ОСНОВЫ МИКРОБИОЛОГИИ — В. М. Самыгин — 2015
ГЛАВА 10. ОСНОВНЫЕ ПРИНЦИПЫ ВЫРАЩИВАНИЯ БАКТЕРИЙ
Выращивание (культивирование) микроорганизмов необходимо для получения биомассы или различных метаболитов (продуктов обмена веществ) микробной клетки. Выращивание микробов в лабораторных условиях производят на искусственных питательных средах, в культурах тканей и в организме экспериментальных животных. Культуральные признаки микроорганизмов определяют по характеру роста на питательных средах. Эти признаки имеют важное диагностическое значение и являются постоянными для каждого вида микроорганизмов.
На плотных питательных средах при посеве большого количества микробных клеток наблюдается сплошной рост в виде «газонной» культуры микроорганизмов. При посеве ограниченного числа клеток образуются различные по форме и величине колонии, которые представляют собой видимые скопления особей одного вида микроорганизмов, формирующиеся в результате размножения одной клетки. Колонии бывают плоскими, выпуклыми, куполообразными, вдавленными, поверхность их — гладкой (S-формы), шероховатой (R-формы), исчерченной, бугристой, края — ровными, зазубренными, волокнистыми, бахромчатыми. Форма колоний разнообразна: круглая, розеткообразная, звездчатая, древовидная. По величине колонии бывают крупные (4-5 мм в диаметре), средние (2-4 мм), мелкие (1-2 мм) и карликовые (менее 1 мм). Колонии отличаются по консистенции, плотности, цвету. Они бывают прозрачными и непрозрачными, окрашенными и бесцветными, влажными, сухими и слизистыми (рис. 10 и 11).
Рис. 10. Основные типы колоний микроорганизмов
Рис. 11. Морфологическое и структурное разнообразие колоний: 1 — формы выпуклости колоний над поверхностью питательной среды: 2 — очертания колоний: 3 — характер края колоний: 4 — внутренняя структура колоний
В жидких питательных средах микробы растут с образованием диффузной мути, пленки, осадка, видимых невооруженным глазом. Иногда наблюдается пристеночный рост бактерий.
В лабораторных условиях бактерии выращивают в пробирках, чашках Петри, флаконах, бактериологических матрицах. В производственных условиях культивирование микроорганизмов осуществляют в различных ферментерах (ферментаторах, биореакторах) по специально разработанной технологии.
При оценке эффективности роста обычно измеряют биомассу или число микробных клеток. Прямой способ измерения клеточной массы — это определение веса сухого вещества клеток, содержащихся в определенном объеме культуры, путем отделения их от среды, высушивания и последующего взвешивания. Однако с помощью обычных весов трудно точно определить массу менее 1 мг, а такое количество сухого вещества может содержать до 5 млрд бактерий.
Более удобным методом определения массы одноклеточных микроорганизмов является оптический метод — измерение количества света, рассеянного суспензией клеток. Он основан на том, что рассеяние света мелкими частицами в определенных пределах пропорционально их концентрации, и доля пропущенного света служит мерой оптической плотности суспензии. Измерения проводят с помощью спектрофотометра или фотоэлектроколориметра. Эти приборы показывают единицы оптической плотности, которая представляет собой логарифм отношения интенсивности света, падающего на суспензию, к интенсивности пропущенного света. Нижний предел чувствительности данного метода — около 10 млн клеток в 1 мл.
Для определения числа клеток можно использовать микроскопический метод на специальных предметных стеклах — счетных камерах, прямой подсчет клеток с помощью электронного прибора (счетчик Коултера) и др. Однако чаще подсчет общего количества клеток в суспензии проводят с помощью бактериального стандарта мутности, а также высевом микроорганизмов на плотную питательную среду в чашки Петри.
Стандарт мутности представляет собой взвешенные в дистиллированной воде частицы стекла диаметром от 0,5 до 3,5 мкм. Взвесь этого стекла при взбалтывании осадка соответствует определенной концентрации клеток. Стандарт состоит из запаянных пробирок-эталонов, эквивалентных по степени мутности 5 и 10 международным единицам мутности (5 • 10 8 и 10 9 кл/мл соответственно). К комплекту бактериальных эталонов прилагается шрифтовая таблица, содержащая набор различных шрифтов. Исследуемую культуральную взвесь помещают в стандартную пробирку, толщина стенок и цвет стекла которых соответствует пробиркам- эталонам. Разбавляя культуру измеренными количествами физиологического раствора, доводят мутность в исследуемой пробирке до эталонной и производят расчет исходной концентрации микробных клеток. Расчет производят либо по степени разведения культуры, либо на основе общего количества клеток в бактериальной суспензии.
