживание дрожжей проводят при разных режи­мах, включая температуры от –10 до –196°С и различные скорости охлаждения. Устойчивость дрожжей к повреж­дающим эффектам при замораживании повышается при добавлении защитных веществ: глицерина, сахарозы, ино­зита, диметилсульфоксида, полиэтиленгликоля.

В ампулу объемом 1,2 мл вносят 0,2 мл суспензии кле­ток дрожжей из стационарной фазы (начальная концентра­ция клеток 10 6 –10 8 клеток/см 3 ), 0,5 см 3 10%-ного раство­ра глицерина, 6%-ного инозита или другого защитного вещества. Ампулы запаивают и помещают в жидкостно-фазовый рефрижератор с температурой –70°С со скоростью охлаждения 1–2,5°С в минуту в зоне критических темпе­ратур — от –5 до –35°С. Замороженные микроорганизмы хранят в жидком азоте при –196°С в металлических кон­тейнерах или стеклянных дьюарах. Существуют контей­неры-рефрижераторы разного объема:

• 10 л на 250 ампул для краткосрочного хранения в экспериментальной работе;
• 35 л на 900 ампул в канистрах;
• 185 л на 12 000 ампул или 1000 штаммов в 12 повто­рениях.

Для быстрого оттаивания ампулы погружают в водя­ную баню с температурой 35–45°С на 2 мин. При этом не­обходимо защитить глаза от возможного взрыва неплотно запаянных ампул. Высев производят на богатую питатель­ную среду.

Трехлетнее хранение пивных дрожжей в жидком азо­те показало хорошую их выживаемость без изменения цен­ных производственных свойств.

6.5.5. ХРАНЕНИЕ НА АДСОРБЕНТАХ

В качестве адсорбентов используют почву, песок, као­лин, силикагель, вату и фильтровальную бумагу. Этот спо­соб хранения не имеет разработанной стандартной тех­ни­ки. Высокая выживаемость и физиологическая активность обеспечивается при хра­нении дрожжей в силикагеле, со­держащем различные микроэлементы. Двухсуточные куль­туры дрожжей, полученные на синтетической среде с 1% парафина на качалках, смешивали со 150 см 3 стерильных шариков силикагеля и оставляли в термостате при 32°С на 24 ч. Через сутки определяли рН среды и доводили при необходимости до 7–8. Затем культуральную жидкость сливали, шарики силикагеля с дрожжами помещали в сте­рильные чашки Петри и высушивали в эксикаторе при пониженном давлении в течение 5–6 суток. После высу­шивания культуры дрожжей хранили в течение года при комнатной температуре в запаянных стеклянных ампу­лах при давлении 13,33 кПа. Для реактивации 200 мг шариков силикагеля измельчали в фарфоровой ступке, порошок переносили в
3–5 мл стерильной воды и после кратковременного выдерживания делали высев на пита­тельную среду.

Описан способ хранения дрожжевых культур на вате и полосках фильтровальной бумаги, в 10% -ном растворе сахарозы в почве.

6.5.6. ХРАНЕНИЕ КУЛЬТУР ВИННЫХ ДРОЖЖЕЙ В ВИДЕ СПОР

На сусловых средах винные дрожжи плохо спорулируют и быстро отмирают.
В. В. Абрамовичем был разрабо­тан метод получения активно спорулирующих культур для длительного хранения их в состоянии спор.

Дрожжевой осадок из сброженного сусла переносят на 2–3%-ный голодный (водный) агар, где 60–80% клеток образуют споры. Дрожжи сохраняют жизнеспособность на этой среде до двух и более лет. Этим способом было прове­рено 18 рас винных дрожжей. Подавляющее большинст­во проверенных культур вызывало активное брожение через
1,5–2,2 года хранения.

Н. И. Бурьян предложила для винных дрожжей спо­соб хранения без потери их основных производственно ценных свойств (энергии размножения и дыхания, бро­дильной активности, кислотоустойчивости, спиртоустойчивости) путем чередования периодов активного размно­жения и пребывания в состоянии спор.

Дрожжи предварительно выращивают 48 ч на среде с 5% (по объему) автолизата пивных дрожжей и 2% глюко­зы, переносят для спорообразования на измененную сре­ду Адамса (2% агара + 0,14% уксуснокислого натрия), затем 10 суток выдерживают при 15°С, а для длительно­го хранения переносят в помещение с температурой 10°С. Через 9– 10 мес. дрожжи переводят в активное состояние, засевая споровым материалом колбы со средой, содержа­щей 18–20% сахара (рН 2,7–3,0), а по окончании броже­ния – в новую серию колб, среда в которых содержит 28–30% сахара (рН 5,5). Эти пересевы занимают прибли­зительно 2 мес, после чего дрожжи вновь переносят на голодный агар.

