Культивирование микроорганизмов.
В мире существует два основных способа культивирования микроорганизмов: периодическое (статическое) и непрерывное (проточное).
Периодическое (статическое) культивирование
Рост бактерий в периодической культуре происходит до тех пор, пока содержание какого-нибудь из компонентов питательной среды не достигнет минимума, после чего рост прекращается. Если на протяжении этого времени не добавлять питательных веществ и не удалять конечных продуктов метаболизма, то получим так называемую периодическую культуру (популяцию клеток в ограниченном жизненном пространстве).
Сл. 8. Изменение численности популяции клеток при периодическом культивировании имеет определенную закономерность. Если по оси абсцисс отложить время, а по оси ординат – логарифм числа жизнеспособных клеток, то можно построить кривую роста бактерий. Типичная кривая роста имеет S- образную форму. Анализируя кривую можно различить несколько фаз роста, сменяющих друг друга в определенной последовательности:
Начальную или лаг-фазу;
Экспоненциальную или логарифмическую фазу;
Стационарную фазу;
Фазу отмирания.
Кривая роста бактериальной культуры:
1) лаг-фаза; 2) экспоненциальная фаза;
3) стационарная фаза; 4) фаза отмирания.
Лаг-фаза включает период от посева бактерий на свежую питательную среду до достижения ими максимальной скорости роста. В начале лаг-фазы бактерии приспосабливаются к новым условиям. В клетках идет синтез ферментов, нуклеиновых кислот, белков, активируются обменные процессы. Клетки интенсивно растут, и размеры их заметно увеличиваются. Деления бактерий на этой стадии практически не происходит. Длительность этой фазы зависит от полноценности питательной среды и от состояния культуры микроорганизма. Чем полноценнее питательная среда и чем моложе культура бактерий, тем короче лаг-фаза.
Экспоненциальная фаза характеризуется активным делением подавляющей массы клеток бактериальной популяции. Число клеток возрастает в геометрической прогрессии. Характеризуется постоянной максимальной скоростью или скоростью роста. Эта скорость зависит от вида бактерий. Бактерии E. coli при 37 0 С делятся каждые 20 мин, а бактерии родов Nitrosomonas и Nitrobacter – 5-10 часов.
Во время этой фазы клетки имеют приблизительно равный размер, содержание белка в них тоже постоянно. Клетки содержат максимальное количество РНК. Клетки на этой фазе наиболее жизнеспособны и обладают высокой биохимической активностью.
Стационарная фаза наступает тогда, когда число живых клеток достигает максимума и перестает увеличиваться, так как скорость размножения бактерий равна скорости их отмирания. Так как скорость роста зависит от концентрации субстрата, то при уменьшении этой концентрации, еще до полного использования субстрата, она начинает снижаться. Скорость роста может снижаться не только из-за нехватки субстрата, но также из-за большой плотности бактериальной популяции, из-за низкого парциального давления О2 или накопления токсичных продуктов обмена. Клетоки по химическому составу отличается от состава клеток в экспоненциальной фазе. Клетки в стационарной фазе меньше по размеру, содержат меньше РНК, более устойчивы к физическим воздействиям и химическим агентам, чем в экспоненциальной фазе роста культур. В этот период в клетках и в среде нередко накапливаются продукты вторичного метаболизма (антибиотики, пигменты, бактериоцины и др.). Продолжительность этой фазы от нескольких часов до недели в зависимости от вида микроорганизмов.
В стационарную фазу роста поведение клеток бактериальной популяции регулирует такое явление как апоптоз. Суть его сводится к тому, что при исчерпании питательного субстрата голодающая популяция разделяется на две субпопуляции, одна из которых гибнет и подвергается автолизу, а клетки другой субпопуляции, используя продукты автолиза как субстрат, продолжают размножаться.
В фазе отмиранияпроисходит снижение числа живых клеток. Скорость отмирания бактерий широко варьирует в зависимости от условий и особенностей организма. Например, энтеробактерии отмирают медленно в отличие от некоторых видов бактерий рода Bacillus, которые отмирают быстро. Причины отмирания клеток могут быть разными. Это и накопление органических кислот (как у бактерий родов Escherichia. Lactobacillus), автолиз (лизис под действием собственных ферментов), накопление антибиотиков, бактериоцинов и другие причины. Сл. 9
Непрерывное проточное культивирование заключается в том, что в сосуд, содержащий популяцию бактерий, периодически подается свежая питательная среда и одновременно удаляется из него избыток среды с клетками микроорганизмов. Это позволяет задержать культуру в состоянии экспоненциального роста.
Проточное культивирование осуществляется в аппаратах двух типов: хемостатах и турбидостатах.