Число одноклеточных микроорганизмов можно подсчитать также после высева на плотную питательную среду в чашки Петри, поскольку жизнеспособные клетки, пространственно отдаленные друг от друга на поверхности плотной среды, в процессе роста образуют отдельные колонии, видимые невооруженным глазом. Следовательно, приготовив соответствующие разведения бактериальной популяции и использовав их для засева среды, можно определить число жизнеспособных клеток в исходной суспензии путем подсчета числа вырастающих после инкубации колоний и умножения этой цифры на коэффициент разведения. Этот метод называют определением концентрации жизнеспособных клеток,так как он позволяет учесть только те микроорганизмы, которые могут расти на питательной среде. Определение числа жизнеспособных клеток, несомненно, является наиболее чувствительным методом количественного учета бактерий, так как он дает возможность зарегистрировать даже единичную жизнеспособную клетку в суспензии. Для установления доли жизнеспособных клеток в популяции можно использовать методы отдельного определения общего числа клеток (с помощью стандарта мутности) и числа жизнеспособных клеток.
Биологическая библиотека — материалы для студентов, учителей, учеников и их родителей.
Наш сайт не претендует на авторство размещенных материалов. Мы только конвертируем в удобный формат материалы, которые находятся в открытом доступе и присланные нашими посетителями.
Если вы являетесь обладателем авторского права на любой размещенный у нас материал и намерены удалить его или получить ссылки на место коммерческого размещения материалов, обратитесь для согласования к администратору сайта.
Разрешается копировать материалы с обязательной гипертекстовой ссылкой на сайт, будьте благодарными мы затратили много усилий чтобы привести информацию в удобный вид.
© 2018-2021 Все права на дизайн сайта принадлежат С.Є.А.
Источник
От биобетона до биосенсоров. Истинный размах бактериальных биотехнологий
На фоне замечательной технологии 3D-принтинга в наши годы слегка потерялось другое инженерное направление – выращивание материалов. Эта исследовательская область до сих пор воспринимается как экзотическая, ориентированная, например, на выращивание кристаллов с заданными свойствами. Сегодня мы затронем несколько более узкую и интересную тему из этой области: поговорим о выращивании материалов на основе технологий управления микроорганизмами.
Давно известно, что микроорганизмы способны связывать кремний и кальций, сооружая прочные каркасы-скелеты. Одни из интереснейших примеров такого рода — скелеты диатомовых водорослей.
Это микроскопические водоросли, выстраивающие себе минеральный панцирь с практически идеальной симметрией. Основная составляющая панциря диатомей – кремний, а также кальций и фосфаты. Разнообразие форм диатомовых водорослей поражает, а в природе эти организмы играют не только биологическую, но и геологическую роль. Целые породы, в частности, диатомит, сложены из таких микроскопических панцирей. В качестве строительного материала для экзоскелета кремний также используют радиолярии и губки; другие одноклеточные, в частности, фораминиферы и кокколитофториды. Оболочка некоторых кокколитофторидов выглядит поистине футуристично:
Эти и другие примеры самоорганизации и симметрии одноклеточных не могли не заинтересовать инженеров: сегодня уже вышли в практическую плоскость исследования и разработки по выращиванию бетона и прочных материалов для протезирования. Именно об этом и пойдет речь далее.
Как вырастить кирпич
Еще сравнительно недавно (2003) в инженерных научных исследованиях подчеркивалось разрушительное влияние микроорганизмов на строительные материалы. Действительно, для диатомовых водорослей, некоторых грибков и сине-зеленых водорослей бетон и цемент питательны, поэтому подвергаются биодеградации. «Кормовая база» микроорганизмов включает не только известняк и цемент, но и стекло, и керамику, и пластик (авторы указывают, что отсутствует систематическая литература по биодеградации металлов). Тем не менее, ситуацию с подобным паразитированием удалось блестяще переосмыслить в ключе «кто нам мешает, тот нам поможет». Микроорганизмы в самом деле способны производить экологически чистые материалы, обладающие заданными свойствами. Более того, те же микроорганизмы, в первую очередь, специальные цианобактерии, могут ремонтировать (точнее, «залечивать») созданные ими конструкции. В исследовании 2020 года (проведенном в университете штата Колорадо) даже упоминается аббревиатура «LBM» (living building materials, «живые строительные материалы»).
