Нативный препарат способ приготовления

МИКРОСКОПИЯ НАТИВНОЙ КРОВИ

Методические указания по МНК

РОССИЙСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ ДРУЖБЫ НАРОДОВ

О.О. Анисимова, О.Н. Морылева

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА

МИКРОСКОПИЯ НАТИВНОЙ КРОВИ

Для медицинских работников различных специальностей, преподавателей и студентов медицинских вузов

МОСКВА

Утверждено
Редакционно-издательским советом факультета
повышения квалификации медицинских работников
Университета

Методические указания подготовлены
на факультете повышения квалификации
медицинских работников РУДН

Анисимова О.О., Морылева О.Н.
Лабораторная диагностика. Микроскопия нативной крови: методические указания.

В пособии рассматриваются наиболее актуальные вопросы метода микроскопии нативной крови, указания по методике проведения данного исследования и интерпретации его результатов.

Пособие предназначено для медицинских работников различных специальностей, преподавателей и учащихся медицинских образовательных учреждений.

Фотографии нативной крови, наглядно отражающие содержание методических указаний, опубликованы в пособии «Атлас нативной крови».

© Анисимова О.О., Морылева О.Н., 2010

Содержание

Список сокращений

— биологически активные добавки к пище

— биологически активные вещества

— микроскопия нативной крови

— полимеразная цепная реакция

Введение

Кровь – это уникальная субстанция нашего организма. От ее состава и физико-химических свойств зависит здоровье человека. В свою очередь, состояние крови является отражением всех обменных процессов, протекающих в организме, функциональной активности его органов и систем и, конечно же, патологических нарушений в них.

Со времен изобретения Антонием Левенгуком микроскопа, в изучении свойств крови наука прошла большой путь развития. За этот период создано колоссальное количество методов исследования этой важнейшей жидкой среды организма. Различные типы микроскопии, окраски препаратов, цитохимические и радиоизотопные методы, ИФА, ПЦР – это лишь очень неполный перечень существующих на сегодняшний день способов ее изучения. Но наиболее часто в клинической лабораторной практике для исследования крови используется микроскопия окрашенного мазка. Для этого мазок крови предварительно высушивается, фиксируется и окрашивается, а затем производится подсчёт форменных элементов и описывается морфология клеток. Нативную или живую кровь (без фиксации и окраски) микроскопируют достаточно редко. А между тем исследование «живой» капли – самый простой, информативный и минимально затратный метод исследования крови, который известен давно и широко использовался еще в прошлые века. В силу различных обстоятельств, на определенном этапе медицинская практика отошла от повсеместного использования данного метода. Но, как говорится, «все новое – это хорошо забытое старое».

И вот сегодня, в эру компьютеров и цифровых технологий, внимание к методу исследования нативной крови вновь возрастает и приобретает все большую популярность. Микроскоп удалось соединить с цифровой видеокамерой, телевизором и компьютером, что увеличило его разрешающую способность и дало возможность визуализировать на экране объекты крови, трудно различимые в обычный световой микроскоп, и, что очень важно, сохранять изображения для дальнейшей работы. Это позволило не только просматривать клеточные элементы крови, но и оценивать их динамические функциональные характеристики, выявлять биологические контаминанты в плазме, а также производить демонстрацию исследования пациенту. Последнее обстоятельство очень важно, поскольку включение пациента в диагностический процесс и получение им возможности оценки собственного состояния имеет огромное значение для привлечения его к эффективному сотрудничеству с врачом в вопросах восстановления его собственного здоровья.

В тоже время существуют определенные сложности с адаптацией исследования нативной крови к требованиям стандартизации и контроля качества по системе ФСФОК. В практическом же использовании метода возникает ряд вопросов по идентификации визуализируемых объектов вследствие недостаточного количества научно обоснованных данных по интерпретации результатов. Данные методические указания, опирающиеся на фундаментальную теоретическую базу и обширный исследовательский материал[1], в определенной мере восполнят существующий пробел и помогут упорядочить работу.

Вопросы терминологии

Метод исследования нативной крови под микроскопом не является новым в полном смысле этого слова. Обычная световая микроскопия, применяемая в лабораторной практике сегодня, максимально позволяет увеличивать просматриваемые объекты не более чем в 1500 раз. Этого достаточно для просмотра структуры окрашенных препаратов, но не дает возможности оценки динамических процессов в крови. Современная техника позволила модернизировать световую микроскопию и получить значительно больше информации о визуализируемых объектах. Но суть метода от этого не поменялась. Тем не менее целый ряд практикующих сегодня врачей называет это исследование по-разному: «темнопольник», функциональное гемосканирование и т.д. Эти формулировки ошибочны и затрудняют лицензирование деятельности.

Поэтому обращаем внимание специалистов на тот факт, что в приказах Министерства здравоохранения и социального развития РФ данный метод прописан и значится как микроскопия нативной крови, что полностью согласуется с общепринятой в лабораторной диагностике терминологией и отражает суть данного исследования. Таким образом, исследование под микроскопом капли интактной капиллярной крови в настоящих методических указаниях будет обозначаться в соответствии с официально принятой терминологией, как микроскопия нативной крови или МНК.

Общие вопросы

Метод микроскопии нативной крови подразумевает исследование образца крови сразу после взятия в течение не более 10-15 минут, после чего в крови происходят необратимые изменения. Капельку крови под покровным стеклом изучают сначала обзорно при малом увеличении, затем анализируют морфологию клеток и содержимое плазмы под иммерсией при максимальном увеличении. Важным отличием данного метода от обычных анализов является проведение исследования образца крови без какой-либо его предварительной обработки и в присутствии пациента. Пациент имеет уникальную возможность видеть свои клетки и в процессе исследования получать важнейшую для него информацию.