6.5.7. ХРАНЕНИЕ МИКРОБНЫХ КУЛЬТУР ПОД ВАКУУМОМ
(МЕТОД СОРДЕЛЛИ)

Небольшое количество дрожжей с агаровой среды вво­дят в маленькую пробирку, которую закрывают ватной пробкой. Пробирку помещают в более крупную пробирку из тугоплавкого стекла. На ее дно предварительно вносят несколько стеклянных бус и кристаллов КОН. Пробирку закрывают резиновой пробкой со стеклянной трубкой, через которую производят откачку воздуха до 1,3–6,6 кПа. Трубку запаивают парафином. Пробирки хранят при ком­натной температуре.

6.5.8. ХРАНЕНИЕ КОЛЛЕКЦИОННЫХ КУЛЬТУР ДРОЖЖЕЙ В ДИСТИЛЛИРОВАННОЙ ВОДЕ (МЕТОД КАСТЕЛЛАНИ)

Пробирки с 8–10 см 3 стерильной дистиллированной воды засевают большим коли­чеством инокулята с глюкозного или суслового агара и хранят при комнатной темпе­ратуре. По мере испарения воды ее добавляют в пробир­ки. Жизнеспособность дрожжей сохраняется в этих усло­виях до двух лет и более. Основным условием успешного хранения дрожжей в дистиллированной воде является обильный инокулят.

Этот способ оказался непригодным для таких слабоспорулирующих дрожжей, как Hanseniaspora, Endomycopsis, Nematospora и некоторых Saccharomyces.

6.5.9. ХРАНЕНИЕ В МАННИТЕ

Предлагается способ хранения дрожжей в активной форме, при котором чистую культуру суспендируют в 10%-ном растворе маннита, играющего роль осмотическо­го стабилизатора, с добавлением 0,2% b-фенилэтанола в качестве бактерицидного агента.

При концентрации биомассы дрожжей 1,0–2,5·10 8 кле­ток/см 3 и температуре хранения 25°С гарантируется со­хранение свойств дрожжей в течение года.

6.5.10. ХРАНЕНИЕ МАТОЧНЫХ ХЛЕБОПЕКАРНЫХ И СПИРТОВЫХ ДРОЖЖЕЙ

Маточные дрожжи, обладающие высокой ферментатив­ной активностью, стойкостью и микробиологической чис­тотой, проявляют хорошую устойчивость при хранении. Но даже незначительные отклонения от требуемых показате­лей приводят к быстрой потере актив­ности культуры. Для хранения маточных дрожжей ЧК (чистая культура) и ЕЧК (есте­ственно чистая культура) в виде молока устанавлива­ют по два сборника из нержавеющей стали, чтобы создать условия их попеременной мойки и профилактического ремонта. Сборники должны быть снабжены мешалками, охлаждающими системами, указателями уровня и вынос­ными термометрами.

При монтаже сборников предусматривают возмож­ность самостоятельной промывки и пропарки любого уча­стка трубопровода в любом направлении, в том числе и на выпуск в канализацию.

За техническим состоянием коммуникаций, змееви­ков и всей запорной арматуры маточного отделения дол­жен быть строгий надзор.

Для стабилизации и улучшения исходных показате­лей культуры при хранении дрожжей ЧК рекомендуется использовать добавки из расчета на 1 кг прессованных дрожжей (табл. 8).

Стабилизаторы маточных дрожжей ЧК

На Воронежском дрожжевом заводе смонтирован спе­циальный сборник-термостат, снабженный барботером и охлаждающей рубашкой. К суспензии хранящихся дрож­жей добавляют расчетное количество мелассы при темпе­ратуре 10–12°С, выдерживают 2–3 ч до возникновения слабого спиртового брожения, затем охлаждают до 1°С и хранят при этой температуре. Конвективные токи CO₂, выделяющиеся в процессе брожения, удерживают дрож­жи во взвешенном состоянии.

Суспензию для засева можно подавать непосредствен­но из термостата, в котором создается избыточное давле­ние 30 кПа (0,3 кгс/см 2 ), поэтому термостат лучше уста­навливать в непосредственной близости к дрожжерастильным аппаратам.

[1] Здесь и далее обозначены методики, разработанные, модифици­рованные или дополненные автором.

Источник