Производственная цепочка начинается с подготовки питательной среды, состоящей из песка (состоит преимущественно из оксида кремния SiO2), гидрокарбоната натрия NaHCO3, хлорида кальция CaCl2 и желатина. В эту среду помещаются цианобактерии рода Synechococcus, известные своей неприхотливостью к условиям окружающей среды. Из полученной культуры выращиваются строительные блоки заданной формы, которые затем высушиваются и затвердевают. На схеме отмечено, что такое производство легко масштабируется (2), а сам строительный материал поддается утилизации и переработке.
Исследование показало, что биохимические свойства бактерий и всего строительного материала сильно зависят от температуры и относительной влажности воздуха. На схеме обозначен этап «dessication» — «высушивание». Действительно, жизнеспособность колонии и регенерирующие свойства полученного материала сохраняются при высокой влажности и относительно высокой температуре, а механическая прочность материала требует его высушивания и поддержания низких температур. Так, добавление первичной колонии бактерий в желатиновую среду выполнялось при температуре среды 37°C, а максимальная жизнеспособность колонии достигалась при температуре 20°C. При этом стабилизация конструкции происходила при температуре 4 °C – такая температура позволяла сохранить в материале живых бактерий, но при этом обеспечить ему надежную механическую прочность. Кроме того, для жизнеспособности материала требовалась относительная влажность воздуха, от 50% до 100%, которая характерна для большинства территорий Земли.
Тем не менее, полный контроль над таким материалом вне лаборатории пока затруднителен. Поиск компромисса, который позволил бы одновременно сохранять кирпич живым, но при этом крепким, в условиях переменчивой погоды и меняющегося климата – напоминает сложное балансирование с непредсказуемыми последствиями. Возможно, в таком качестве лучше сгодились бы синтетические бактерии, которые были бы получены методом генной инженерии, меньше зависели от условий окружающей среды и лучше поддавались бы контролю.
Бактериальный бетон
Значительно реалистичнее выглядят исследования по использованию бактерий в качестве «ремонтной биодобавки». Производство бетона и цемента разгоняет глобальное потепление (подробно, особенно раздел 2.7), поэтому целесообразно любыми способами повышать долговечность бетонных конструкций. Предполагается, что мелкие трещины в бетоне (шириной примерно от 0,18 мм) можно эффективно устранять при помощи биоминерализации. Рассмотрим ее подробнее.
Биоминерализация – это формирование минералов в ходе биологических процессов. Существует два типа такой минерализации:
• биологически контролируемая минерализация (BCM);
• биологически индуцируемая минерализация (BIM).
В первом случае минерализация контролируется на генетическом уровне или регулируется организмами. Во втором случае минералы формируются в качестве побочного продукта при взаимодействии организмов с окружающей средой; бактерии приспосабливаются к окружающей среде на уровне метаболизма.
При BCM минералы откладываются в органическом матриксе или во внутриклеточных пузырьках. Так организм контролирует нуклеацию и рост минерала и, следовательно, состав, положение и размер внутриклеточного минерального включения. Частицы BCM-минералов хорошо структурированы. Распределение по размеру у них достаточно узкое, свойства – предсказуемые. Процессы BCM хорошо контролируются на метаболическом и генетическом уровне. Также организм контролирует уровень pH во внутриклеточных минерализованных пузырьках. Протекание BCM в меньшей степени зависит от условий окружающей среды, чем протекание BIM. Процессы BCM, в особенности, образование карбоната кальция, характерны для многих эукариот: так формируются, например, раковины моллюсков, и иглы морских ежей. Минерализация в результате BIM-процессов более характерна для процессов эмбрионального развития и, что важно в рассматриваемом контексте – внутриклеточного роста.
