Назначение среды клиглера ее состав способ использования

Назначение среды клиглера ее состав способ использования

1. Среда Клиглера. Среда Клиглера предназначена для дифференциации энтеробактерий по их способности ферментировать глюкозу, лактозу и образовывать сероводород.

Состав:
Мясная вода — 1000,0 мл
Пептон — 20,0 г
Лактоза —10,0 г
Глюкоза — 1,0 г
Натрия хлорид (NaCl) — 5,0 г
Натрия сульфит (Na₂SO₃*7H₂O) — 0,4 г
Натрия тиосульфат (Na₂S₂O₃*5H₂O) — 0,08 г
Железа II сульфат (Fe₂SO₄*7H₂O) — 0,5 г
Агар — 20,0 г
Феноловый красный (1%-ный раствор в 50%-ном этиловом спирте) — 12,0 мл
pH 7,4±0,2

В мясную воду добавляют пептон, соли натрия, агар. Кипятят до полного растворения, устанавливают pH 7,8, снова кипятят. Фильтруют через ватно-марлевый фильтр, затем добавляют остальные ингредиенты. Сульфат железа предварительно растворяют в небольшом количестве воды. Готовую среду разливают в пробирки по 6,0-7,0 мл. Стерилизуют при 112°С 30 мин. Скашивают, оставляя столбик высотой 2,0-2,5 см.

Готовая среда перед употреблением имеет красноватый или оранжево-красный цвет. Посев материала на среду Клиглера производят вначале по скошенной части в виде прямой линии, затем уколом в толщу агарового столбика. Петля не должна достигать дна, чтобы не нарушать анаэробных условий культивирования. Посевы инкубируют при 37°С. Результаты роста анализируют не позже чем через 18-24 ч после посева.

Расщепление сахаров, сопровождающееся образованием кислот, устанавливают при помощи индикатора фенолового красного (в кислой среде желтеет). Рост микроорганизмов начинается с утилизации сахаров. В первые 5-6 ч инкубации штаммы, расщепляющие только глюкозу, но не лактозу, утилизируют содержащуюся в невысокой концентрации (0,1%) глюкозу в скошенной части агара, изменяя цвет косяка с красноватого на желтый.

В течение последующих 18-24 ч глюкоза косяка полностью утилизируется. В благоприятных условиях кислой среды вступают в действие энзимы бактерий, использующие в качестве белковой питательной основы пептоны. Расщепление последних с образованием аммиака сопровождается смещением pH в косяке в щелочную зону с восстановлением его первоначального красноватого цвета.

В это же время происходит ферментация глюкозы в анаэробных условиях, в столбике агара. К моменту анализа результатов желтый цвет в столбике еще сохраняется, хотя глюкоза за этот срок уже ферментирована, но кислые продукты ее расщепления в анаэробных условиях тоже еще сохраняются, поддерживая низкое значение pH. Среда выглядит таким образом — желтый столбик и красный скос. Лактозоположительные штаммы через 18-24 ч культивирования сохраняют подкисление всей среды и соответственно желтый цвет и столбика, и косяка. Объясняется это тем, что концентрация лактозы в среде в 10 раз выше концентрации глюкозы (1%), поэтому к моменту учета результатов лактоза не исчерпана не только в столбике, но и в косяке среды.

Такие же изменения среды вызывают штаммы, расщепляющие и глюкозу, и сахарозу.

Однако на вторые сутки (через 40-48 ч) инкубации посевов будет наблюдаться щелочение среды с покраснением скошенной ее части за счет расщепления пептонов, а следовательно, учет ферментации сахаров надо производить не позднее 24 ч.

При ферментации углеводов конечными продуктами метаболизма могут быть H₂ и CO₂. В этих случаях в среде отмечаются трещины и разрывы, при скоплении газа на дне пробирки столбик агара приподнимается.

Некоторые бактерии продуцируют энзим тиосульфатредуктазу, способную из неорганических соединений серы образовывать не видимый глазу газообразный сероводород. Для его обнаружения в среду Клиглера вводят железа II сульфат. Реакция образования сероводорода протекает в два этапа:

— в начале в кислой среде, в анаэробных условиях под действием микробной тиосульфатредуктазы тиосульфат восстанавливается в тиосульфит с выделением бесцветного водорода;

— введенный в среду железа сульфат (FeSO₄) вступает в реакцию с сероводородом (H₂S), образуя сернистое железо (FeS) в виде нерастворимого преципитата черного цвета, в результате чего столбик среды приобретает черный цвет.