Перечень необходимого оборудования:

— световой микроскоп с увеличением в 1000-1500 раз с тринокуляром;

— конденсор для темнопольной микроскопии (необходимой опцией не является, т.е. его наличие для работы необязательно);

— адаптированная к микроскопу видеокамера (цифровая или аналоговая) с видеотюнером и S-video-выходом;

— устройство приёма и обработки изображений (компьютер или ноутбук – для приёма и сохранения фотоснимков и видеоизображений и/или телевизор для воспроизведения картинки на экране);

— пакет программного обеспечения.

Цель метода — экспресс-оценка общего состояния организма, включающая:

• определение неколичественных уровней насыщения его кислородом, водой и нутриентами (норма, снижение);
• анализ морфологических характеристик эритроцитов (формы, размеров, интенсивности окраски), по которым можно судить о наличии анемий и некоторых соматических заболеваний;
• оценка состояния лейкоцитов, а по их функциональной активности всей иммунной системы;
• оценка состояния свертывающей системы (склонность к тромбообразованию и прогноз связанных с этим осложнений);
• исследование чистоты плазмы на наличие биологических объектов (бактерий, грибов, других микроорганизмов без их идентификации);
• определение косвенных признаков воспалительных процессов, в т.ч. скрытых;
• определение маркеров сердечно-сосудистых заболеваний;
• признаки интоксикационного синдрома;
• контроль за динамикой восстановительных мероприятий;
• оценка функциональных резервов организма (адаптационных резервов и возможностей к самовосстановлению);
• мотивация пациента на самовосстановление и здоровый образ жизни.

Методика приготовления препарата

Кровь для исследования берут капиллярную, полученную обычным способом, из безымянного или среднего пальца пациента. Капля крови помещается на идеальное по чистоте, обезжиренное стекло и накрывается покровным стеклом, также тщательно обработанным.

Недопустимо использовать стекла сразу из упаковки без обработки и обезжиривания, а также предварительного визуального контроля на микроскопе при 400-кратном увеличении! Грязь великолепно видна на стекле при темнопольном микроскопировании (ТПМ).

Прокол пальца производится с использованием одноразовых скарификаторов, одноразовых спиртовых и стерильных салфеток с учетом правил санитарно-эпидемиологического режима при работе с кровью.

Капельку крови помещают на середину предметного стекла. Обращаем ваше внимание на то, что первые 1-2 капли нужно снять (их можно расположить на стекле сбоку, поскольку они для исследования не используются). Далее необходимо аккуратно накрыть основную каплю крови покровным стеклом таким образом, чтобы кровь равномерно распределилась под стеклом монослоем. Это очень важный момент для качественного приготовления препарата и получения максимально объективных результатов исследования.

Данный образец помещают на предметный столик микроскопа и просматривают сначала на малом (объективы 4, 10), затем на большом увеличении (объективы 40, 60, 100).

Артефакты

В результате использования некачественно обработанных стёкол, нарушения правил взятия крови и приготовления препарата можно неправильно интерпретировать результаты исследования и сделать ошибочные заключения. Это тем более недопустимо, поскольку анализ проводится в присутствии пациента.

Врач, производящий диагностику, должен учитывать, что предметное стекло, взятое из упаковки, загрязнено (см. фото, Атлас нативной крови). На предметных стёклах, взятых из упаковки, можно наблюдать частички пыли, ворсинки, сколы, нити, слущенный эпителий, жир и т.д.

Предметные стекла для исследования необходимо предварительно эффективно обрабатывать. Для этого они первоначально промываются моющими средствами и тщательно ополаскиваются в проточной воде, после чего помещаются в смесь Никифорова (смесь этилового спирта и эфира). Смесь должна храниться в стеклянной емкости с хорошо притёртой крышкой. Вместо смеси Никифорова можно использовать специальные готовые растворы для обработки предметных стёкол.

Далее стекла натирают нетканными салфетками и перед исследованием тестируют под микроскопом (без иммерсионного масла!).

Аналогичным образом обрабатываются покровные стекла.

Таким образом, подготовка стёкол перед исследованием имеет колоссальное значение для максимально объективной и информативной диагностики.

Клетки крови

В периферической капиллярной крови в норме можно наблюдать три различных группы клеток: эритроциты, лейкоциты и тромбоциты.

Эритроциты

Эритроциты – самая многочисленная популяция клеток крови. Количество эритроцитов в крови в норме поддерживается на постоянном уровне и составляет 3,5–5,0х10 12 в одном литре.

Продолжительность жизни эритроцита человека в среднем 120 суток.

Наибольшее число эритроцитов имеет диаметр — 7,2–7,5 мкм, площадь поверхности — 140 мкм 2 , объем – 90 мкм 3 . Такую большую поверхность клетка имеет благодаря своей дискоидной двояковогнутой форме, которая совместно с высокой пластичностью и деформабельностью мембраны позволяет эритроциту проходить через капилляры шириной 2–3 мкм, проникать в стенки синусоидов, возвращаясь к исходным параметрам.

Для описания эритроцитов в клинической лабораторной практике принята специальная терминология. Обозначим сейчас основные наиболее часто встречающиеся термины.

Анизоциты – эритроциты разного размера.

Анизоцитоз – состояние, при котором явно выражена вариация размеров эритроцитов.

Анизохромия – различная окраска эритроцитов.

Гиперхромия – интенсивная окраска эритроцитов, связанная с повышенным насыщением гемоглобином (микропрепарат: отсутствие или уменьшение центрального просветления у эритроцита).

Гипохромия – снижение плотности окраски эритроцитов (микропрепарат: увеличение размера центрального просветления и уменьшение интенсивности окраски эритроцита).

