Оценка результатов определения группы крови перекрестным способом

Группа крови (фенотип) наследуется по законам генетики и определяется набором генов (генотипом), получаемых с материнской и отцовской хромосомой. Человек может иметь только те антигены крови, которые имеются у его родителей. Наследование групп крови по системе АВО определяется тремя генами — А, В и О. В каждой хромосоме может быть только один ген, поэтому ребенок получает от родителей только два гена (один от матери, другой от отца), которые и вызывают появление в эритроцитах двух антигенов системы АВО. На рис. 2 представлена схема наследования групп крови по системе АВО.

Антигены крови появляются на 2—3-м месяце внутриутробной жизни и к рождению ребенка хорошо определяются. Естественные антитела выявляются с 3-го месяца после рождения и к 5—10 годам достигают максимального титра.

Схема наследования групп крови по системе АВО

Определение групп крови

В настоящее время существует два метода определения группы крови.
Простой — определение антигенов крови по стандартным изогемагглютинирующим сывороткам и цоликлонам анти — А и анти — В. Цоликлоны, в отличие от стандартных сывороток, не являются продуктами клеток человека, поэтому исключена контаминация препаратов вирусами гепатита и ВИЧ (вирус иммунодефицита человека). Второй метод — перекрестный, заключающийся в определении агтлютиногенов одним из указанных способов с дополнительным определением агглютининов с помощью стандартных эритроцитов.

Определение групп крови по стандартным изогемагглютинирующим сывороткам

Для определения групп крови применяют стандартные изогемагглютинирующие сыворотки. В сыворотке имеются агглютинины, являющиеся антителами всех 4 групп крови, а их активность определяется титром.

Титрование естественных антител а и бета на тарелках

Техника получения сывороток и определения титра заключается в следующем. Для их заготовки используют донорскую кровь. После отстаивания крови, сливания и дефибриллирования плазмы необходимо определить титр (разведение), т. е. активность изогемагглютинирующих сывороток. С этой целью берется ряд центрифужных пробирок, в которых разводится сыворотка. Вначале в чистые пробирки добавляется по 1 мл физиологического раствора поваренной соли. В 1-ю пробирку с физиологическим раствором добавляют 1 мл испытуемой сыворотки, жидкости смешиваются, соотношение жидкостей в 1-й пробирке 1:1. Далее 1 мл смеси из 1-й пробирки переносится во 2-ю, все это смешивается, получается соотношение 1:2. Затем 1 мл жидкости из 2-й пробирки переносится в 3-ю пробирку, смешивается, получается соотношение 1:4. Таким образом разведение сыворотки продолжают до 1:256.

На следующем этапе производят определение титра разведенной сыворотки. Из каждой пробирки на плоскость наносят по 2 крупные капли. В каждую каплю добавляют заведомо иногруппные эритроциты (в соотношении 1 к 10), смешивают, ждут 3—5 минут. Далее определяют последнюю каплю, где произошла агглютинация. Это наибольшее разведение и является титром гемагтлютинирующей сыворотки. Титр не должен быть ниже чем 1:32. Хранение стандартных сывороток допускается в течение 3 месяцев при температуре от +4° до +6 °С с периодическим контролем через 3 недели.

Методика определения групп крови.

На тарелку или любую белую пластину со смачиваемой поверхностью необходимо нанести цифровое обозначение группы сыворотки и ее серологическую формулу в следующем порядке слева направо: I II, III. Это потребуется для определения исследуемой группы крови.

Стандартные сыворотки системы АВО каждой группы двух различных серий наносят на специальную планшетку или тарелку под соответствующими обозначениями, чтобы получилось два ряда по две большие капли (0,1 мл). Исследуемую кровь наносят по одной маленькой капле (0,01 мл) рядом с каждой каплей сыворотки и перемешивают кровь с сывороткой (соотношение сыворотки и крови 1 к 10). Реакция в каждой капле может быть положительной (наличие агглютинации эритроцитов) и отрицательной (отсутствие агглютинации). Результат оценивается в зависимости от реакции со стандартными сыворотками I, II, III. Оценивают результат через 3—5 минут. Различные сочетания положительных и отрицательных результатов дают возможность судить о групповой принадлежности исследуемой крови по двум сериям стандартных сывороток.

Источник

Определение групп крови перекрёстным способом

Способ наиболее часто используют в серологических лабораториях. Суть метода состоит в определении наличия или отсутствия в исследуемой крови групповых антигенов А и В с помощью стандартных изогемагглютинирующих сывороток, а также групповых антител α и β с помощью стандартных эритроцитов. Реакцию со стандартными сыворотками проводят описанным выше способом.

Реакцию со стандартными эритроцитами проводят следующим образом.

Оснащение для реакции со стандартными эритроцитами отличается тем, что для её проведения необходимы стандартные эритроциты трёх групп крови: 0(I), А(II), B(III). Стандартные эритроциты приготавливают из крови доноров с заранее известной группой крови, хранят при 4-8 °С. Срок годности 2-3 дня.

Методика проведения реакции

1. Кровь для исследования берут из вены в сухую пробирку, центрифугируют или оставляют в покое на 20-30 мин для получения сыворотки.