2. Трехсахарный агар с солями железа (TSI) в модификации НИИ вакцин и сывороток им. И.И.Мечникова. Среда предназначена для дифференциации энтеробактерий по признаку ферментации углеводов..

Принцип действия среды тот же, что для агара Клиглера.

Состав:
Вода мясная — 1000,0 мл
Экстракт дрожжевой жидкий — 100,0 мл
Экстракт дрожжевой (по сухой массе) — 3,0 г
Пептон — 20,0 г
Натрия хлорид — 3,5 г
Агар — 15,0 г
Железа II сульфат (перекристаллизованный) FeSO₄ — 0,2 г
Натрия тиосульфат (Na₂S₂O₃) — 0,3 г
Глюкоза — 1,0 г
Лактоза — 10,0 г
Сахароза — 10,0 г
Феноловый красный (0,2% водный раствор) — 12,0 г
pH 7,0±0,1

Готовят основу среды. К мясной воде добавляют дрожжевой экстракт, пептон, натрия хлорид и агар. Смесь подогревают до расплавления агара, устанавливают pH. Среду фильтруют, разливают в матрицы или колбы по 0,5 л, стерилизуют при 121°С 30 мин.

К стерильной основе добавляют остальные ингредиенты, хорошо перемешивая, разливают асептически в стерильные пробирки по 6-7 мл, стерилизуют текучим паром или при 112°С 30 мин. Скашивают в горячем виде, оставляя столбик высотой 2,0-2,5 см.

Посев производят так же, как на среду Клиглера.

Принцип действия трехсахарного агара с железом (TSI) аналогичен механизму действия среды Клиглера. Роль сахарозы в среде заключается в том, что она позволяет распознавать и исключать некоторые ферментирующие сахарозу и не ферментирующие лактозу штаммы из групп Proteus и Escherichia.

Hafnia и Providencia не ферментируют лактозу или ферментируют ее крайне медленно, в то же время они быстро ферментируют сахарозу, что отличает их от групп Salmonella и Shigella.

В случаях с неявными результатами делают дополнительно посевы на среды Гисса с лактозой и сахарозой.

3. Трехсахарный агар с железом, HiMedia, TSI, Triple Sugar Iron Agar. Среда предназначена для дифференцирования энтеробактерий по способности расщеплять декстрозу, лактозу, сахарозу и продуцировать сероводород. Среда может быть использована для проведения ONPG-теста.

Состав, г/л:
Пептон — 10,0
Триптон — 10,0
Экстракт дрожжевой — 3,0
Экстракт говяжий — 3,0
Лактоза — 10,0
Сахароза — 10,0
Декстроза — 1,0
Железа сульфат — 0,2
Натрия хлорид — 5,0
Натрия тиосульфат — 0,3
Феноловый красный — 0,02
Агар — 12,0
pH 7,4±0,2

Навеску среды 65,0 г растворяют при нагревании в 1000,0 мл дистиллированной воды. Среду доводят до кипения. Устанавливают pH. Разливают в пробирки по 7,0 мл.

Стерилизуют при 121°С в течение 15 мин. После стерилизации среду скашивают с образованием столбика 2,0-2,5 см. Готовая к употреблению среда имеет розово-красный цвет.

4. Среда Ресселя (двухсахарный агар), сухая. Предназначена для дифференциации энтеробактерий по способности ферментировать 2 сахара.

Состав, г/л:
Гидролизат казеина панкреатический — 8,7
Натрия хлорид — 4,3
Лактоза — 10,0
Глюкоза — 1,0
Бромтимоловый синий — 0,03
Агар — 9,0
pH 7,2±0,2

Навеску среды 33,0 г растворяют в 1000,0 мл дистиллированной воды и нагревают. При необходимости устанавливают pH. Затем фильтруют и разливают в пробирки по 6-7 мл. Стерилизуют при 121°С в течение 20 мин. После стерилизации среду скашивают, оставляя внизу столбик высотой 2,0-2,5 см. Готовая к употреблению среда имеет зеленовато-голубой цвет.