Дакриоциты (каплевидные эритроциты) – эритроциты в виде капли.

Микроциты – эритроциты диаметром менее 6,5 мкм.

Микроцитоз – состояние, при котором преобладают микроциты.

Макроциты – эритроциты диаметром более 8–9 мкм.

Макроцитоз – состояние, при котором преобладают макроциты.

Мегалоциты – эритроциты диаметром более 10–12 мкм.

Монетные столбики – агрегаты эритроцитов.

Нормоцит – двояковогнутый эритроцит нормального размера (7,0–7,8 мкм) с центральным просветлением.

Нормобласт – ядросодержащий эритроцит, клетка – предшественник ретикулоцита. В норме в периферической крови не встречается.

Акантоциты – эритроциты с многочисленными шипиками различной величины.

Мишеневидные эритроциты – клетки с центральным расположением гемоглобина в виде мишени.

Овалоциты – эритроциты овальной формы.

Ретикулоциты – молодые эритроциты без центрального просветления (диаметр 7,7–8,5 мкм), образуются после потери нормобластами ядер.

Сфероциты – эритроциты сферической формы без центрального просветления.

Стоматоциты – эритроциты, центральное просветление которых имеет вид полоски или рта. При стоматоцитарной трансформации также могут образоваться сферостоматоциты, но в отличие от сфероэхиноцитов они не имеют шипов.

Шизоциты – фрагменты разрушенных эритроцитов. При прохождении через узкие сосуды и бифуркации под давлением часть эритроцитов механически повреждается и теряет форму двояковогнутого диска. Фрагменты этих эритроцитов подвергаются гемолизу или утилизируются нейтрофилами.

Шлемовидные эритроциты – фрагменты разрушенных эритроцитов в форме шлема.

Эхиноцит – эритроцит с шипами одинакового размера, расположенными равномерно по поверхности клетки. Выделяют эхиноциты трех стадий трансформации.

Наиболее часто встречающиеся ошибки в описании и интерпретации

1. Исследование капли в повреждённой части. Чтобы избежать ошибок, нужно анализировать образец в центральной части, так как при растекании по сухому стеклу максимально повреждаются клетки наружного слоя. По периметру препарата практически все эритроциты превращаются в эхиноциты, либо образуют густые плотные скопления деформированных клеток.
2. Изменение формы клеток при движении. При диагностике необходимо учесть один важный момент: когда мы накрываем каплю покровным стеклом, возникает спонтанное движение крови, что может неправильно интерпретироваться как движение эритроцитов. Самостоятельно в крови двигаться могут только лейкоциты. Эритроциты и тромбоциты передвигаются исключительно с током крови. Эти клетки не имеют способности к самостоятельному передвижению.Учитывая наличие большого количества рецепторов и антигенных детерминант на поверхности эритроцита, представляется разумным понимать возможность сцепления клетки с поверхностью стекла и изменения ее формы.
3. Выросты на клетках. В ряде научных работ показана способность клеток образовывать отростки на мембране – цитоплазматические выросты. Функция данных структур у эритроцита пока не очень понятна, но доказано, что эти образования не имеют ничего общего со жгутиками простейших.
4. Монослой. Важным моментом в приготовлении препарата является помещение капли крови под покровное стекло. Последнее должно равномерно накрыть каплю и распределить клетки монослоем. Если покровное стекло не прилегает равномерно к капле, клетки крови не распределяются в монослой, что делает невозможным диагностику.
5. Раздавливание капли. Если покровное стекло сильно прижать, клетки раздавливаются, эритроциты теряют форму двояковогнутого диска, сплющиваются, приобретают вид «теней».
6. Попадание в кровь посторонних веществ. Эритроциты будут выглядеть поврежденными, если в кровь, например, попал спирт при обработке пальца (кожу пальца не высушили).

Лейкоциты

В периферической крови встречаются три вида клеток, объединённых общим термином. Дифференцировка лейкоцитов происходит в костном мозге. Процесс выхода лейкоцитов из костного мозга высокоселективен. В норме в кровоток поступают только зрелые клетки. Это гранулоциты – клетки, содержащие гранулы, и агранулоциты – моноциты и лимфоциты. Каждый вид клеток специализирован на выполнение присущих только им задач.

Гранулоциты

По структуре гранул выделяют три группы клеток:

Нейтрофилы составляют 60–70% общего числа лейкоцитов. Нейтрофилы рассматриваются как первая линия защиты организма. Основная функция этих клеток – участие в борьбе с микроорганизмами.

В зависимости от степени зрелости и строения ядра выделяют палочкоядерные и сегментоядерные нейтрофилы.

Палочкоядерные нейтрофилы имеют диаметр 10–18 мкм. Во время движения могут вытягиваться до весьма значительных размеров. Ядро клеток выглядит, как длинная изогнутая палочка без перемычек.

Сегментоядерные нейтрофилы имеют диаметр 10–16 мкм. Их ядро состоит из 2–5 сегментов и расположено центрально. Иногда из-за перегиба ядра перемычка между сегментами бывает не видна. Такую клетку принято относить к сегментоядерной.

Неактивные нейтрофилы имеют округлую форму, малоподвижны. Если размер нейтрофила равен или меньше размера эритроцита, можно говорить о снижении иммунитета.

Эозинофилы составляют 0,5–5% всех лейкоцитов в крови. По морфологии ядра выделяют палочкоядерные и сегментоядерные эозинофилы (аналогично нейтрофилам). Характерная особенность данных клеток – специфическая зернистость цитоплазмы. Гранулы эозинофилов ярче и крупнее, чем у нейтрофилов. Гранулы эозинофилов содержат главный щелочной (противопаразитарный) белок и значительное количество ферментов. Обладая слабой фагоцитарной активностью, эозинофилы вызывают внеклеточный цитолиз и участвуют в противогельминтном иммунитете. Объектом фагоцитоза могут быть бактерии, грибы, продукты распада тканей, иммунные комплексы. Важной функцией эозинофилов является и участие их в аллергических реакциях.

