Непрерывный способ культивирования
Периодический способ культивирования
Это такой процесс, когда в ферментер со стерильной питательной средой подается посевной материал, задаются определенные технологические параметры (температура, рН, обороты мешалки) и процесс проходит самостоятельно с образованием целевого продукта. Далее в этой же емкости микроорганизмы при определенных условиях проходят через все стадии роста и развития популяции.
Когда процесс культивирования заканчивается, емкость для выращивания освобождают, и цикл возобновляется. Этот процесс экономически не выгоден, т.к. образуется мало целевого продукта. При таком способе культивирования скорость роста биомассы всегда стремится к нулю либо из-за недостатка питательных веществ, либо из-за накопления в среде токсических метаболитов.
Этот способ используется для получения посевного материала на некоторых этапах, а также при микробиологическом производстве аминокислот, в производстве вакцин и т.д.
Промежуточные способы культивирования
Продленный периодический процесс – предусматривает одноразовую загрузку и разгрузку ферментера. Однако цикл развития микроорганизмов в продленном периодическом процессе удлиняется двумя способами:
1) за счет подпитки – периодическое или непрерывное добавление питательной среды;
2) за счет длительного удержания клеток в системе (диализная культура). При этом культура развивается в пространстве, ограниченном полупроницаемой мембраной, а продукты метаболизма диффундируют во внешний раствор. В этом случае продлевается экспоненциальная фаза и фаза линейного роста. Наиболее простой диализный метод – культивирование в целлофановых мешках, погруженных в питательную среду.
Многоциклические процессы культивирования – ведут в одном ферментере, многократно повторяя полный цикл развития культуры без перерыва на стерилизацию. Применяют как для получения биомассы; для производства продуктов микробного синтеза – антибиотиков, внеклеточных ферментов, аминокислот. Применение данного способа позволяет в несколько раз сократить затраты труда на производство продукта по сравнению с периодическим способом.
1) Одностадийные многоциклические процессы – осуществляются в одном ферментере.
2) Многостадийные многоциклические процессы – основаны на принципе повторного и последовательного периодического культивирования. Протекает в нескольких ферментерах, которые соединены в батарею с целью длительного использования культуры.
Вариант такого способа: культура выращивается в одном биореакторе. В то время, когда она проходит в своем развитии экспоненциальную фазу, из нее берется инокулят (посевной материал) для засева следующего реактора. В первом реакторе культура доращивается до необходимой фазы роста. Когда культура во втором реакторе достигает экспоненциальной фазы, из нее также делается пересев в третий реактор и т.д. Так как культура все время пересевается в экспоненциальной фазе, не происходит ее старения и вырождения.
Полунепрерывные системы – при этом полная загрузка и разгрузка ферментера осуществляются однократно, однако в процессе роста культуры часть культуральной жидкости сливается, а освободившийся объем заливается свежей питательной средой. Таким образом, функционирует сливно-доливная система. Различные варианты полунепрерывных систем используются в производстве дрожжей, водорослей, антибиотиков и лимонной кислоты.
Непрерывный способ культивирования
При этом в процессе биосинтеза из ферментера берется определенное количество культуральной жидкости и вносится в другой ферментер, в котором тоже начинается биосинтез. Культуральная жидкость выполняет функции посевного материала. Микроорганизмы постоянно получают приток свежей стерильной питательной среды, а из аппарата непрерывно отбирается биомасса вместе с образуемыми метаболитами. Такой способ культивирования можно назвать «открытой» системой.
Непрерывная ферментация может проходить в следующих системах:
Гомогенные системы идеального смешения –микроорганизмы растут в культуральной среде, постоянной по своему составу, и, следовательно, в каждый данный момент времени находятся в одном и том же физиологическом состоянии.
По количеству ферментеров гомогенные системы могут быть одностадийными, двухстадийными и многостадийными.
Так, для получения высоких концентраций биомассы используют одностадийные системы с возвратом клеток. В них клетки отделяют от культуральной жидкости с помощью насоса, возвращают обратно в ферментер. Возврат клеток (рециркуляция) имеет важное значение в тех процессах, в которых за время пребывания в ферментере клетки не успевают реализовать свои потенциальные возможности в отношении синтеза целевого продукта.
Многостадийные системы состоят из ряда последовательно соединенных ферментеров – батареи. Это позволяет получать культуру при любой скорости роста – от лаг-фазы до экспоненциальной и стационарной. Применяется при получении молочной кислоты, этилового спирта.
Основной аппарат для выращивания непрерывной гомогенной системы – ферментер идеального смешения с устройством для потока среды и слива культуры, поддерживающим постоянный уровень среды. Такой процесс называют непрерывно-проточным, обеспечивающим одинаковую концентрацию всех продуктов внутри ферментера и в вытекающей жидкости.