Среду засевают непосредственно материалом из колонии уколом и по поверхности скоса. Энтеробактерии, расщепляющие оба сахара, вызывают равномерное изменение окраски всей среды (в желтый цвет) за счет обильного кислотообразования. Бактерии, расщепляющие только глюкозу, окрашивают среду в столбике, а участок скоса сохраняет исходный голубой цвет. Газообразование учитывается по наличию пузырей и разрывов в толще агара.

При самостоятельном изготовлении среды в лабораториях в качестве основы используется 1%-ной МПА. Возможна замена сахарозы на лактозу (1%).

5. Трехсахарный агар с мочевиной (среда И.С.Олькеницкого). Среда И.С.Олькеницкого предназначена для дифференциации энтеробактерий по их способности сбраживать углеводы: лактозу, глюкозу, сахарозу — и ферментировать мочевину с выделением аммиака.

Состав:
Агар питательный сухой — 25,0 г
Лактоза — 10,0 г
Сахароза — 10,0 г
Глюкоза — 1,0 г
Аммония железа (II) сульфат [(NH₄)₂FeSO₄*12H₂O] — 0,2 г
Натрий тиосульфат Na₂S₂O₃*5H₂O — 0,3 г
Мочевина — 10,0 г
Феноловый красный (0,4%-ный водный раствор) — 4,0 мл
Вода дистиллированная — 1000,0 мл
pH 7,3±0,1

Соли предварительно растворяют в небольшом количестве дистиллированной воды. Углеводы и мочевину растворяют таким же образом при подогреве на водяной бане. Сухой питательный агар расплавляют в остальном объеме воды при нагревании на огне и постоянном перемешивании. Затем все ингредиенты перемешивают с расплавленным агаром, фильтруют через марлевый фильтр, устанавливают pH.

Добавляют индикатор, хорошо перемешивают с расплавленным агаром, разливают в пробирки по 6,0-7,0 мл. Стерилизуют текучим паром 3 дня подряд 20 мин или при 110°С в течение 20 мин. Скашивают, оставляя столбик 2,0-2,5 см. Готовая среда бледно-розового цвета.

Реакции ферментации углеводов и образования сероводорода те же, что и на среде Клиглера. Присутствие в среде мочевины позволяет определить у культуры наличие уреазы.

Расщепление мочевины завершается образованием аммиака, что сопровождается резким смещением pH среды в щелочную зону (pH 8,0-8,2), в результате чего столбик и скошенная часть агара приобретают красный цвет, поэтому при исследовании уреазоположительных штаммов анализ ферментации углеводов невозможен. Для определения их сахаролитической активности требуются специальные среды (например, среды Гисса).

6. Среды для теста на органические кислоты, (D-, L-, I-тартрат, мукат, цитрат).

Среды предназначены для дифференциации сальмонелл и близкородственных микроорганизмов.

Состав, г/л:
Основа сред:
Пептон — 10,0
Бромтимоловый синий — 0,024
Варианты ингредиентов:
D-тартрат (правовращающая соль) — 10,0
или L-тартрат (левовращающая соль) — 5,0
или I (мезо)-тартрат (оптически инертная соль) — 5,0 или мукат (слизевая кислота) — 10,0
или натрия цитрат (нейтральный) — 10,0
pH 7,4+0,1

Пептон и индикатор растворяют в 1000,0 мл дистиллированной воды, добавляют 1% соответствующей соли винной кислоты (D-, L-, 1-тартрат, натриевая или калийная соль). Устанавливают pH при помощи 10%-ного раствора NaOH. Разливают по 3,0-5,0 мл в пробирки. Стерилизуют при 112°С в течение 20 мин. Готовая к употреблению среда — сине-зеленого цвета.

Основу среды для определения утилизации муката (слизевой кислоты) вначале стерилизуют при том же режиме. Затем в горячую среду асептически вносят стерильный раствор слизевой кислоты (до 1%). Устанавливают pH посредством 10%-ного раствора NaOH. Разливают по 3,0-4,0 мл в стерильные пробирки (допускается стерилизация среды со слизевой кислотой при 112°С в течение 10 мин). Необходим строгий контроль стерильности готовой среды.

