Назовите способ фиксации мазка

Назовите способ фиксации мазка

Для приготовления окрашенных препаратов из исследуемого объекта готовят мазки и фиксируют их.

Рис. 11-8. Приготовление мазков из материала с тампонов (А) и непрозрачных жидкостей (Б)

Окрашенные мазки. Отбор материала для микроскопии

Тампоны, содержащие микроорганизмы, прокатывают по предметному стеклу (рис. 11-8, А); с их помощью также готовят мазки из непрозрачных жидкостей, например взвеси испражнений (рис. 11-8, Б). Мазки из материалов со слизистой или грубой консистенцией готовят растиранием их между двумя предметными стёклами (рис. 11-9). Прозрачные жидкости (например, мочу или СМЖ) можно нанести в виде капли на предметное стекло (рис. 11-10, А), при этом границы капли желательно обвести маркёром. Лучшие результаты даёт предварительное центрифугирование; затем осадок наносят на стекло; если он густой, его можно распределить с помощью стеклянной палочки (рис. 11-10, Б).

Рис. 11-9. Приготовление мазков из материала со слизистой оболочки или грубой консистенцией.

Фиксация препарата. Фиксация мазка. Фиксация бактерий

В практической бактериологии наиболее распространена термическая фиксация (над пламенем горелки) — метод грубый, но сохраняющий морфологию и отношение к красителям у бактерий. Для более детального изучения структуры клеток применяют фиксирующие растворы, предотвращающие ферментативный аутолиз бактерий и стабилизирующие макромолекулы путём химического их сшивания. Для светоопти-ческой микроскопии используют формалин, спирты, глутараль-дегид, жидкость Карнуа, ацетон, пары осмиевой кислоты и др.

Рис. 11-10. Приготовление мазков из прозрачных жидкостей (А) и из осадка после центрифугирования (Б).

Мазки фиксируют, помещая их в раствор фиксатора или нанося фиксаж на мазок. Для электронной микроскопии применяют глутаральдегид и тетраоксид осмия.

Источник

Назовите способ фиксации мазка

Содержимое заднего свода влагалища для исследования берут браншей пинцета, узким деревянным шпателем или стеклянной пипеткей длиной 20 см, диаметром 5—7 мм с изогнутым дистальным концом и резиновым баллоном на проксимальном конце. Так как особенности влагалищного содержимого могут быть различными в зависимости от длительности пребывания во влагалище и особенностей его моторной функции, рекомендуется за 2 дня до взятия мазка механически очистить влагалище от содержимого и воздерживаться от влагалищных манипуляций и половых сношений. У девственниц содержимое влагалища берут проволочной петлей через ушное или носовое зеркало или с помощью детского вагиноскопа.

Предметные стекла для влагалищных мазков должны быть предварительно обезжирены. Мазок делают с помощью шлифопанного стекла. Он должен быть тонким. При скудном содержимом влагалища насасывают в пипетку до взятия мазка каплю изотонического раствора хлорида натрия и разведенные выделения наносят на стекло. Мазок фиксируют по влажном состоянии в течение 15 мин смесью 96% этилового спирта и диэтилового эфира (1 : 1). Мазок может оставаться в фиксирующем растворе в течение 15 дней.

При подготовке влагалищного мазка для полихромной окраски рН фиксирующего раствора снижают с 6,9—7 до 5,6—6, что способствует большей восприимчивости клеток к ацидофильной окраске. Для этого мазок фиксируют смесью из изопропилового спирта (97,5 части) и ледяной уксусной кислоты (2,5 части).

1. Упрощенный метод окраски. Высушенный на воздухе мазок окрашивают 1 % раствором метиленового синего в течение 2 мин или раствором фуксина (3 г фуксина+96 мл абсолютного спирта) в течение 1 мин. Краску смывают проточной водой и мазок высушивают.

