Способы культивирования микроорганизмов
ЛЕКЦИЯ 4
Микроорганизмы, используемые в промышленных производствах
1. Требования к промышленным микроорганизмам и параметры их роста
Способы культивирования микроорганизмов и устройство ферментера
Микробиологическое производство биологически активных веществ
Промышленное производство органических кислот, растворителей, лечебных препаратов
Требования к промышленным м-мам и параметры их роста
Благодаря широкому набору разнообразных ферментных систем м-мы способны образовывать в процессе метаболизма различные продукты обмена, которые являются ценными для человека. Кроме того, м-мы также способны трансформировать природные и химически синтезированные продукты в в-ва, необходимые человеку.
Микробиологические производства в последние годы приобрели особенное развитие благодаря детальному изучению физиолого-биохимических и генетических свойств м-мов. В промышленных пр-ах используют разные м-мы: наиболее широко – дрожжи, реже – плесневые грибы, а также аэробные и анаэробные бактерии.
Так, различные расы дрожжей р.Saccharomyces cerevisiae используют для приготовления вина, пива, хлеба и получения этилового спирта. Дрожжи р.Candida используют для пр-ва белка и витаминов (на непищевом сырье).
Плесневые грибы используют для получения органических к-от: лимонной (Aspergillus niger), глюконовой (A. niger, Penicillium chrysogenum), итаконовой (A. tereus), фумаровой (Rhizopus nigricans); антибиотиков пенициллина (P.chrysogenum, P.notatum) и цефалоспорина (Cephalosporium sp.); препаратов витамина В2 (Eremothecium ashbyii) и β-каротина (Blackeslea trispora).
Среди бактерий промышленное применение имеют прокариоты различных таксономических групп. Они применяются для пр-ва пищевых продуктов (солений и маринадов – Leuconostoc, Pediococcus, Lactobacillus, кисломолочных – Lactobacillus, Streptococcus , уксуса – Acetobacter aceti); пищевых и кормовых добавок (аминокислот – Corynebacterium, Brevibacterium, инозиновой к-ты — Corynebacterium, витаминов – Bacillus subtilis); ферментов (протеазы – Bacillus licheniformis, амилазы – B. amiloliquefaciens, B. licheniformis, глюкозоизомеразы – Streptomyces sp.); растворителей (этанола – Zymomonas mobilis, бутанола и ацетона – Clostridium acetobutylicum, молочной к-ты – Lactobacillus sp.); полисахаридов (ксантана – Xanthomonas campestris, декстрана – Leuconostoc mezenteroides, альгинатов – Azotobacter vinelandii); лечебных средств (стероидов — , антибиотиков – Bacillus sp., аминокислот — Bacillus); бактериальных препаратов (удобрительных — Rhizobium, для защиты растений – Bacillus thuringiensis).
Штаммы-подуценты м-ов, используемых в промышленности, должны обладать следующими св-ами:
1)способность расти в чистой культуре (в частности, бактерии – без фагов) и быть генетически стабильными;
2)отсутствие патогенности и токсинообразования;
3)высокая скорость роста при массовом культивировании и способность синтезировать продукт в большом к-ве за период не более 3-х суток;
4) устойчивость к загрязнению.
Большинство м-ов, используемых в микробиологических процессах, являются прототрофами. Прототрофы– м-мы, которые синтезируют все необходимые для них органические в-ва, в том числе и факторы роста. Ауксотрофы – м-мы, не способные синтезировать факторы роста. Факторы роста – органические соединения (витамины, аминок-ты, азотистые основания), необходимые в очень малых к-вах.
Многие микробиологические пр-ва базируются на использовании растущих культур соответствующих видов. Однако, для получения некоторых продуктов используют суспензии отмерших клеток, а также иммобилизованные клетки м-ов.
При культивировании м-ов в промышленных условиях определяют ряд параметров, влияющих на процессы роста или образование определенных метаболитов. Различают физические, химические и биологические параметры.
Физические: температура, давление энергозатраты, вязкость, скорость потока воздуха и жидкости, мутность, масса ферментера.
Химические: рН, растворенный кислород, кислород и углекислый газ в выходящем газе, окислительно-восст. потенциал, конц-ция субстрата, конц-ция продукта, ионная сила раствора.
Биологические: метаболиты, активность ферментов, содержание ДНК и РНК, содержание АТФ и НАДН2 , содержание белка.
Кроме этого учитываются количественные параметры: удельная скорость роста, время удвоения биомассы, урожай культуры (выход биомассы) и экономический коэффициент.
Выход конечного продукта по отношению к использованному субстрату характеризуют показателем экономического коэффициента (Y)и рассчитывают по источнику углерода, азота или фосфора.Он оценивает рост определенного вида м-мов на различных средах и в различных условиях культивирования. Эк. коэф. определяют соотношением:
Y= λx / λs
где: λx увеличение биомассы, соответствующее количеству использованного субстрата λs.
Удельная скорость роста — µ(прирост биомассы за единицу времени на единицу времени) является важной хар-кой как самого м-ма, так и условий его культивирования. Удельнуя скорость роста м-ма лимитирует концентрация субстрата и накопление продуктов обмена.