Непрерывно-проточное культивирование дает возможность поддерживать постоянные условия роста микроорганизмов за счет лимитирования (ограничения) какого-то одного фактора среды.
При этом различают:
Хемостатное культивирование – при этом лимитирующим рост фактором является химический состав питательной среды. В хемостате скорость разбавления питательной среды является постоянной в соответствии с заданной плотностью популяции. Изменяя скорость разбавления, можно получать режимы, обеспечивающие различную скорость роста.
Турбидостатное культивирование – при этом подача питательной среды осуществляется по команде фотоэлектрического элемента, регистрирующего оптическую плотность культуры в ферментере. Скорость разбавления устанавливается автоматически в соответствии с заданной плотностью популяции.
Системы культивирования полного вытеснения –в ней культура не перемешивается, а представляет собой поток жидкости через трубку. Наиболее распространенный аппарат для культивирования в данном случае – трубчатый ферментер. Он может иметь различную форму (прямую, S-образную, спиральную) и устанавливается горизонтально или вертикально. Такая культура за время посева до выгрузки проходит через все стадии периодической культуры, то есть фазы роста распределены не во времени, а в пространстве. Каждой части ферментера в установившемся режиме соответствует определенный отрезок кривой роста. Этот способ культивирования используется для анаэробных процессов. Посев осуществляется непрерывно на входе в ферментер одновременно с подачей среды. Этот принцип может использоваться на стадии брожения при производстве пива.
Системы твердожидкостного типа –это многофазные системы, в которых культура растет на границе разных фаз: жидкость — твердая фаза — газ. В этих системах клетки удерживаются путем прилипания к твердой основе – наполнителю и размножаются на нем, образуя пленку биомассы. Пример – производство уксуса в стружечных аппаратах.
В данной системе лимитирующим фактором для аэробных микробов являются кислород и субстрат (питательные вещества). В тонких пленках каждая из прикрепленных в поверхности клеток полностью обеспечена этими веществами и способна расти и размножаться с максимальной экспоненциальной скоростью. По мере того, как клетки образуют более толстую пленку биомассы, рост их ограничивается (верхним слоям не хватает кислорода, нижним – питательных веществ).
Системы твердожидкостного типа применяются при очистке сточных вод, в производстве органических растворителей и кислот и т.д.
Источник
Периодическое культивирование.
Периодическим (стационарным) называют такой метод культивирования, когда клетки микроорганизмов вносят в питательную среду и далее компоненты среды не поступают в сосуд и не удаляются из него.
Периодическое культивирование микроорганизмов представляет с точки зрения техники наиболее простой метод культивирования. Под культивированием микроорганизмов понимают их выращивание в наиболее благоприятных (оптимальных) условиях.
При периодическом способе культивирования питательная среда засевается исходной культурой продуцента — инокулятом (от лат. inoculatio – прививка). Инокулят иначе называют посевным материалом, а инокуляцию называют посевом. Далее в этой же емкости микроорганизмы при определенных условиях проходят через все стадии роста и развития популяции. При таком способе культивирования (его можно назвать «закрытой» системой, когда хотя бы один из компонентов не может поступать в нее или выводиться из нее) скорость роста биомассы всегда должна стремиться к нулю либо из-за недостатка питательных веществ, либо из-за накопления в среде токсических метаболитов. Поскольку при периодическом способе культивирования микроорганизма всегда имеет место некоторая неустойчивость в системе.
В простой гомогенной периодической культуре все ее части находятся в одинаковых условиях. Для феноменологического описания роста микроорганизмов в периодическом режиме обычно используют кривую роста (рис. 21). Она имеет S-образный характер. Различные фазы роста такой культуры отражают изменения в биомассе и в окружающей среде. Продолжительность каждого периода зависит от вида культуры, количества и качества посевного материала, состава питательной среды и условий культивирования.
Периодическая культура начинается с лаг — фазы, которая является совершенно необязательной фазой роста. Ее возникновение зависит от несоблюдения оптимальных условий для роста посевного материала. Происходит перепад концентраций элементов питания, особенно углеродного, от сниженных – в выросшей культуре, из которой берется посевной материал, к высоким – в свежей среде. В этот период культура как бы адаптируется (привыкает) к новой среде обитания. Истощенные клетки старого посевного материала должны перейти из состояния голодания или отравления в состояние, соответствующее способности к размножению, которое определяется необходимым количеством и состоянием рибосом, способностью и условиями к репликации, синтезу клеточной стенки и т. п. Продолжительность этой фазы зависит от физиологических особенностей микроорганизма, состава посевной и производственной сред и условий культивирования. Чем эти различия меньше и чем больше посевная доза, тем короче I фаза роста.