2. Окраска гематоксилин-эозином. Фиксированный в смеси спирта с эфиром мазок окрашивают в течение 15 мин в растворе гематоксилина, смывают краску водой, окрашивают на протяжении 3—5 мин эозином и повторно смывают водой. Для обесцвечивания ядер мазок проводят последовательно через 70% (5 мин), 95% (5 мин) и 100% (8 мин) спирт, высушивают, помещают на 15 мин в ксилол и заключают в канадский бальзам.

3. Полихромная окраска. Применяются три краски — гематоксилин для окрашивания ядер клеток влагалищного эпителия, оранж 0,6 (ацидофильная) и зелень лихтгрюн Lumiere EA-31 (базофильная).

Фиксированный мазок проводят последовательно через 70% и 50% спирт, погружают в дистиллированную воду, окрашивают в течение 5— 10 мин гематоксилином. Промывают в дистиллированной воде, 4—5 раз в 0,5% водном растворе НСl, а затем проточной водой. На 1 мин мазок погружают в карбонат кальция (3 капли насыщенного водного раствора на 100 мл воды) и проводят последовательно через 50%, 70%, 80% и 95% спирт, в течение 3—4 мин окрашивают оранжем, проводят дважды через 95% спирт, погружают на 10—15 мин в краску ЕА-31, затем в 95% и абсолютный спирт и заключают в канадский бальзам.

Ядра влагалищных клеток окрашиваются интенсивно в светло-синие, темно-пурпурные тона, цитоплазма базофильных клеток — в голубовато-зеленоватые тона, цитоплазма ацидофильных клеток — в желтовато-оранжевые, розовато-красные тона.

Влажный фиксированный мазок окрашивают специальным сложным составом из ряда красок в течение 2 мин. Последовательно проводят мазок через 70%, 90% и абсолютный спирт, помещают в ксилол и заключают в канадский бальзам.

Состав краски: а) этилового спирта 100 мл, шарлаха бибиховского 0,5 г, оранжа 0,25 г, зеленой 0,075 г, фосфорно-молибденовой кислоты 0,5 мл, фосфорно-вольфрамовой кислоты 0,5 мл, ледяной уксусной кислоты 1 мл;

б) фосфорно-вольфрамовой кислоты 0,5 мл, фосфорно-молибденовой кислоты 0,5 мл, ледяной уксусной кислоты 1 мл, эритрозина 0,5 г, бриллиантового зеленого 0,075 г, 20% водного раствора анилинового синего 20 мл, 60% спирта 80 мл.
Окраска цитоплазмы и ядер клеток аналогична окраске по методу Паваниколау.

Комбинация приведенных выше методов окраски. Фиксированный мазок на 2—4 мин помещают в приготовленный полихромный протоплазменный краситель, затем последовательно помещают в 75% и 95% спирт и ксилол. Высушивают и заключают в кедровое масло.

Состав краски: оранжа 0,100 г, эритрозина 0,250 г, лихтгрюна 0,200 г, фосфорно-молибденовой кислоты 0,200 г, фосфорно-вольфрамовой кислоты 0,200 г, ледяной уксусной кислоты 1 г, 50% спирта 100 мл. Для приготовления краски 50% спирт разделяют на три равные части, в каждой из них растворяют отдельно оранж, лихтгрюн и эритрозин. После полного растворения каждой краски все смешивают и добавляют остальные реактивы.
Цитоплазма базофильных клеток окрашивается в светло-зеленые тона, ацидофильных — в золотисто-розовые.

Для лучшего прокрашивания ядер способ окраски несколько видоизменяют. Фиксированный мазок окрашивают гематоксилином в течение 1 мин, промывают проточной водой, после чего в течение 2—4 мин окрашивают описанным выше способом полихромным красителем.

Фиксированный одним из описанных выше способов мазок промывают в течение 2 мин в дистиллированной воде, окрашивают в течение 1—3 мин гематоксилином, промывают в течение 4—10 мин проточной водой, на 2 мин помещают в смесь из 70% изопропилового спирта с 2,5% уксусной кислоты; окрашивают по второму способу, промывают и снова помещают на 2 мин в смесь изопропилового спирта с уксусной кислотой (2,5%), на 2 мин в изопропиловый спирт, на 2 мин в ксилол и заключают в канадский бальзам.