В минерализации бетона успешно применялись бактерии многих видов, в частности, Bacillus subtilis, Bacillus pseudofirmus, Bacillus pasteurii, Bacillus sphaericus, Escherichia coli, Bacillus cohnii, Bacillus balodurans, Bacillus halodurans. Все эти бактерии безвредны для человека. Они вносятся в микротрещины на поверхности бетона, получают в качестве питания пропионат кальция и преобразуют его в карбонат кальция, выделяя углекислый газ и воду:
Подобное бактериальное воздействие помогает не только залечивать трещины в бетоне, но и заполнять карбонатом кальция поры в материале. Исследования показывают, что при концентрации бактерий 105 клеток/мл прочность бетона на разрыв возрастает на 63% за 28 дней, а прочность на сжатие – на 42%. В результате заполнения пор бетона карбонатом кальция сам бетон становится гораздо устойчивее к прониканию воды, кислот и, соответственно, долговечнее. При этом удалось установить, что некоторые виды бактерий, например, Bacillus subtilis, выживают в бетоне при температуре от -30 °C до 700 °C, что обеспечивает практически универсальное применение такого материала. Тем не менее, вносить первичную популяцию бактерий в бетон необходимо еще на этапе приготовления раствора, в результате чего по состоянию на 2015 год бактериальный бетон оказывался в 2,3 – 3,9 раз дороже обычного.
Бактериальная целлюлоза
Более тонкое биотехнологическое производство связано с получением бактериальной целлюлозы в качестве замены растительной. Бактерии рода Acetobacter синтезируют целлюлозу для собственной клеточной стенки, в результате чего их можно использовать для создания тончайшей биопленки. Такая пленка угнетает рост других бактерий и практически стерильна. Еще в конце нулевых в России обратили внимание на медицинский и дезинфицирующий потенциал бактериальной целлюлозной биопленки. Например, именно такие возможности подчеркиваются в этой диссертации, защищенной на биофаке МГУ в 2013 году. Также процитирую краткий обзор возможного применения бактериальной целлюлозы в биомедицинских целях по состоянию на 2019 год:
Наноцеллюлозные материалы интересны с биомедицинской точки зрения: в контексте культивирования тканей, клеточной и генетической терапии, диагностики и контролируемой доставки лекарств, белков и гормонов. Бактериальная целлюлоза в силу своей биохимической чистоты находит применение в качестве искусственной кожи, сосудистых трансплантатов, каркасов для поддержки тканей, в дентальной имплантации, изготовлении искусственной костной и хрящевой ткани. При оценке биологической совместимости имплантатов из бактериальной целлюлозы выявлено, что вокруг таких имплантатов отсутствуют макроскопические признаки воспаления, в том числе, хронического, не наблюдается фиброз и гигантские клетки. Эффективность бактериальной целлюлозы при заживлении ран заключается в эффективном прилегании к краям раны, сохранности во влажной среде, способности удерживать экссудат, значительной прочности в увлажненном состоянии, исключительно слабом раздражающем эффекте в силу стерильности целлюлозы. Кроме того, бактериальная целлюлоза прозрачна и не мешает наблюдать за состоянием раны. При лечении хронических язв материалы на основе бактериальной целлюлозы снижают активность пептидаз (ферментов, отщепляющих кончики аминокислот), цитокинов и реактивных форм кислорода.
Новые исследования (май 2020) показывают, что бактериальная целлюлоза не менее интересна при создании 2D- и 3D-объектов заданной формы. При выращивании бактерий K. rhaeticus в гидрофобной среде (геле), они образуют не только биопленки, но и 3D-структуры из целлюлозы, форму которых можно задавать и контролировать с высокой точностью. Минимальным строительным блоком такой структуры является сферическая «капелька» из целлюлозы, а совокупности таких капелек в прозрачной среде могут принимать разнообразные формы.
Бактерии K. rhaeticus отличаются невысокой мобильностью, поэтому выращенные с их помощью структуры сохраняют заданную форму. Рост бактериальных гранул оказывается анизотропным – структура разрастается в ширину активнее, чем в высоту. Однако, пусть такой материал пока и не очень перспективен для изготовления отдельных деталей (возможно, эта проблема будет решена при помощи генной инженерии), выявленные свойства K. rhaeticus могут быть очень полезны при ремонте микротрещин и заполнении микрополостей, где целлюлоза должна просто заполнить все доступное пространство. Такой материал регенерирует, а также не пропускает воду, поскольку является гидрофобным.