При положительном результате среды приобретают желто-зеленый цвет.

7. Среда с малонатом натрия (модификация Ewing), HiMedia, Malonate Broth, Ewing modified.

Среды предназначены для дифференциации энтеробактерий по признаку утилизации соли малоновой кислоты.

Состав, г/л:
Экстракт дрожжевой — 1,0
Аммония сульфат — 2,0
Калия дигидрофосфат — 0,4
Калия гидрофосфат — 0,6
Натрия хлорид — 2,0
Натрия малонат — 3,0
Глюкоза — 0,25
Бромтимоловый синий — 0,025
pH 6,7±0,2

Навеску среды 9,28 г растворяют в 1000,0 мл дистиллированной воды, доводят до кипения, при необходимости фильтруют. Устанавливают pH. Среду разливают в пробирки по 2,0-3,0 мл. Стерилизуют при 112°С 30 мин или при 121°С 15 мин, скашивают. Готовая среда имеет светло-зеленый цвет. При положительном результате среда становится ярко-синей.

8. Среда Козера. Среда предназначена для дифференциации энтеробактерий по способности утилизировать цитрат.

Состав, г/л:
Натрий аммония фосфат (NH₄NaHPO₄) — 1,5
Калия фосфат однозамещенный KH₂PO₄ — 1,0
Магния сульфат (MgSO₄*7H₂O) — 0,2
Натрия цитрат — 3,0
pH 6,7±0,2

Навеску среды 5,7 г растворяют при нагревании в 1000,0 мл дистиллированной воды, разливают в пробирки по 3,0-5,0 мл. Стерилизуют при 121°С в течение 15 мин. Готовая к употреблению среда бесцветна, прозрачна.

Культуры, не утилизирующие цитрат, на среде Козера не растут, и она остается прозрачной.

Редактор: Искандер Милевски. Дата публикации: 27.2.2020

Источник

Агар Клиглера-ГРМ Оболенск

Питательная среда для идентификации энтеробактерий по их способности ферментировать лактозу, глюкозу, образовать газ и сероводород, сухая.

Агар Клиглера-ГРМ Оболенск

ИНСТРУКЦИЯ

по применению набора реагентов для бактериологических исследований

«Питательная среда для идентификации энтеробактерий сухая

Агар Клиглера-ГРМ Оболенск»

(дата утверждения 10.01.2007 г., дата актуализации 01.02.2017 г.)

НАЗНАЧЕНИЕ

Набор реагентов для бактериологических исследований «Питательная среда для идентификации энтеробактерий сухая (Агар Клиглера-ГРМ Оболенск)» предназначен для бактериологических исследований в санитарной и клинической микробиологии с целью идентификации энтеробактерий по их способности ферментировать лактозу, глюкозу, образовывать газ и сероводород при диагностике инфекционных заболеваний «in vitro».

1. характеристика набора

Агар Клиглера-ГРМ Оболенск представляет собой мелкодисперсный, гигроскопичный, светочувствительный порошок кремового цвета.

Выпускается в полиэтиленовых банках по 250 г.

2.1. ПРИНЦИП ДЕЙСТВИЯ

Совокупность компонентов, входящих в состав набора, обеспечивает питательные потребности для роста и идентификации по биохимическим свойствам отдельных видов микроорганизмов.

2.2. СОСТАВ набора

Агар Клиглера-ГРМ Оболенск представляет собой смесь сухих компонентов из расчета, г/л:

Панкреатический гидролизат рыбной муки жидкий …………	20,0
Д (+)-лактоза, 1-водная ………………………………………	20,0
Натрия хлорид …………………………………………………	5,0
Натрия тиосульфат …………………………….…………….	0,3
Глюкоза …………………………………………………..…..	1,0
Железа окисного цитрат……………………………………………………	0,3
Феноловый красный………………………………………………………..	0,05
Натрия сульфит………………………………………………………………..	0,5
Натрия карбонат………………………………………………………………	0,01-0,25
Агар микробиологический …………………………………..	10,0±3,0