В хемостатах рост бактериальной популяции контролируется концентрацией питательного субстрата по источнику углерода и азота. Для равномерного распределения питательных веществ содержимое культиватора механически перемешивается и аэрируется стерильным воздухом. Излишняя микробная масса с питательной средой через сливной сифон вытекает из культиватора.
Турбидостат – это тот же хемостат, но снабженный фотоэлекрическим элементом, регистрирующим мутность среды. Когда плотность биомассы увеличивается относительно некоторого выбранного уровня, фотоэлемент, соединенный системой реле, подает свежую питательную среду.
Для глубинного культивирования бактерий с аэрацией в промышленных и лабораторных условиях применяют биореакторы или ферментеры. Ферментерыпредставляют собой герметические котлы, в которые заливается жидкая питательная среда. Ферментеры снабжены автоматическими приспособлениями, позволяющими поддерживать постоянную температуру, оптимальную рН и редокс-потенциал, дозированное поступление необходимых питательных веществ. Кроме того, они продуваются стерильным воздухом и в них установлены мешалки, с помощью которых среда постоянно перемешивается.
Непрерывное культивирование широко используется в промышленной микробиологии. Кроме того, оно используется при проведении физиологических, биохимических, генетических исследований, так как при данном культивировании поддерживается постоянство плотности популяции и концентрации всех компонентов питательной среды.
Однако, часто для изучения процессов обмена веществ необходимо, чтобы все клетки суспензии делились одновременно (синхронно). Культуры. в которых все клетки находятся на одинаковой стадии клеточного цикла и делятся одновременно, называются синхронными. Синхронизировать деление какой-нибудь популяции можно с помощью различных искусственных приемов, таких как изменение температуры, воздействие света (для фототрофных микроорганизмов), ограничение количеств питательных веществ или пропускание микроорганизмов через специальный фильтр, чтобы получить клетки одного размера. Но синхронизированная культура после 2-3 генераций переходит к асинхронному делению.
Культивирование иммобилизованных клеток микроорганизмов находит широкое применение в биотехнологии, а именно в производстве ценных органических веществ, в деградации вредных производственных соединений и промышленных отходов с целью очистки сточных вод от загрязнений.
Методы иммобилизации клеток основаны на способности микроорганизмов к адсорбции на твердых поверхностях. Существуют химические, механические и физические методы иммобилизации микроорганизмов.
Химический способ заключается в образовании ковалентной связи между какой-то из функциональных групп на поверхности клетки и носителем. Этот метод применяется редко, так как клетки в этом состоянии могут терять активность.
Механический метод основан на полимеризации какого-либо мономера, смешанного с суспензией бактерий. В результате микроорганизм оказывается заключенным в ячейку, которая ограничивает его перемещение. но не препятствует поступлению питательных веществ. Чаще всего в виде носителя используется ПААГ полиакриламидного геля. В настоящее время разрабатываются методы иммобилизации клеток путем их включения в белковые мембраны с использованием коллагена, козеина, миозина и других белков или полипептидов. Мембраны с иммобилизованными клетками сворачивают в рулон и помещают в колонку, через которую пропускают субстрат.
Сл. 10. Физический метод иммобилизации заключается в адсорбции микроорганизмов на поверхности различных синтетических пористых материалов.
Иммобилизованные клетки сохраняют высокую ферментативную активность, что позволяет использовать их в непрерывно действующих технологических процессах. При этом также облегчается выделение продуктов биосинтеза.
Источник
МИКРОБИОЛОГИЯ Учебное пособие — 2012
ГЛАВА 8. РОСТ МИКРООРГАНИЗМОВ
8.4. НЕПРЕРЫВНОЕ КУЛЬТИВИРОВАНИЕ МИКРООРГАНИЗМОВ
В середине 50-х гг. XX в. был разработан и теоретически обоснован метод непрерывного культивирования микроорганизмов или метод проточных культур. Сущность метода состоит в том, что в ферментер с постоянным объемом все время поступает свежая питательная среда и одновременно с такой же скоростью отводится использованная среда вместе с размножившимися клетками. Таким образом, микроорганизмы все время находятся в постоянных условиях в отношении наличия питательных веществ и продуктов обмена.
Отношение скорости протока (F) или скорости поступления питательной среды в ферментер к объему культуры (V) называется скоростью разбавления D:
Скорость разбавления выражает объем питательной среды, сменяемой в ферментере за 1 час.
Предполагая, что в условиях непрерывного культивирования мгновенный прирост биомассы (μX) компенсируется уносом биомассы с культуральной средой (DX), условием динамического равновесия в ферментере можно считать зависимость:
Уравнение [8.19] выражает основной принцип непрерывного культивирования — равенство между удельной скоростью роста культуры и скоростью разбавления питательной среды в ферментере. Эта зависимость всегда должна соблюдаться при одноступенчатом непрерывном культивировании микроорганизмов.