Источник

Способы фиксации мазков из микробов и смешанного материала

Фиксация необходима для инактивации бактерий и прикрепления (фиксации) их к стеклу, предотвращения аутолизиса клеток и улучшения восприятия красителя.

а) Самым распространённым методом фиксации бактерий считается обработка жаром, что осуществляется путём трёхкратного проведения препарата мазком кверху через пламя спиртовки или газовой горелки. Препарат находится в пламени спиртовки З секунды. После чего препараты из бактерий окрашиваются разными способами. Метод применим при работе с чистой культурой микробов.

б) Фиксация химическими веществамииспользуется для выявления и дифференциации структурных элементов: жгутиков, протоплазмы, нуклеоида, оболочки, при работе со смешанным материалом (кровь, отпечатки органов, соскобы со слизистых, гной, мокрота). В качестве фиксаторов используют:

— метиловый спирт (фиксируют 5 минут),

— этиловый спирт (фиксируют 20 минут),

— смесь Никифорова: равные объёмы спирта и эфира (фиксируют 20 минут),

— спирт — формол: смесь 5мл неразведённого формалина мл и 96 % этилового спирта (фиксируют 15 минут),

— жидкость Боуэна: неразбавленный формалин 10 мл, ледяная уксусная кислота 2 мл, насыщенный водный раствор пикриновой кислоты 30 мл (фиксируют 30 минут),

— жидкость Карнуа — ледяная уксусная кислота 10 мл, хлороформ 30 мл и 96 % спирт (фиксируют 15 минут).

Ориентировочная окраска бактерий простыми методами.

Окраска выявляет морфологию и частично структуру клетки.

Для простой окраски используют один из красителей:

а) разведённый (1:10) карболовый фуксин, окрашивают 10-30 сек. (метод Леффлера), промывают водой, высушивают на воздухе;

б) водньий раствор метиленовой синьки Леффлера окрашивают 3-10 минут, промывают водой, высушивают на воздухе.

Микроскопия препарата с иммерсионным объективом

Иммерсионный объектив даёт увеличение х90 при условии отсутствия рассеивания потока лучей в связи с неоднородностью среды при их прохождении.

В этой связи, во избежание такого дефекта применяется иммерсионное кедровое масло или его заменитель — вазелиновое масло. Процесс микроскопии с иммерсионным объективом х90 ведут с окулярами х7, х10, но чаще с первым из них. Техника микроскопии состоит из нескольких этапов:

1. На готовый окрашенный мазок наносят каплю масла.

2. Под контролем глаза сбоку осторожно опускают тубус, погружая объектив в каплю масла. При неосторожном выполнении можно раздавить либо линзу объектива, либо предметное стекло.

3. После прикосновения объектива к маслу дальнейшее опускание тубуса ведётся с помощью микровинта микроскопа до появления микрообъектов в окуляре.

4. Просмотр препарата ведут только за счёт манипуляций с микровинтом и движения стекла.

5. После окончания микроскопии тубус поднимают, объектив выходит из капли масла.

6. Масло с объектива удаляют чистой ваткой или марлей и протирают жирорастворителем — либо ксилолом, либо спиртом, либо хлороформом. Оставлять масло на линзе объектива нельзя.

7. Револьверную часть на тубусе устанавливают на объектив х8, конденсор и тубус опускают, переводя в нерабочее состояние, и закрывают микроскоп колпаком.

Источник

Назовите способ фиксации мазка

Для приготовления окрашенных препаратов из исследуемого объекта готовят мазки и фиксируют их.