Базофилы составляют всего 0,5% от общего числа лейкоцитов. Это достаточно редко встречающаяся клетка. Базофилы подвижны, способны к фагоцитозу. В гранулах клеток содержатся гистамин, лейкотриены, тромбоксаны, ферменты и другие биологически активные вещества, поддерживающие реакции воспаления. Отличить базофил от эозинофила в нативной крови можно по меньшим размерам и более конденсированному ядру. Гранулы базофила крупнее, чем у нейтрофила, но мельче и нежнее, чем у эозинофила.

Как уже отмечалось, основная функция гранулоцитов – фагоцитоз, поэтому все они обладают способностью к передвижению, что и наблюдается в нативном препарате.

В норме в поле зрения (могут быть не в каждом) встречаются единичные гранулоциты. Они в 2–3 раза крупнее эритроцитов, подвижны. При угнетении иммунитета клетки становятся мельче, практически соотносимыми с размерами эритроцитов и малоподвижными.

В процессе развития воспалительной реакции происходит мобилизация костномозговых и циркулирующих лейкоцитов, развивается лейкоцитоз, что можно наблюдать в капле нативной крови.

Морфологические аномалии нейтрофилов:

• гиперсегментация ядер – наличие в ядре более 5 сегментов;
• кариорексис – распад ядра на мелкие части;
• кариолиз – частичное растворение ядра (размытые контуры);
• вакуолизация цитоплазмы и ядра;
• цитолиз клетки – ядро теряет свою структуру, цитоплазма размыта;
• клазматоз – фрагментация ядра или цитоплазмы;
• токсическая зернистость нейтрофилов;
• асегментация ядер гранулоцитов (пельгеровская аномалия).

Данные морфологические аномалии необходимо дифференцировать с артефактами, полученными при приготовлении препарата.

Агранулоциты

Моноциты

В периферической крови моноциты составляют от 1 до 10% всех лейкоцитов. Моноцит – это крупная клетка диаметром 12–18 мкм. Ядро различной формы: от бобовидной до сегментированной. Цитоплазма содержит многочисленные пылевидные гранулы, иногда можно наблюдать вакуоли и фагоцитированные частицы.

Моноциты обладают хорошей адгезивной способностью, легко прилипают к стеклу и пластику, поэтому на препарате они выглядят распластанными, фагоцитирующими клетками.

Лимфоциты

В крови лимфоциты составляют 20–35% всех лейкоцитов.

Популяция лимфоцитов чрезвычайно гетерогенна. Она включает три типа зрелых Т-лимфоцитов и три типа зрелых В-лимфоцитов, имеющих различные функциональные характеристики. Помимо этого, обнаружена популяция клеток, не несущая маркеров ни Т-, ни В-клеток. Это так называемые нулевые лимфоциты или естественные киллеры (NK). Нормальные размеры лимфоцитов варьируют от 4,5–6 мкм до 10–12 мкм.

Общими анатомо-морфологическими признаками для всех клеток лимфоидного ряда являются:

— ядро крупное, округлое или овальное;

— ядро расположено в центре или эксцентрично;

— зернистость всегда носит гранулярный характер.

По размеру цитоплазмы различают широкоплазменные, среднеплазменные и узкоплазменные (большие, средние и малые) лимфоциты.

Тромбоциты

Тромбоциты образуются при отшнуровке фрагментов цитоплазмы от гигантской клетки мегакариоцита и выполняют роль ключевого фактора гемостаза. Тромбоцит содержит набор органелл, которые обеспечивают жизненный цикл клетки.

Зрелые тромбоциты – это безъядерные клетки, имеющие круглую, овальную или звёздчатую форму.

В целом популяция тромбоцитов неоднородна. Микроформы тромбоцитов имеют диаметр менее 1,5 мкм, макроформы могут достигать 5 мкм и мегалоформы — 6–10 мкм. Активные (возбуждённые) тромбоциты имеют звёздчатую форму с нитевидными отростками-псевдоподиями.

Функции тромбоцитов определяются их способностью к адгезии, агрегации, транспорту различных веществ в крови, дегрануляции, ретракции кровяного сгустка и т.д. При изучении тромбоцитов, показано, что во время их физиологической активности в течение 1–2 минут большинство из них теряют дискоидную форму и распластываются на поверхности стекла, образуя псевдоподии. При МНК тромбоциты часто видны в виде звёздчатых распластанных клеток.

Склонность к повышенной агрегации видна в виде скоплений клеток различного размера. Стимуляторами агрегации тромбоцитов являются: АДФ, адреналин, норадреналин, тромбин, серотонин, фибриноген и др.

Неклеточные структуры крови

Плазма и ее компоненты

Соотношение объёмов клеточных элементов и плазмы составляет примерно 1:1. В физиологической системе крови плазма (жидкая фаза, суспензионная среда) выступает как консервативный, наиболее стабильный компонент, препятствующий патологическим изменениям рН. Диапазон изменений рН крови составляет всего 0,1 единицы, а значения 7,35–7,45 поддерживаются мощнейшей буферной системой крови. Поэтому кровь – это всегда слабощелочная среда и кислой не бывает (только при тяжёлой патологии, но это состояния, требующие реанимационных мероприятий).

Функции плазмы настолько разнообразны и настолько жизненно важны, что можно сказать: «Плазма есть сама жизнь».