20,5

Панкреатический гидролизат рыбной муки с тиосульфатом натрия сухой……………………………………………………………………
Дрожжевой экстракт …………………………………………	3,0
Д (+)-лактоза, 1-водная ……………………………………….	20,0
Натрия хлорид .……………………………………………….	3,0
Глюкоза ………………………………………………………..	1,0
Железа сульфат, 7-водное …………………………..………..	0,2
Железа окисного цитрат…………………………………………………..	0,1
Феноловый красный………………………………………………………..	0,05
Натрия сульфит……………………………………………………………….	0,5
Натрия карбонат………………………………………………………………	0,01-0,25
Агар микробиологический …………………………………..	10,0±3,0

Определение pH проводят потенциометрическим методом с применением стеклянного электрода в соответствии с МУК 4.2.2316-08 «Методы контроля бактериологических питательных сред» в экстракте, приготовленном путем добавления к 2,00 г сухого агара Клиглера-ГРМ 100 мл дистиллированной воды, настаивания с периодическим перемешиванием в течение 1 ч при температуре 18-25 °С и последующего фильтрования через бумажный фильтр.

Величина рН, определенная по МУК 4.2.2316-08, является условной величиной, которая соответствует значению рН готовой среды и может незначительно меняться после стерилизации. Пределы значения рН, указанные выше, учитывают отклонения рН после стерилизации среды.

АНАЛИТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ

Агар Клиглера-ГРМ Оболенск обеспечивает во всех засеянных пробирках рост каждого тест-штамма Salmonella typhi «bismuth», Salmonella paratyphi B 8006, Shigella sonnei
«S form», Escherichia coli 3912/41(055:K59), Providencia alcalifaciens 1068-50 (Proteus inconstans 1068-50), Proteus mirabilis Сиднеев, Pseudomonas aeruginosa 613-60 при посеве культуры по одной бактериологической петле диаметром 2 мм не позднее 48 ч инкубации при температуре (37±1) °С со следующими биохимическими характеристиками:

1. typhi «bismuth» не расщепляет лактозу, ферментирует глюкозу без образования газа, слабо продуцирует сероводород;
2. paratyphi B 8006 не расщепляет лактозу, ферментирует глюкозу с образованием газа, продуцирует сероводород.
3. coli 3912/41 (055:K59) ферментирует лактозу, глюкозу с образованием газа, не продуцирует сероводород.
4. sonnei «S form» не расщепляет лактозу, ферментирует глюкозу без образования газа, не продуцирует сероводород;
5. P. alcalifaciens 1068-50 не расщепляет лактозу, ферментирует глюкозу со слабым газообразованием, не продуцирует сероводород;
6. mirabilis Сиднеев не расщепляет лактозу, ферментирует глюкозу с образованием газа, продуцирует сероводород;
7. aeruginosa 613-60 не ферментирует лактозу, глюкозу, газа не образует, не продуцирует сероводород.
8. МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ

Агар Клиглера-ГРМ относится к медицинским изделиям с низким индивидуальным риском и низким риском для общественного здоровья – класс 1.

При работе с музейными и выделенными штаммами микроорганизмов необходимо соблюдение СП 1.3.2322-08 «Безопасность работы с микроорганизмами ΙΙΙ-ΙV группы патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней».

ОБОРУДОВАНИЕ И МАТЕРИАЛЫ

1. АНАЛИЗИРУЕМЫЕ ОБРАЗЦЫ

6.1. Чистые культуры микроорганизмов, выделенные из объектов исследования в клинической и санитарной микробиологии.

6.2. Взятие, посев и хранение исследуемого материала проводят в соответствии с приказом Минздрава СССР от 22.04.85 г., № 535 «Об унификации микробиологических (бактериологических методов исследования, применяемых в клинико-диагностических лабораториях лечебно-профилактических учреждений» и другими нормативными документами.

1. Проведение АНАЛИЗа

Исследование проводят в условиях бактериологической лаборатории медицинскими специалистами, имеющие разрешение на работу с микроорганизмами III-IV групп патогенности.

7.1. Приготовление агара Клиглера-ГРМ.

Препарат в количестве, указанном на этикетке для приготовления конкретной серии, размешивают в 1 л дистиллированной воды, кипятят в течение 2-3 мин до полного расплавления агара, фильтруют через ватно-марлевый фильтр, разливают по 7,0 мл в пробирки и стерилизуют автоклавированием при температуре 112 °С в течение 20 мин. После стерилизации среду в пробирках скашивают, оставив столбик высотой 25-30 мм. Готовая среда имеет красный цвет.