Рисунок21. Фазы на кривой роста периодической культуры: I – лаг-фаза; II – фаза ускорения роста; III – фаза экспоненциального роста; IV – фаза замедления роста; V – стационарная фаза; VI – фаза отмирания.
II фаза называется фазой ускорения роста, она характеризуется началом деления клеток, увеличением общей массы популяции и постоянным увеличение скорости роста культуры; обычно она непродолжительна.
Далее следует экспоненциальная фаза, в наибольшей степени характеризующая и выражающая способность культуры к размножению. В этой фазе сведены к минимуму все лимитирующие и ингибирующие влияния. Компоненты питательной среды имеются в избытке, продукты обмена еще не накопились. Рост идет с максимально возможной скоростью, генетически заложенной в клетке, интервалы между появлением предыдущего и последующего поколений постоянны. Логарифм числа клеток линейно зависит от времени. Если же среда по своему начальному составу не оптимальна, то рост будет ограничен неподходящим питанием или неоптимальным значением рН и т. п. В этом случае рост может быть описан более пологой экспонентой или прямой. Эта фаза в лабораторных условиях не может быть длительной, так как даже не очень плотная популяция вскоре начнёт испытывать недостаток в кислороде из-за его быстрого поглощения и слабой растворимости.
Фаза замедления роста может быть очень разнообразной и самой сложной. Она может полностью отсутствовать на простых синтетических средах, когда рост сразу останавливается из-за отсутствия одного элемента питания, в особенности – источника углерода и энергии. Рост клеток прекращается, и наступает стационарная фаза, в данном случае – фаза голодания по использованному элементу питания. Возникает и пространственная ограниченность, клетки мешают друг другу, уменьшаются поверхности их контакта со средой, ухудшаются поступление питательных веществ внутрь клетки и выброс продуктов метаболизма. На сложных средах, содержащих несколько источников углерода, может происходить поочередная их утилизация и постепенное замедление роста. При избытке питания рост замедляется из-за накопления продуктов метаболизма. Токсичные продукты метаболизма у микроорганизмов весьма разнообразны. Возможно одновременное отравление и голодание. В соответствии с этим и стационарная фаза может содержать самые разнокачественные клетки: живые, но голодающие, живые, но ингибированные, отмирающие по причине голодания или отравления.
Стационарная фаза не характеризует культуру, так как в этот период состояние клеток может быть самым разнообразным. Масса и количество всех живых клеток во время этой фазы достигают своего максимума. Количество вновь образовавшихся клеток становится на этом этапе равным количеству клеток, отмерших и автолизовавшихся. В какой-то момент это равновесие нарушается, и количество отмерших клеток становится больше вновь образовавшихся, наступает VI фаза – фаза отмирания. На этой стадии масса живых клеток значительно уменьшается, так как запасные вещества клетки исчерпываются.
Только экспоненциальная фаза до некоторой степени характеризует свойства культуры.
Таким образом, клетки периодической культуры претерпевают значительные изменения всех свойств по всему периоду роста, обусловленные непрерывными изменениями окружающей среда и быстрой реакцией на них клеток. Тем не менее, периодические методы культивирования микроорганизмов широко используются в настоящее время в промышленной биотехнологии и исследовательской практике. Техника периодической культуры позволяет получить исходные данные, и расходные коэффициенты, и кинетические характеристики культуры, необходимые для перехода к проточным системам и масштабированию процесса.
Источник
Периодическое культивирование.
Периодическим (стационарным) называют такой метод культивирования, когда клетки микроорганизмов вносят в питательную среду и далее компоненты среды не поступают в сосуд и не удаляются из него.
Периодическое культивирование микроорганизмов представляет с точки зрения техники наиболее простой метод культивирования. Под культивированием микроорганизмов понимают их выращивание в наиболее благоприятных (оптимальных) условиях.
При периодическом способе культивирования питательная среда засевается исходной культурой продуцента — инокулятом (от лат. inoculatio – прививка). Инокулят иначе называют посевным материалом, а инокуляцию называют посевом. Далее в этой же емкости микроорганизмы при определенных условиях проходят через все стадии роста и развития популяции. При таком способе культивирования (его можно назвать «закрытой» системой, когда хотя бы один из компонентов не может поступать в нее или выводиться из нее) скорость роста биомассы всегда должна стремиться к нулю либо из-за недостатка питательных веществ, либо из-за накопления в среде токсических метаболитов. Поскольку при периодическом способе культивирования микроорганизма всегда имеет место некоторая неустойчивость в системе.