При исследовании нативной крови нормальная плазма имеет вид прозрачной жидкости слегка голубоватого цвета.

Поскольку все вещества в плазме находятся в растворённом состоянии, они имеют чрезвычайно мелкие размеры. Поэтому увидеть их посредством светового микроскопа не представляется возможным.

При микроскопии хорошо визуализируются крупные полимеризованные нити фибрина и хиломикроны.

Фибриноген и фибрин

Фибриноген – белок острой фазы воспаления и один из основных факторов свёртывания крови. Синтез фибриногена происходит в печени.

При микроскопическом исследовании нативной крови можно видеть продукт полимеризации фибриногена – фибрин.

Механизм образования фибрина in vivo состоит из трех этапов:

1. Под влиянием тромбина от фибриногена отщепляются фибринопептиды А и В, в результате чего образуются мономеры фибрина. Эта реакция происходит при обязательном участии протеолитических ферментов.

2. При участии кальция происходит агрегация и полимеризация мономеров. Образуется растворимый фибрин.

3. От растворимого фибрина с помощью ферментов отщепляется сиаловая кислота, что ведет к образованию нерастворимого фибрина и формированию сгустка.

In vitro процесс протекает несколько иначе. Через некоторое время после взятия крови запускается процесс ее свёртывания и на препарате появляются нити фибрина в виде нежных темных полос на фоне прозрачной плазмы. Иногда нити фибрина настолько тонки, что практически неразличимы в микроскоп, что, конечно, не означает их полного отсутствия.

Через 10–15 минут при участии тромбоцитов начинается ретракция кровяного сгустка и процесс фибринолиза.

При заболеваниях фибрин выпадает очень быстро и нити его значительно грубее. Это зависит от исходного содержания в плазме фибриногена. А его уровень, как известно, повышается при целом ряде заболеваний.

Нарушения в питании, наследственные факторы, определённые патологические состояния и заболевания (сахарный диабет, гиперхолестеринемия), курение, алкоголь, неблагоприятные социальные условия и стрессы, токсические влияния и целый ряд фармакологических средств, а также возраст влияют на концентрацию фибриногена в крови. По данным зарубежных исследований, вышеназванные неблагоприятные воздействия приводят к повышению уровня фибриногена, в то время как при возвращении к здоровому образу жизни его количество достоверно снижается.

Антиоксиданты (природные витамины А, С, Е и готовые формы атиоксидантов, таких как микрогидрин, фикотен, фитоси), свежие фрукты и овощи, а также достаточная физическая нагрузка также выраженно способствуют снижению уровня фибриногена и фибрина (см. фото, Атлас нативной крови).

Учитывая всё изложенное, целесообразно регулярно и в течение длительного времени проводить повторные исследования нативной крови и оценивать динамику свёртывающей системы по указанным визуальным признакам. Особенно это актуально для пациентов, относящихся к группам риска развития сердечно-сосудистых заболеваний.

Хиломикроны

Хиломикроны (ХМ) – это первый транспортер поступающих с пищей липидов (прежде всего триглицеридов (ТГ)) на их пути через лимфу в кровь. Хиломикроны образуются преимущественно в энтероцитах кишечника. Их функция: перенос экзогенного жира из кишечника в ткани (преимущественно в жировую ткань). Размеры хиломикрона достаточно велики (сравнимы с размерами эритроцитов), поэтому он не может пройти через поры, имеющиеся в стенках кровеносных капилляров, путем экзоцитоза. Путем экзоцитоза хиломикроны поступают в лимфу и с ее током попадают в большой круг кровообращения. После употребления в пищу жира в крови наблюдается повышенное содержание хиломикронов.

Иногда в крови встречаются такие аналиты (компоненты плазмы), происхождение и структура которых пока не совсем ясна. Они являются, в частности, одним из множества сюрпризов, которые уже преподнёс исследователям метод МНК. Поэтому очень важно продолжать научный поиск в данной области.

Микроорганизмы

(апатогенные и патогенные)

Пожалуй, одним из самых интересных результатов исследований с помощью метода микроскопии нативной крови стало обнаружение в ней различных форм жизни. Большинство врачей до сих пор твёрдо убеждены, что кровь – стерильна! Это — миф, разрушить который оказалось очень сложной задачей. В книге «Атлас нативной крови» представлены достоверные доказательства того, что кровь – среда обитания не только клеток, но и огромного количества комменсалов, различных микроорганизмов, в т.ч. и паразитарных форм.

Справедливости ради необходимо отметить, что в естественных науках (биологии, микробиологии и др.) никогда и не постулировалось положение о стерильности крови, исходя из многочисленных наблюдений и того факта, что кровь – это основная транспортная система организма. Чтобы убедиться в этом, достаточно просмотреть научные труды не только периода 20 столетия, но даже датируемые 19 веком. Современные исследования также полностью подтверждают факт наличия форм жизни в крови.

Разрешающая способность современной аппаратуры позволяет нам при проведении МНК визуализировать достаточно большое количество живых (движущихся) микроорганизмов в крови.

Возникают следующие вопросы: может быть нарушены правила асептики и антисептики при проведении анализа, или, возможно, вся эта «живность» попадает из воздуха?

В большинстве случаев это не так! Данные отечественной и зарубежной науки, а также собственные исследования показали, что визуализируемые в крови микроорганизмы, попали на предметное стекло из кровеносного русла. Кровь же является для них средой обитания либо транслокации. И это вполне логично, мы живем в природе, а человек – это открытая система.