Технологии 3D-печати с использованием бактериальной целлюлозы и бактериальных гелей также существуют уже несколько лет. 3D-печать такого рода требует иммобилизации бактерий в центральной части изготовленной детали с поддержанием клеточного деления только по краям изготавливаемой структуры. Для этой цели бактерии в сформированной среде угнетались сначала путем повышения вязкости геля, а затем вытравливались фенолом, чтобы от них оставалась только плотная целлюлозная оболочка. Потенциальная область применения подобных гелей – биомедицина и протезирование.
Речь идет, прежде всего, о протезировании кровеносных сосудов и сердечных клапанов. Биоматериалы, используемые при таких операциях, разлагаются в организме, поэтому пациенту, как правило, требуются неоднократные операции для замены протезов. Бактериальная целлюлоза лишена этих недостатков и, как понятно из вышеприведенных примеров, легко принимает трубчатую форму. Запатентован синтетический материал BASYC (BActerial SYnthesized Cellulose), предназначенный именно для кардиологического протезирования. Как и другие вещества из бактериальной целлюлозы, упомянутые выше, BASYC является анизотропным – то есть, при изготовлении активнее растет в ширину, чем в длину, но эти свойства легко поддаются контролю, и BASYC можно исполнять в виде ровных волокон. Исключительно важно, что BASYC совместим с гемоглобином, поэтому не вызывает свертывания плазмы крови, а при контакте с ним разрушается не более 2% кровяных клеток.
Мне не удалось найти сведений о том, могут ли подобные протезы регенерировать внутри человеческого тела. Тем не менее, не исключаю, что такие свойства можно было бы развить в более совершенных материалах при помощи биоинженерии; в целом же основные достоинства таких материалов заключаются в стерильности, гидрофобности и биологической совместимости с человеческими тканями.
Электропроводящие биопленки
Еще одна важная область применения бактериальных биопленок, без рассмотрения которой эта статья получилась бы неполной, заключается в бактериальной электропроводимости. Бактерии естественным образом формируют биопленки на электродах. Именно благодаря этому свойству начались поиски способов превратить бактериальную пленку в электропроводящий интерфейс.
Биопленки, обладающие электропроводящими свойствами, самопроизвольно «подключаются» к электродам и образуют белковые связи, по которым электроны могут свободно переходить из бактериальной клетки в электрод и обратно, а также переходить между клетками. Такие биопленки, как и рассмотренные выше, обеспечивают регенерацию и репликацию, а значит и стабильность подобных покрытий. Эти свойства уже используются в конструировании микробных топливных элементов (МТЭ). Некоторые бактерии, в частности, Geobacter sulfurreducens, могут катализировать химические реакции, в частности, окисление ацетатов. Наконец, теоретически возможно создание бактериальных сенсоров, которые позволяли бы отличать друг от друга конкретные окислительно-восстановительные реакции в зависимости от свойств электрохимических реакций, улавливаемых биопленкой. На момент написания статьи подобные эксперименты находятся в зачаточном состоянии, так как биопленка в качестве электрохимического интерфейса обладает слишком низкой разрешающей способностью.
Заключение
В этой статье были приведены примеры микробиологических разработок, применимых в трех крайне несхожих предметных областях: 1) укрепление бетонных конструкций 2) создание тонких и долговечных протезов в кардиологии и остеологии 3) создание бактериальных электропроводящих пленок в конструировании микробных топливных элементов и (потенциально) бактериальных электрохимических сенсоров. Возможно, (циано)бактериальные культуры используются и в других инженерных областях, которые мне не известны и поэтому здесь не затронуты. Тем не менее, мне кажется наиболее интересным подчеркнуть общие черты бактериальных культур, используемых во всех этих областях: 1) образование колоний с заданными свойствами, рост которых легко контролировать 2) возможность самозалечивания и репликации рассматриваемых культур – а значит и автономность подобных решений 3) экологическая чистота. Возможно, для подведения общей базы под все эти наработки не хватает значительного вклада (и новых знаний) из области генной инженерии. Но хочется надеяться, что вышеперечисленные исследования изолированы друг от друга лишь до некоторого времени, и мы только начали картирование огромной биотехнологической индустрии с принципиально разных ее окраин.
Источник