2. На маркированную тарелку пипеткой наносят три больших капли (0,1 мл) сыворотки исследуемой крови из пробирки, а рядом с ними — по одной маленькой капле (0,01 мл) стандартных эритроцитов групп.

3. Дальнейшие мероприятия проводят аналогично методу с использованием стандартных изогемагглютинирующих сывороток: соответствующие капли смешивают стеклянными палочками, планшет покачивают, наблюдают в течение 5 мин, в капли с агглютинацией добавляют изотонический раствор хлорида натрия, после чего оценивают результат.

Таблица 6-3. Оценка результатов определения группы крови перекрёстным способом

Оценивают данные, полученные при обеих реакциях (со стандартными изогемагглютинирующими сыворотками и стандартными эритроцитами — табл. 6-3).

Особенность трактовки результатов реакции со стандартными эритроцитами — эритроциты группы 0(I) считают контрольными (в них нет антигенов, что делает принципиально невозможной специфическую реакцию агглютинации с любой сывороткой).

Результат перекрёстного способа считают достоверным, только если при оценке результатов реакции со стандартными изогемагглютинирующими сыворотками и со стандартными эритроцитами ответы о группе исследуемой крови совпадают. Если этого не происходит, обе реакции следует переделать.

Определение групп крови моноклональными антителами

Для определения группы крови используют моноклональные антитела, для получения которых применяют гибридомную биотехнологию.

Гибридома — клеточный гибрид, образованный путём слияния клетки опухоли костного мозга (миеломы) с иммунным лимфоцитом, синтезирующим специфические моноклональные антитела. Гибридома приобретает свойства обоих «родителей»: способность к неограниченному росту, характерную для опухолевой клетки, и возможность синтезировать антитела, присущую иммунному лимфоциту.

Таблица 6-4. Схема оценки результатов определения групп крови с помощью моноклональных антител (цоликлоны анти-А и анти-В)

Разработаны стандартные реагенты — моноклональные антитела: цоликлоны анти-А и анти-В, применяемые для определения агглютиногенов эритроцитов.

Цоликлоны используют в виде лиофилизированного порошка красного (анти-А) или синего (анти-В) цвета, порошок разводят изотоническим раствором натрия хлорида непосредственно перед исследованием.

Техника проведения реакции

Цоликлоны анти-А и анти-В наносят на белый планшет по одной большой капле (0,1 мл) под соответствующими надписями: анти-А и анти-В. Рядом с ними наносят по одной маленькой капле (0,01 мл) исследуемой крови. После перемешивания составных частей за реакцией агглютинации наблюдают в течение 2-3 мин.

Оценка результатов очень проста (табл. 6-4).

Методика определения группы крови с помощью цоликлонов позволяет отказаться от стандартных изогемагглютинирующих сывороток, получаемых из донорской крови.

Источник

Определение групп крови перекрёстным способом

Реакцию со стандартными эритроцитами проводят следующим образом.

Методика проведения реакции

Таблица 6-3. Оценка результатов определения группы крови перекрёстным способом

Определение групп крови моноклональными антителами

Техника проведения реакции

Оценка результатов очень проста (табл. 6-4).

Источник

Перекрестный метод определения группы крови

Стандартные эритроциты являются 5 – 10 % взвесью свежих эритроцитов. Условия хранения – в изотоническом солевом растворе консерванта при + 4 °C. Допускается использование смеси эритроцитов от 2 – 3 лиц одной группы. При использовании перекрестного метода определения группы крови требуется хорошее освещение и температура воздуха в помещении 15 – 25 °C.

Порядок действий

Отобрать 3 – 5 мл исследуемой крови в пробирку без стабилизатора.
Отстоять сыворотку 1,5 – 2 часа.
Однократно отмыть стандартные эритроциты в 0,9 % растворе NaCl.
Промаркировать лунки планшета: 0(I), A(II), B(III).
Разместить по две капли (приблизительно 0,1 мл) сыворотки в лунки.
Добавить в лунки по 0,03 мл стандартных эритроцитов групп 0, A, B.
Чистыми палочками перемешать сыворотку и эритроциты.
Покачивать планшет на протяжении 5 минут.
Проверить наличие агглютинации в каждой лунке.

Результаты исследования

Групповая принадлежность	Стандартные эритроциты
Групповая принадлежность	0(I)	A(II)	B(III)
0(I)	—	+	+
A(II)	—	—	+
B(III)	—	+	—
AB(IV)	—	—	—

«+» — наличие, «-» — отсутствие агглютинации.

Агглютинация со стандартными эритроцитами A(II) и B(III) свидетельствует о наличии в сыворотке агглютининов α и β. Исследуемая кровь – 0(I).
Реакция в лунке с эритроцитами B(III) говорит о наличии агглютинина β. Группа A(II).
Агглютинация с эритроцитами A(II) – свидетельство наличия агглютинина α. Результат исследования крови – B(III).
Отрицательный результат во всех трех лунках указывает на отсутствие обоих агглютининов. Кровь — AB(IV).

Определение групп крови AB0 перекрестным способом в обязательном порядке дополняет обнаружение антигенов A и B в реакции прямой агглютинации с использованием цоликлонов.

Источник