Стерильную среду можно использовать в течение 3-х недель при условии ее хранения при температуре 2-8 C или в течение 3 суток при температуре хранения 18-25 °С (хранить пробирки следует в темном месте).

После каждого вскрытия и проведения необходимых исследований банку со средой плотно закрыть и поместить на дальнейшее хранение.

7.2. После соответствующей подготовки по п. 6.2 настоящей инструкции исследуемый материал по одной бактериологической петле культуры каждого тест-штамма с питательного агара засевают в три пробирки с агаром Клиглера-ГРМ, нанося материал сначала штрихом на скошенную поверхность, а затем уколом в столбик среды, не касаясь дна пробирки. Инкубируют при температуре (37±1) °С в течение 48 ч.

РЕГИСТРАЦИЯ И УЧЕТ РЕЗУЛЬТАТОВ

Учет результатов проводят визуально каждые сутки, но не позднее 48 ч инкубации при температуре (37±1) ° С. Ферментацию лактозы учитывают на скошенной части агара Клиглера-ГРМ (среда желтеет), глюкозы – в столбике (среда желтеет), газообразование – по появлению пузырьков воздуха или разрыва среды в столбике, образование сероводорода – по почернению среды в столбике, а при слабом образовании – по почернению на границе столбика и скошенной части среды или, реже, на дне пробирки. В случае отрицательной реакции среда остается красной, либо скошенная поверхность приобретает малиновый оттенок.

Для получения достоверных результатов посевы образцов производить не менее, чем в трех повторностях.

УТИЛИЗАЦИЯ

Серии агара Клиглера-ГРМ, пришедшие в негодность (нарушение целостности упаковки), а также в связи с истекшим сроком годности, утилизируются в соответствии с СанПиН 2.1.7.2790-10 как медицинские отходы, принадлежащие к классу «А» – эпидемиологически безопасные отходы, любым способом, предотвращающим повторное использование, например, сжиганием.

Уничтожение агара Клиглера-ГРМ после проведения биологического контроля осуществляется по СанПиН 2.1.7.2790-10 как медицинские отходы, принадлежащие к классу «Б» с обязательным предварительным обезвреживанием путем автоклавирования в течение
2 ч при температуре (126±1) ˚С.

Обращение с медицинскими отходами следует выполнять согласно схеме, принятой в конкретной организации, осуществляющей медицинскую и (или) фармацевтическую деятельность. Данная схема разрабатывается в соответствии с требованиями вышеуказанных санитарных правил и утверждается руководителем организации.

УСЛОВИЯ ХРАНЕНИЯ, ТРАНСПОРТИРОВАНИЯ И ЭКСПЛУАТАЦИИ ИЗДЕЛИЯ

Агар Клиглера-ГРМ Оболенск необходимо хранить в герметично закрытой упаковке в сухом защищенном от света месте при температуре от 2 до 30 С и относительной влажности не более 60 %. После вскрытия банку со средой хранят до истечения срока годности плотно закрытой, в сухом месте при температуре от 2 до 30 С, избегая попадания влаги.

Агар Клиглера-ГРМ транспортируют всеми видами крытого транспорта при температуре хранения.

Срок годности: 3 года. Среда с истекшим сроком годности и в поврежденной упаковке использованию не подлежит.

Изготовитель гарантирует соответствие Агара Клиглера-ГРМ заявленным в ТУ 9398-030-78095326-2007 требованиям и функциональным характеристикам с начала использования в течение всего срока годности и при соблюдении условий хранения и транспортирования.

Для получения надежных результатов необходимо строгое соблюдение настоящей инструкции по применению.

По вопросам, касающимся качества набора реагентов для бактериологических исследований «Питательная среда для идентификации энтеробактерий сухая (Агар Клиглера-ГРМ)», получения консультации и поддержки следует обращаться в адрес предприятия-изготовителя: 142279 Оболенск, Московская обл., Серпуховский р-н, ФБУН «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии», тел. (4967) 36-00-20, факс 36-01-16.

Источник