Время удвоения биомассы (время генерации) – g является критерием скорости роста микробной популяции:
g = t = —— = ———
µ µ
Это — время удвоения к-ва клеток или биомассы.Времягенерации для разных м-ов зависит от условий культивирования.
Урожай культуры (выход биомассы) –это мах количество клеток или биомассы, которую можно получить при определенных условиях в единице объема. Эта величина выражается в количестве клеток в 1мл или 1л среды. На величину урожая оказывают влияние условия культивирования (состав среды, аэрация, рН, температура и др.).
Способы культивирования микроорганизмов
и устройство ферментера
Различают два основных способа культивирования микроорганизмов – поверхностный и глубинный.
При поверхностном культивировании м-мы выращивают на поверхности тонкого слоя жидкой среды или твердого субстрата. Методы культивирования на твердом субстрате разделяют на 2 группы: 1) посев на поверхность тонкого слоя среды, 2) глубинный посев.
При тонкослойной схеме субстрат вносят толщиной 2-4см на металлическую или деревянную емкость и проводят культивирование в хорошо проветриваемых помещениях (для удаления тепла, образующегося при росте культуры). Для поверхностного культивирования в качестве сырья используют свекольный жом, виноградную мезгу, зерновую мякину, пшеничные или рисовые отруби и т.д. Влажность субстрата – 40-70%. Наиболее часто этот способ используют при выращивании грибов.
При глубинном посеве культуру вносят в субстрат, которым заполняют емкость на глубину 0,6 или 1,5-1,8 м. Как правило, эти операции автоматизированы.
Глубинное культивирование– главный способ микробиологического пр-ва, в котором различают открытые и замкнутые системы. В открытых системах клетки легко вымываются и образуются новые, в замкнутых – к-во клеток постоянно увеличивается (накапливается).
Глубинное культивирование имеет ряд преимуществ по сравнению с поверхностным: менее трудоемкое, требует меньших площадей, имеет меньшую вероятность инфицирования. Кроме того, существует возможность тщательного контроля пр-ва, его автоматизации и получение высокого выхода продукта.
Известно два вида глубинного культивирования: периодическое и непрерывное. При периодическом изменяется скорость роста, физиолого-биохимические и морфологические характеристики культуры.
А. Периодическое (накопительное) культивированиехарактеризуется следующими чертами: а) полный цикл ферментации проходит в замкнутом объеме среды; б) скорость прироста биомассы лимитируется истощением питательной среды, накоплением шлаков – продуктов метаболизма.Используется в производстве аминокислот, витаминов, антибиотиков, ферментов, других БАВ.
В этих условиях м-мы проходят определенный цикл развития, для которого характерна смена фаз. Выделяют 4 основные фазы роста периодической культуры:
1.Лаг-фаза – фаза скрытого роста. С момента инокуляции. Клетки не размножаются. Идет адаптация к новой среде.
2.Логарифмическая (экспоненциальная) фаза. Скорость роста культуры максимальная: быстро увеличивается, высокая биохимическая активность
3.Стационарная фаза – количество нарождающихся клеток = кол-ву отмирающих: незначительный прирост биомассы. Накопление метаболитов и токсинов, исчерпание питательной среды.
4.Фаза массовой гибели клеток (отмирание): уменьшается к-во живых клеток, начинается их лизис под действием собственных ферментов (автолиз).
Б. Непрерывное культивирование характеризуется следующими чертами: а) периодическое (полупроточное) или непрерывное разбавление ферментирущей массы свежей питательной средой; в) скорость прироста биомассы не лимитируется. Используется для получения спиртов, кислот, растворителей.
Преимущества: использование спецоборудования, стабилизация во времени, улучшение качества продукта, возможность автоматизации.
Непрерывное культивирование осуществляется разными процессами: 1)Процесс полного вытеснения проводят в трубчатом ферментере, в который с одной стороны подается питательная среда и посевной материал, а с другой – вытекает культура. Такой процесс применяют в пищевой промышленности, в частности при пр-ве пива.
2)Процесс полного замещения проводят в ферментерах при интенсивном воздушном или механическом перемешивании. Этот способ часто называют гомогенно-непрерывным. В ферментере создаются условия, которые соответствуют определенной фазе роста м-ов. При быстром замещении среды – это условия экспоненциальной фазы, при медленном – стационарной.
В зависимости от используемого оборудования различают два вида непрерывного культивирования м-ов: хемостатный и турбидостатный.
Хемостат – аппарат для выращивания м-ов, в который с постоянной скоростью поступает питательная среда и с такой же скоростью происходит отток культуры. В хемостате длительное время поддерживается постоянный урожай культуры, скорость роста и концентрация питательной среды.
Турбидостат – в среде поддерживается постоянный уровень биомассы м-ов, который регистрируется по оптической густоте культуры специальным устройстврм с фотоэлементом. В этом оборудовании скорость накопления биомассы определяет скорость притока питательной среды (это основное отличие!).
Метод непрерывного культивирования приобретает все большее практическое значение, т.к. он позволяет получить высокий выход микробных продуктов и обеспечивает контроль производства.