Непрерывное культивирование осуществляют следующим образом. Ферментер определенного объема заполняют питательной средой, которую стерилизуют, охлаждают до оптимальной температуры, вносят в среду инокулят и выдерживают в периодических условиях до достижения культурой экспоненциальной фазы роста, после чего начинают подачу питательной среды в ферментер с заранее определенной скоростью протока F.
Для непрерывного культивирования микроорганизмов применяют два основных типа аппаратов — хемостат, разработанный Моно, и турбидостат, разработанный Брайсоном. Эти два аппарата различаются способом, с помощью которого контролируется рост культуры.
Хемостат состоит из сосуда для среды, насоса для перекачивания среды, культиватора, в который поступает с постоянной скоростью свежая питательная среда, и приемного сосуда, в который подается культуральная среда с клетками. Скорость разбавления питательной среды (D) задается заранее, и в зависимости от нее в ферментере устанавливается определенная концентрация клеток. Хемостат оказался очень популярной системой непрерывного культивирования, так как это довольно простая, надежная система, которая может работать в большом диапазоне скоростей разбавления — от критической (Dc) до предельной (Dp). Если скорость разбавления превышает критическую, то культура будет вымываться из культиватора; если же она будет слишком низкой и достигнет предельной, то рост микроорганизмов будет замедляться и культура перейдет в стационарную фазу. Между этими двумя крайними ситуациями культура может размножаться при любой скорости разбавления.
Турбидостат представляет собой систему непрерывного культивирования, в которой задается определенная концентрация клеток, и в зависимости от нее в культиваторе устанавливается скорость разбавления. Рост культуры в турбидостате контролируется с помощью фотоэлемента, отмечающего изменения мутности среды. Сигнал, поступающий от фотоэлемента, через управляющую систему регулирует поступление питательной среды в культиватор. Турбидостат технически сложнее, чем хемостат. Кроме того, турбидостат работает эффективно при высоких скоростях разбавления, близких к μmaх, так как плотность бактериальной суспензии при таких скоростях невысока и прибор четко реагирует на ее изменение. Если скорость разбавления низкая, мутность среды значительно возрастает и прибор теряет чувствительность.
Системы непрерывного культивирования микроорганизмов могут быть одно- и многоступенчатыми, с простой и сложной подачей питательной среды, открытыми и замкнутыми, гомогенными и гетерогенными.
Непрерывное культивирование используется для получения биомассы микроорганизмов или продуктов их метаболизма. Разработан и широко используется непрерывный метод получения кормовых и пекарских дрожжей. Методом непрерывной ферментации получают антибиотики, витамины, гормоны и другие лекарственные вещества. Многоступенчатые системы непрерывной ферментации применяются в производстве спирта, пива, глицерина, ацетона и бутанола, органических кислот.
Биологическая библиотека — материалы для студентов, учителей, учеников и их родителей.
Наш сайт не претендует на авторство размещенных материалов. Мы только конвертируем в удобный формат материалы, которые находятся в открытом доступе и присланные нашими посетителями.
Если вы являетесь обладателем авторского права на любой размещенный у нас материал и намерены удалить его или получить ссылки на место коммерческого размещения материалов, обратитесь для согласования к администратору сайта.
Разрешается копировать материалы с обязательной гипертекстовой ссылкой на сайт, будьте благодарными мы затратили много усилий чтобы привести информацию в удобный вид.
© 2018-2021 Все права на дизайн сайта принадлежат С.Є.А.
Источник
Непрерывное (проточное) культивирование микроорганизмов.
Метод проточного непрямого культивирования пришел в микробиологию из химической технологии. Непрерывные процессы имеют значительные преимущества перед периодическими: возможность специализации аппаратуры для каждой стадии непрерывного процесса, стабилизации его во времени, улучшение качества продукции, легкость регулировки и, главное, возможность автоматизации. Этими преимуществами объясняется тенденция в биотехнологии к переходу от периодических процессов к непрерывным.
Принцип непрерывного (проточного) культивирования микробов состоит в том, что в сосуд, где размножаются микроорганизмы, непрерывно подается свежая питательная среда и одновременно втекает такой же объем культуры. По такому принципу организуются две разновидности технического процесса непрерывного культивирования: процесс (технология) полного вытеснения и технология полного смещения.
Технология полного вытеснения.
При технологии полного вытеснения сосуд для выращивания микроорганизмов (трубчатый ферментер) представляет собой трубку, расположенную горизонтально или вертикально, в которую втекают среда и посевной материал и вытекает культура. Перемешивание не производится.