В простой гомогенной периодической культуре все ее части находятся в одинаковых условиях. Для феноменологического описания роста микроорганизмов в периодическом режиме обычно используют кривую роста (рис. 21). Она имеет S-образный характер. Различные фазы роста такой культуры отражают изменения в биомассе и в окружающей среде. Продолжительность каждого периода зависит от вида культуры, количества и качества посевного материала, состава питательной среды и условий культивирования.
Периодическая культура начинается с лаг — фазы, которая является совершенно необязательной фазой роста. Ее возникновение зависит от несоблюдения оптимальных условий для роста посевного материала. Происходит перепад концентраций элементов питания, особенно углеродного, от сниженных – в выросшей культуре, из которой берется посевной материал, к высоким – в свежей среде. В этот период культура как бы адаптируется (привыкает) к новой среде обитания. Истощенные клетки старого посевного материала должны перейти из состояния голодания или отравления в состояние, соответствующее способности к размножению, которое определяется необходимым количеством и состоянием рибосом, способностью и условиями к репликации, синтезу клеточной стенки и т. п. Продолжительность этой фазы зависит от физиологических особенностей микроорганизма, состава посевной и производственной сред и условий культивирования. Чем эти различия меньше и чем больше посевная доза, тем короче I фаза роста.
Рисунок21. Фазы на кривой роста периодической культуры: I – лаг-фаза; II – фаза ускорения роста; III – фаза экспоненциального роста; IV – фаза замедления роста; V – стационарная фаза; VI – фаза отмирания.
II фаза называется фазой ускорения роста, она характеризуется началом деления клеток, увеличением общей массы популяции и постоянным увеличение скорости роста культуры; обычно она непродолжительна.
Далее следует экспоненциальная фаза, в наибольшей степени характеризующая и выражающая способность культуры к размножению. В этой фазе сведены к минимуму все лимитирующие и ингибирующие влияния. Компоненты питательной среды имеются в избытке, продукты обмена еще не накопились. Рост идет с максимально возможной скоростью, генетически заложенной в клетке, интервалы между появлением предыдущего и последующего поколений постоянны. Логарифм числа клеток линейно зависит от времени. Если же среда по своему начальному составу не оптимальна, то рост будет ограничен неподходящим питанием или неоптимальным значением рН и т. п. В этом случае рост может быть описан более пологой экспонентой или прямой. Эта фаза в лабораторных условиях не может быть длительной, так как даже не очень плотная популяция вскоре начнёт испытывать недостаток в кислороде из-за его быстрого поглощения и слабой растворимости.
Фаза замедления роста может быть очень разнообразной и самой сложной. Она может полностью отсутствовать на простых синтетических средах, когда рост сразу останавливается из-за отсутствия одного элемента питания, в особенности – источника углерода и энергии. Рост клеток прекращается, и наступает стационарная фаза, в данном случае – фаза голодания по использованному элементу питания. Возникает и пространственная ограниченность, клетки мешают друг другу, уменьшаются поверхности их контакта со средой, ухудшаются поступление питательных веществ внутрь клетки и выброс продуктов метаболизма. На сложных средах, содержащих несколько источников углерода, может происходить поочередная их утилизация и постепенное замедление роста. При избытке питания рост замедляется из-за накопления продуктов метаболизма. Токсичные продукты метаболизма у микроорганизмов весьма разнообразны. Возможно одновременное отравление и голодание. В соответствии с этим и стационарная фаза может содержать самые разнокачественные клетки: живые, но голодающие, живые, но ингибированные, отмирающие по причине голодания или отравления.
Стационарная фаза не характеризует культуру, так как в этот период состояние клеток может быть самым разнообразным. Масса и количество всех живых клеток во время этой фазы достигают своего максимума. Количество вновь образовавшихся клеток становится на этом этапе равным количеству клеток, отмерших и автолизовавшихся. В какой-то момент это равновесие нарушается, и количество отмерших клеток становится больше вновь образовавшихся, наступает VI фаза – фаза отмирания. На этой стадии масса живых клеток значительно уменьшается, так как запасные вещества клетки исчерпываются.
Только экспоненциальная фаза до некоторой степени характеризует свойства культуры.
Таким образом, клетки периодической культуры претерпевают значительные изменения всех свойств по всему периоду роста, обусловленные непрерывными изменениями окружающей среда и быстрой реакцией на них клеток. Тем не менее, периодические методы культивирования микроорганизмов широко используются в настоящее время в промышленной биотехнологии и исследовательской практике. Техника периодической культуры позволяет получить исходные данные, и расходные коэффициенты, и кинетические характеристики культуры, необходимые для перехода к проточным системам и масштабированию процесса.
Источник