Рис. 11-8. Приготовление мазков из материала с тампонов (А) и непрозрачных жидкостей (Б)

Окрашенные мазки. Отбор материала для микроскопии

Тампоны, содержащие микроорганизмы, прокатывают по предметному стеклу (рис. 11-8, А); с их помощью также готовят мазки из непрозрачных жидкостей, например взвеси испражнений (рис. 11-8, Б). Мазки из материалов со слизистой или грубой консистенцией готовят растиранием их между двумя предметными стёклами (рис. 11-9). Прозрачные жидкости (например, мочу или СМЖ) можно нанести в виде капли на предметное стекло (рис. 11-10, А), при этом границы капли желательно обвести маркёром. Лучшие результаты даёт предварительное центрифугирование; затем осадок наносят на стекло; если он густой, его можно распределить с помощью стеклянной палочки (рис. 11-10, Б).

Рис. 11-9. Приготовление мазков из материала со слизистой оболочки или грубой консистенцией.

Фиксация препарата. Фиксация мазка. Фиксация бактерий

В практической бактериологии наиболее распространена термическая фиксация (над пламенем горелки) — метод грубый, но сохраняющий морфологию и отношение к красителям у бактерий. Для более детального изучения структуры клеток применяют фиксирующие растворы, предотвращающие ферментативный аутолиз бактерий и стабилизирующие макромолекулы путём химического их сшивания. Для светоопти-ческой микроскопии используют формалин, спирты, глутараль-дегид, жидкость Карнуа, ацетон, пары осмиевой кислоты и др.

Рис. 11-10. Приготовление мазков из прозрачных жидкостей (А) и из осадка после центрифугирования (Б).

Мазки фиксируют, помещая их в раствор фиксатора или нанося фиксаж на мазок. Для электронной микроскопии применяют глутаральдегид и тетраоксид осмия.

Источник

Приготовление мазков и их фиксация

Приготовление окрашенного препарата состоит из следующих этапов:

1) приготовление мазков;

2) высушивание мазка;

3) фиксация мазка;

Для приготовления препарата, на обезжиренное предметное стекло, наносят каплю воды или физиологического раствора, в которую петлей вносят исследуемый материал и распределяют тонким равномерным слоем по стеклу на площади приблизительно 1 см 2 . Если исследуемый материал находится в жидкой среде, то его непосредственно наносят петлей на предметное стекло и готовят мазок. Мазки высушивают на воздухе или в струе теплого воздуха над пламенем спиртовки, не давая капле закипать.

Для фиксации мазка предметное стекло (мазком вверх) медленно проводят 3-4 раза через пламя спиртовки. Микроорганизмы при фиксации погибают, плотно прикрепляются к поверхности стекла и не смываются при дальнейшей обработке. Более длительное нагревание может вызвать деформацию клеточных структур.

При фиксации с помощью химических веществ используют хромовые соединения, формалин, осмиевую кислоту, ацетон. Один из распространенных приемов фиксации — обработка препарата метиловым или этиловым спиртом, или смесью Никифорова (равные объемы этилового спирта и эфира). При этом препарат погружают на 5-20 мин. в фиксирующую жидкость.

Методы окраски мазков и красители, используемые в микробиологии.

Существуют простые и сложные методы окраски. При простой окраске используют какой-либо один из красителей, например, фуксин водный (1-2 мин.), метиленовый синий (3-5 мин.). При окрашивании мазка препарат помещают на препаратодержатель. На мазок наносят несколько капель красителя. После истечения времени окрашивания препарат промывают водой, фильтровальной бумагой удаляют излишки воды, высушивают на воздухе и микроскопируют.

При сложной окраске последовательно наносятся на препарат определенные красители, различающиеся по химическому составу и цвету. Это позволяет выявить определенные структуры клеток и дифференцировать одни виды микроорганизмов от других. Таковы методы окраски по Грамму, по Цилю-Нильсену, окраска спор по методу Ожешки.

Красители, у которых при диссоциации выделяются водородные ионы, придающие красителю кислый характер, называются кислыми. Они окрашивают (в виде аниона) вещества основной природы. Красители, у которых при диссоциации выделяются гидроксильные ионы, — основными.

В микробиологической практике кислые и основные красители используются в виде солей, так как они способны вступать в реакцию с кислотами и основаниями. Основные красители чаще применяются в виде солей соляной, реже уксусной и серной кислот; кислые красители – в виде натриевых или калийных солей.

Источник