Сегодня уже всем известен факт присутствия в организме человека достаточно большого количества самых разнообразных микроорганизмов, которые образуют его биоценоз. При этом следует помнить, что даже в норме, кроме облигатной микрофлоры, у человека в его внутренней среде присутствуют также условно-патогенные и транзиторные микроорганизмы. Основная их среда обитания у человека – это ЖКТ, вагина, уретра. Но при определённых условиях микрофлора может заселять и несвойственные ей ниши, вызывая различные заболевания, такие как пневмонии, бронхиты, тонзиллиты, циститы и др. Расселение ее по организму происходит, в основном, гематогенным путем. По данным микробиологов, 70 % микроорганизмов – гемоформы, то есть пути их транслокации по организму проходят через кровь.

Считается, что приблизительно 40 % всей патологии человека прямо или косвенно связано с пагубной деятельностью патогенной и транзиторной микрофлоры. Заболевание может вызывать также и факультативная флора, например при увеличении количества микробных тел либо снижении общего и/или местного иммунитета.

Уникальная способность бактерий приспосабливаться и выживать в экстремальных условиях, длительно персистировать в организме, не вызывая клинических проявлений, и склонность к полиморфизму позволяет им благополучно выживать даже после антибиотикотерапии.

Бактерии могут не находиться в крови постоянно, а лишь транзиторно проходить через нее. В этом случае их наличие в крови не всегда является признаком патологии. О том, что микроорганизмы, визуализируемые в препарате нативной крови, могут быть причиной заболевания, можно думать в случае увеличения их количества, появлении ассоциаций (разнообразия форм), а также при наличии соответствующей клинической картины. Кроме того, существует целый ряд паразитарных форм, обнаружение которых в крови всегда свидетельствует о патологическом процессе (возможно, латентно протекающем), например, яйца и личинки гельминтов, грибы, определенные виды простейших и др.

Часть этих форм обитает в крови, другая попадает туда транзиторно, перемещаясь по организму, реализуя предназначенный природой жизненный цикл.

Бактерии

В настоящее время наиболее распространённой классификацией, используемой большинством микробиологов и бактериологов, является классификация Берджи. Согласно этой классификации, прокариоты (бактерии) делятся на два домена «Bacteria» и «Archaea».

При нативной микроскопии мы не можем идентифицировать вид бактерий, а потому следует говорить лишь об их форме и размере.

Формы бактерий наблюдаются самые разнообразные: сферические или кокки, диплококки, палочковидные, извитые, спиралевидные и т.д.; размер их может варьировать от 0,15 мкм (микоплазмы) до 8 мкм (палочковидные) и до 50 мкм у актиномицетов. Стафилококк – грамположительный круглый кокк размером 1 мкм, стрептококк – кокк неправильной формы, неподвижен, размер от 0,5 до 2 мкм.

Можно абсолютно точно утверждать, что бактерии попадают в диапазон разрешающей способности светового микроскопа, а потому их можно наблюдать при исследовании нативной крови.

Бактерии не находятся в крови постоянно, они лишь транзиторно проходят через кровь, и их наличие в препарате не всегда является признаком патологии.

К домену бактерий современными классификаторами отнесены и не совсем обычные микроорганизмы. Речь идет о микоплазме и уреоплазме. У этих бактерий отсутствует клеточная стенка. Другой их особенностью является то, что они длительно могут персистировать в организме, являясь его условно-патогенной флорой, и не провоцирвать симптоматики. Но при определённых условиях, эти микроорганизмы способны вызывать как острые, так и хронические вялотекущие со стёртой клиникой заболевания, например при снижении иммунитета либо при резком увеличении микробных тел. В этих случаях нативная микроскопия позволяет обнаруживать полиморфные колонии бактерий (микроорганизм слишком мелкий) и большое их количество, особенно после проведения функциональной пробы с водной нагрузкой. В то время как лабораторными методами диагностики эти возбудители не всегда выявляются, так как являются тканевыми (клеточными) паразитами.

Вирусы

Мельчайшие микробы, не имеющие клеточного строения, содержат только ДНК или РНК. Морфологию вирусов изучают с помощью электронного микроскопа, так как размер вирусов чрезвычайно мал (от 18 до 400 нм). Световые микроскопы предназначены для изучения объектов не менее 0,2 мкм, поэтому крупные скопления вирусов, так называемые вирусные тельца, мы можем видеть, но как их идентифицировать от гранул и вакуолей лейкоцитов, нам пока не понятно, учитывая, что вирус – это облигатный внутриклеточный паразит. В то же время, по данным ряда исследований, вирусные тельца хорошо визуализируются в эритроците.

Неклеточные формы включают еще более мелкие частицы, такие как прионы (белковые инфекционные частицы, вызывающие прионные болезни со смертельным исходом) и вироиды (небольшие молекулы кольцевой суперспирализованной РНК, вызывают болезни растений). Данные объекты в световой микроскоп не видны.

Простейшие

Простейшие – эукариотические одноклеточные микроорганизмы, содержат ядро с ядрышком и цитоплазму с органеллами. Размеры простейших от 2 до100 мкм.

Простейшие имеют: органы движения (жгутики, реснички, псевдоподии), питания (пищеварительные вакуоли) и выделения (сократительные вакуоли). Подцарство простейших включает 7 типов, из которых 4 значимы для человека и чаще всего вызывают заболевания. Основные и наиболее распространённые возбудители болезней среди простейших: трихомонада, лейшмания, трипаносома, дизентерийная амеба, токсоплазма, лямблии, малярийный плазмодий и балантидий.

Нахождение в крови лейшманий, трипаносом и малярийного плазмодия вопросов не вызывает, поскольку при попадании в организм они либо паразитируют в клетках крови, либо используют кровь как транспортную систему. Наличие данных паразитов всегда сопровождается соответствующей клиникой.

Токсоплазма тоже проходит стадию развития в крови, но часто встречается скрытое носительство при отсутствии клинических проявлений.