S0 – концентрация субстрата в поступающей питательной среде
S – концентрация субстрата в вытекающей питательной среде
Х0 – концентрация биомассы в поступающем посевном материале
Х – концентрация вытекающей биомассы
Таким способом сравнительно легко и несложно культивировать микроорганизмы, не требующие аэрации. С одной стороны ферментера подаются среда и посевной материал, где микробная популяция находится в начале своего развития. По ходу трубки культура «стареет», субстрат исчерпывается, накапливаются продукты метаболизма и вытекающая культура приходит в состояние аналогичное стационарной фазе роста периодической культуры. В результате такого процесса в ферментере воспроизводится полная кривая роста, но не во времени, а в пространстве. В настоящее время появились ферментативные аппараты, обеспечивающие процессы с режимом, приближающимся к полному вытеснению и при аэробном культивировании.
Процесс полного вытеснения применяется в промышленности в тех случаях, когда желательно избежать потери времени на опорожнение, стерилизацию и заполнение емкости. Его применяют в пищевой промышленности, когда используются сложные среды и стоит задача наиболее экономично провести процесс аналогичный тому, который ведется в периодическом режиме.
Пример практического применения рубчатого ферментера – анаэробная стадия при производстве пива в бешенных проточных емкостях. В этих случаях не требуется аэрации и процесс идет без перемешивания. Если этот процесс аэробный, то его ведут в батарее аэрируемых ферментеров. При этом кривая роста периодической культуры распределяется по ходу батарее.
Технология полного смешивания.
В процессе полного смешивания рост культур происходит в емкости – ферментере при интенсивном перемешивании. Перемешивание достигается продуванием воздуха или работой мешалки (или тем и другим одновременно). Во всей массе культуры условия должны быть совершенно одинаковыми. В ферментере создаются условия соответствующие одной точки кривой роста культуры. При больших потоках среды эти условия близки к фазе логарифмического роста, при малых – приближаются к условиям стационарной фазы роста культур. При таком методе может быть воспроизведена любая точка роста периодической культуры. В установившемся режиме скорость потока среды, отнесенная к объему культуры в ферментере, называют коэффициентом разбавления. Коэффициент разбавления равняется удельной скорости роста µ.
D = 
= µ
D – коэффициент добавления
F – скорость потока среды
V – объем культуры в ферментере
µ- удельная скорость роста
Это означает, что культура находится в устойчивом стационарном состоянии, в результате концентрация биомассы (Х) в ферментере остается постоянной. В таком случае скорость роста определяется коэффициентом разбавления. Она уравнивается с ним и концентрация субстрата (S) также остается постоянной (равномерно расходуемый субстрат обновляется с равномерной скоростью притока новой питательной среды).
При таком способе культивирования культура (вследствие возникновения феномена синхронизации роста) обладает способностью самостоятельно автоматически подстраиваться к измененным условиям процесса. Если условия изменяются в сторону ускорения роста, то в ферментере повышается концентрация биомассы и понижается концентрация субстрата, при замедлении роста – концентрация биомассы понизится, а концентрация питающего субстрата повысится.
При кратковременном изменении условий культивирования эти состояния микробной популяции обратимы и на изменение скорости потока культура реагирует соответствующим изменением концентрации биомассы и концентрации субстрата, не выходя из стационарного состояния. Однако, следует помнить, что чрезмерное увеличение скорости потока, причины сильно замедляющие рост, могут привести к тому, сто скорость роста (µ) окажется меньше коэффициента разбавления (F). И в таком случае культура вымоется из ферментера.
Воспроизведение в потоке определенной точки кривой роста культур широко применяется в промышленности при наращивании биомассы микроорганизмов. Хорошо отработанный периодический процесс выращивания экономически выгодно воспроизводить в проточном варианте, поскольку культура непрерывно находится в состоянии максимальной активности нужного процесса, не тратится время на освобождение емкостей и лаг-фазу.
При наращивании биомассы в проточных условиях биотехнологический процесс стремятся вести при возможно большей скорости потока, но не настолько большой, чтобы в среде оставался недоиспользованный субстрат. Таким образом получают наибольший экономический коэффициент, который при непрерывном культивировании определяют следующим образом:
D 
=
S0 – концентрация питательного вещества в поступающей среде
S – концентрация питательного вещества в культуре, вытекающей из ферментера
Х – концентрация биомассы в вытекающей культуре
Биотехнологическая реализация способов непрерывного культивирования микроорганизмов.
Существует много способов непрерывного культивирования микроорганизмов, но в биопромышленности в основном применяются два типа:
Хемостатный, при котором состояние равновесия или стационарное состояние достигается путем регулирования поступления лимитирующих рост субстратов;
Турбидостатный, при котором состояние равновесия или стационарное состояние культуры достигается путем удаления биомассы и замещения её свежей средой со скоростью равной скорости роста культуры.
Хемостат в отличии от турбидостата позволяет с высокой скоростью регулировать условия лимитирования роста (субстратное лимитирование), тогда как турбидостат предпочтительнее для изучения микроорганизмов в условиях близких к максимальной удельной скорости роста.
Источник