Ферментер(биореактор) – это устройство для культивирования м-ов, которое обеспечивает оптимальные условия для их роста и метаболической активности, а также защиты от внешнего загрязнения.
Основные блоки ферментера (по Нетрусову): ротаметр (для подачи воздуха), снабженный бактериальным фильтром для стерилизации воздуха; магнитная мешалка; обратный холодильник; бактериальный фильтр для стерилизации выходящего воздуха; сосуд с дезраствором для стерилизации выходящих газов; стерильный пеногаситель; система для нагревания питательной среды в ферментере; емкость для суспензии м-ов; емкость для стерильной питательной среды; насос; блок управления.
С целью улучшения снабжения м-ов кислородом, проводят аэрацию питательной среды путем постоянного перемешивания на качалках разного типа. В производстве для культивирования аэробных м-ов используют ферментеры, оснащенные мешалками и нагнетателями воздуха.
Анаэробные м-мы культивируют в специальных аппаратах – анаэростатах,в анаэробных боксах в специальной герметической посуде в атмосфере азота или инертного газа (аргона).
Фототрофные бактерии выращивают в специальных устройствах: люминостатах:термостатах, оснащенных лампами дневного света.
Источник
Способы культивирования
Для выращивания бактерий используют следующие способы их культивирования: стационарный, глубинный с аэрацией и с использованием проточных питательных сред.
Стационарный способ: питательные среды сохраняются постоянными, с ними никаких дополнительных манипуляций не производят. Однако при таком способе культивирования в жидких питательных средах, где преобладают анаэробные энергетические процессы, выход биомассы незначителен. Поэтому в связи с развитием микробиологической промышленности были разработаны принципиально новые способы культивирования, позволяющие получать гораздо больший выход биомассы или биологически активных соединений. К их числу относятся метод глубинного культивирования с аэрацией и метод использования проточных сред.
Метод глубинного культивирования с аэрацией. Для выращивания с помощью этого способа применяют специальные устройства – реакторы. Они представляют собой герметические котлы (приспособленные автоклавы), в которые заливается жидкая питательная среда. Реакторы снабжены автоматическими приспособлениями, позволяющими поддерживать постоянную температуру, оптимальные рН иrН, дозированное поступление необходимых дополнительных питательных вещест 2 в. Однако главная особенность таких реакторов в том, что они постоянно продуваются стерильным воздухом и в них установлены мешалки, с помощью которых среда постоянно перемешивается. Поэтому во всей питательной среде создается такая концентрация свободного кислорода, при которой энергетические процессы происходят в аэробных условиях, т. е. достигается максимальное использование энергии, заключенной в глюкозе, а следовательно, и максимальный выход биомассы. Для примера: выход биомассы при стационарном методе культивирования E. coli в МПБ через 18 – 20 ч составляет 1 – 2 млрд клеток на 1 мл среды, а при глубинном методе через 12 – 14 ч – 50 – 60 млрд клеток/мл среды.
Использование проточных питательных сред позволяет создать условия, при которых клетки имеют возможность длительное время находиться в определенной фазе роста (экспоненциальной) при постоянной концентрации питательных веществ и в одних и тех же условиях, обеспечивающих непрерывный рост культуры. Методы получения непрерывных культур основаны на том, что в аппарат, где растут клетки, непрерывно добавляют свежую питательную среду и одновременно из него удаляют соответствующее количество бактерий.
Различают два типа таких аппаратов: хемостаты и турбидостаты. Хемостат – аппарат, в который постоянно из особого резервуара добавляется свежая питательная среда. Благодаря механическому перемешиванию и аэрации среды в ней создаются оптимальные условия для снабжения бактерий кислородом и вновь добавляемыми питательными веществами, по мере поступления которых часть популяции бактерий из аппарата удаляется.
Принцип работы турбидостата основан на поддержании постоянной плотности (мутности) бактериальной популяции в аппарате. Степень мутности контролируется с помощью фотоэлементов, которые через систему реле регулируют поступление питательных веществ в аппарат. Все питательные вещества в ней содержатся в избытке, и скорость роста приближается к максимальной. В таких аппаратах непрерывного культивирования микроорганизмов (АНКМ) все необходимые параметры для роста соответствующего вида микроорганизма задаются и поддерживаются с помощью специальных автоматических приборов. Благодаря сохранению неизменных условий среды непрерывная культура постоянно находится в наиболее желательной фазе роста, при которой обеспечивается максимальный выход биологически важных соединений (антибиотики, витамины, аминокислоты и т. п.) либо биомассы. Таким образом, в соответствии со способами культивирования различают периодические (при стационарном и глубинном методах культивирования) и непрерывные (при проточном способе) культуры микроорганизмов. Кроме того, при определенных условиях получают синхронные культуры, т. е. культуры, в которых все клетки одновременно (синхронно) делятся. Однако такая синхронность сохраняется, как правило, в течение 2 – 3 циклов деления, а затем она нарушается. Синхронные культуры используют в основном для изучения тех или иных стадий клеточного цикла бактерий и роли отдельных генов (и их продуктов) в их осуществлении.
Данный текст является ознакомительным фрагментом.
Источник