Спорным до сих пор является присутствие в крови лямблий и трихомонад, поскольку непонятен механизм их выживания в несвойственной для них среде. В литературе также нет достоверных данных об обнаружении и идентификации этих простейших в периферической крови.

Грибы

Грибы – одноклеточные или многоклеточные гетеротрофные нефотосинтезирующие эукариотические микроорганизмы. Царство грибов насчитывает более 100 000 видов. Среди них встречаются сапрофиты, паразиты и факультативные паразиты растений, животных и человека. Наибольшее значение для медицины имеют несовершенные грибы (около 30 тысяч видов).

К несовершенным грибам, в частности, относятся формы, вызывающие грибковые заболевания ног и стригущий лишай.

В клинической практике известны грибы, вызывающие всевозможные микозы (кератомикозы, дерматомикозы и др.), а также возбудители оппортунистических микозов: Candida, Mucor, Aspergillus, Penicillium, Fusarium.

Форма, размеры и мицелий специфичны для каждого вида.

К самым известным «обитателям» человека безусловно относится Candida, которая является частью условно-патогенной и транзиторной микрофлоры млекопитающих и человека. На фоне ослабленного иммунитета, при попадании в ткани данная эндогенная флора вызывает кандидозы различной локализации: пневмонии, бронхиты, язвенные процессы в ЖКТ, циститы и др.

Поскольку грибы являются клетками размером от 0,5 до 10–15 мкм, а гифы и мицелий измеряются десятками микрометров, они прекрасно видны в световой микроскоп. В крови Candida визуализируется в виде белых округлых или овальных образований. Гораздо сложнее их идентифицировать, учитывая колоссальное разнообразие форм. Только род Candida насчитывает около 200 видов несовершенных дрожжеподобных и совершенных дрожжевых грибов.

Достаточно часто в крови можно встретить микроорганизмы дрожжевых и диморфных грибов в стадии почкования, характерным признаком которых является плотная, четко очерченная поверхность.

Чтобы различать клетки грибов от клеток крови, нужно учитывать, что грибы кроме мембраны имеют многослойную ригидную клеточную стенку.

Этот факт существенно помогает отличить, например, деформированный эритроцит от клетки гриба.

Гельминты

Гельминты – многоклеточные паразитические черви. Термин «гельминтозы» был введен еще Гиппократом. Сегодня известно более 100 тысяч видов паразитических червей. У человека описано их более 250 видов. Проблема гельминтозов стала чрезвычайно актуальна в настоящее время. В результате развития туризма и увеличения миграции населения, всё чаще в Европе, РФ и странах СНГ стали встречаться экзотические виды паразитов и редких гельминтозов, диагностика которых абсолютно не разработана.

По форме тела и циклам развития выделяют три различных группы гельминтов: нематоды, трематоды и цестоды.

Не углубляясь в классификацию, описание морфологии и жизненного цикла гельминтов, приведём лишь их размеры и возможность обнаружения в капиллярной периферической крови при микроскопии.

По современным научным данным (научно-обоснованным и официально подтверждённым), в периферической крови могут быть обнаружены следующие виды гельминтов в личиночной их стадии: анкилостома, некатор, аскарида, токсокара, бругия, вухерерия, лоа лоа, стронгилоид, трихинелла, шистосома.

Размеры взрослых особей, их личинок и яиц весьма значительны. Ниже представлены некоторые из них, приведённые в официальных документах (МУК 2.1.7.730-99 (По состоянию на 18 октября 2006 года) «Гигиеническая оценка качества почвы населённых пунктов», МУК 13-4-2/1751 «Возбудители гельминтозоонозов в пресноводных рыбах» от 04.10.99):

• Шистосома (Schistosoma mansoni) – 10–16 х 0,17–1,2 мм (самые крупные яйца среди гельминтов 140–150 мкм).
• Описторхи (Opisthorchis felineus) – 5,4–10,2 х 0,8–1,9 мм (яйца 30–40 мкм).
• Фасциола гепатика (Fasciola hepatica) – 20–30 х 8–13 мм (самые крупные яйца среди гельминтов 130–150 мкм).
• Вухерерия (Wuchereria bancrofti) – 80–100 х 0,24–0,3 мм, микрофилярия – 127–320 х 7–10 мкм.
• Анкилостома (Ancylostoma duodenale) – 10–13 х 0,4–0,6 мм (яйца 60 х 40 мкм, рабдитовидная личинка 250 х 16 мкм, филяриевидная – 660 х 17мкм).
• Стронгилоид (Strongyloides stercoralis) – 2,2 х 0,03–0,07 мм.
• Размеры бычьего и свиного цепня измеряются метрами!
• Личинки аскариды во время миграции по кровяному руслу дважды линяют и увеличиваются в размере с 0,19–0,25 до 1,5–2,2 мм в длину. Размер оплодотворённых яиц составляет 50–70 х 40–50 мкм, а неоплодотворённых — 50–100 х 40–60 мкм.
• Метацеркарии трематод Opisthorchis felineus 0,28–0,38 х 0,18–0,28 мм, Еchinochasmus perfoliatus 0,080–0,11 х 0,079–0,098 мм.

Обращаем ваше внимание на то, что указаны величины личинок, паразитирующих в рыбе. Продолжая свой жизненный цикл в организме человека, они еще больше увеличиваются в размерах.

Размеры гельминтов и их личинки значительно превышают величину не только клеток крови, но и капиллярного русла. Поэтому возможность встретить их при микроскопии периферической капиллярной крови – скорее исключение, чем правило.

Другие биологические формы

При микроскопии нативной крови достаточно часто обнаруживаются объекты, идентифицировать которые пока не представляется возможным. Не исключено (особенно при наличии определенной клинической картины), что визуализируемые в крови биологические контаминанты относятся к паразитарным формам жизни. Но однозначно это утверждать не представляется возможным. Сложность интерпретации объясняется отсутствием исследований по идентификации данных объектов. Тем не менее однозначно понятно, исходя из размеров (всего одна клетка), большинство из них – это не гельминты, поскольку все гельминты многоклеточные! Среди известных одноклеточных микроорганизмов большинство подобных форм не наблюдаются. От эритроцитов они отличаются подвижностью и иной структурой клеточного строения. Для прояснения этих вопросов необходимы глубокие серьезные исследования. Но на сегодняшний день именно эти объекты активно обсуждаются в среде практикующих врачей, причем нередко беспредметно создают почву для необоснованных домыслов.

Приложение № 1

МИКРОСКОПИЯ НАТИВНОЙ КРОВИ

ЭТАПЫ ПРОВЕДЕНИЯ ИССЛЕДОВАНИЯ

I. Методика приготовления препарата

1. Подготовка предметных и покровных стекол (стекла готовятся до исследования).

1.1. Замачивание стекол в специальном растворе (этиловый спирт 96° + эфир для наркоза =1:1) с целью обезжиривания (не менее 1 часа).

1.2. Тщательная натирка стекол нетканой салфеткой.

1.3. Предварительный контрольный просмотр стекол перед исследованием при 400-кратном увеличении на предмет наличия возможных артефактов.

2.1. Кровь для исследования берут капиллярную из безымянного или среднего пальца.

2.2. Палец тщательно протирается спиртовой салфеткой. Затем высушивается стерильной сухой марлевой салфеткой.

2.3. Прокол пальца производят с использованием одноразового скарификатора.

2.4. Каплю крови помещают на середину покровного стекла и аккуратно (без усилий – во избежание раздавливания клеток крови и появления артефактов) накрывают покровным стеклом, также тщательно обработанным. Кровь под стеклом должна распределиться равномерно монослоем, что очень важно для объективности результатов. Примечание: первые 1–2 капли крови помещаются на предметное стекло в боковой его части.

2.5. Полученный препарат крови помещают на предметный столик микроскопа и просматривают сначала на малом (объективы: 4, 10), а затем на большом (объективы: 40, 100) увеличении.

II. Микроскопия крови

Увеличение и разрешающая способность светового микроскопа позволяют визуализировать в крови в основном только нижеперечисленные объекты:

— нормальные дискоциты (6–8 мкм);

— анизоциты (микро- и макроформы 4–15 мкм);

— пойкилоциты (клетки с измененной формой);

— анизохромные (с различной окраской);

— юные и незрелые формы (ретикулоциты, нормобласты);

— эхиноциты, стоматоциты, шлемовидные эритроциты;

— гемолизированные эритроциты и другие формы деградации и старения эритроцитов;

— включения в эритроцитах (остатки ядра);

— гранулоциты (нейтрофилы, эозинофилы, базофилы);

— агранулоциты (моноциты, Т- и В-лимфоциты);

— юные и незрелые формы (в том числе бластные).

Тромбоциты (молодые и старые клетки) различного размера (до 5 -10 мкм) и их скопления.

2. Фибрин (в виде нитей и тяжей).

3. Хиломикроны (шарообразные опалесцирующие структуры светло-зеленого цвета размером до 5–8 мкм).

4. Бактерии разного размера и формы, подвижные и неподвижные (примечание: без видовой идентификации!).

5. Одноклеточные простейшие паразиты (малярийный плазмодий, пироплазма, токсоплазма, лейшмания, трепаносома, возможно – трихомонада), несовершенные грибы (в т. ч. диморфные), Candida, колонии микоплазмы или уреаплазмы.

6. Возможно обнаружение яиц глистов и миграционных личиночных стадий некоторых гельминтов (микрофилярий, аскарид, анкилостом, некатора, трихинелл и др.). Диагностика гельминтозов проводится с учетом их макроразмеров (значительно крупнее эритроцита, примерно от 100 и больше мкм). Редчайшей диагностической находкой может быть обнаружение взрослого гельминта (очевидно, что это многоклеточное существо также будет макроразмеров).

Примечания:

1. Классифицирование гельминтов и других биологических объектов, визуализируемых в нативной крови, с целью определения их видовой спецификации проводиться не должно и в заключении врача не может быть отражено вследствие отсутствия соответствующей научно обоснованной доказательной базы по идентификации паразитарных форм. Биологические объекты в крови (за исключением бактериальной флоры) в заключении целесообразно называть патогенными микроорганизмами или паразитарными формами.
2. Достаточно часто в образце нативной крови визуализируется значительное количество артефактов вследствие некачественной обработки стекол, ошибок при заборе крови и неправильного приготовления препаратов.

III. Функциональная проба

При наличии показаний (выраженной агрегации эритроцитов, снижении физиологической активности лейкоцитов и др.) целесообразно проводить функциональную пробу, которая у взрослого человека включает:

• прием воды (от 200 до 500 мл; рекомендуемый объем воды определяется возрастом, состоянием здоровья человека и результатами микроскопии);
• прием нутрициологических продуктов по выбору и в сочетаниях: корал-майн, гидросел, микрогидрин, ферменты;
• через 20–40 минут – повторный забор крови и микроскопия образца;
• по динамике визуализируемых изменений производится оценка показателей адаптационных резервов организма.

Цель проведения функциональной пробы: оценка адаптационных резервов организма человека и индивидуальный подбор БАД к пище в качестве превентивной диетотерапии для профилактики возникновения заболевания либо предупреждения его прогрессирования.

Источник