Микробиологический способ или метод
Основу микробиологической диагностики инфекционных заболеваний составляют микроскопические, микробиологические, биологические, серологические и аллергологические методы.
Микроскопический метод исследования
Микроскопические методы исследований включают приготовление мазков и препаратов для микроскопирования. В большинстве случаев результаты микроскопических исследований носят ориентировочный характер (например, определяют отношение возбудителей к окраске), так как многие микроорганизмы лишены морфологических и тинкториальных особенностей. Тем не менее микроскопией материала можно определить некоторые морфологические признаки возбудителей (наличие ядер, жгутиков, внутриклеточных включений и т.д.), а также установить факт наличия или отсутствия микроорганизмов в присланных образцах.
Микробиологический метод исследования
Микробиологические методы исследований — «золотой стандарт» микробиологической диагностики, так как результаты микробиологических исследований позволяют точно установить факт наличия возбудителя в исследуемом материале. Идентификацию чистых культур (до вида микроорганизма) проводят с учётом морфологических, тинкториальных, культуральных, биохимических, токситенных и антигенных свойств микроорганизма. Большинство исследований включает определение чувствительности к антимикробным препаратам у выделенного возбудителя. Для эпидемиологической оценки роли микроорганизма проводят внутривидовую идентификацию определением фаговаров, биоваров, резистентваров и т.д.
Биологический метод исследования
Биологические методы исследований направлены на определение наличия токсинов возбудителя в исследуемом материале и на обнаружение возбудителя (особенно при незначительном исходном содержании в исследуемом образце). Методы включают заражение лабораторных животных исследуемым материалом с последующим выделением чистой культуры патогена либо установлением факта присутствия микробного токсина и его природы. Моделирование экспериментальных инфекций у чувствительных животных — важный инструмент изучения патогенеза заболевания и характера взаимодействий внутри системы микроорганизм-макроорганизм. Для проведения биологических проб используют только здоровых животных определённых массы тела и возраста. Инфекционный материал вводят внутрь, в дыхательные пути, внутрибрюшинно, внутривенно, внутримышечно, внутрикожно и подкожно, в переднюю камеру глаза, через трепанационное отверстие черепа, субокципитально (в большую цистерну головного мозга). У животных прижизненно забирают кровь, экссудат из брюшины, после гибели — кровь, кусочки различных органов, СМЖ, экссудат из различных полостей.
Источник
Методы микробиологических исследований
Все микробиологические исследования могут быть сведены к 5 основным методам:
– микроскопический метод состоит в изучении исследуемого материала с помощью различных микроскопов;
– бактериологический (микологический, вирусологический) метод заключается в искусственном культивировании микроорганизмов и выделении чистых культур с последующей их идентификацией (определением вида);
– серологический метод основан на определении специфических антител к антигенам в крови и других биологических жидкостях пораженного организма с помощью различных реакций иммунитета;
– биологический (или экспериментальный) метод заключается в заражении животных исследуемым материалом с целью воспроизведения инфекционного заболевания или последующего выделения возбудителя;
– аллергический метод заключается в постановке кожных аллергических проб с соответствующими аллергенами с целью обнаружения повышенной чувствительности макроорганизма к определенным возбудителям инфекционных заболеваний или продуктам их жизнедеятельности.
Особенности иммерсионной микроскопии
При иммерсионной микроскопии окрашенных препаратов необходимо создавать хорошее освещение, для чего надо максимально поднять конденсор, открыть диафрагму конденсора, поставить малый сухой объектив на расстоянии 5–7 см от предметного столика и с помощью плоского зеркала установить равномерное освещение поля зрения. При работе с иммерсионной системой во избежание порчи объектива необходимо соблюдать следующие правила: после нанесения на поверхность препарата небольшой капли иммерсионного масла под контролем глаза сбоку погрузить в нее фронтальную линзу иммерсионного объектива, а затем, глядя в окуляр, при помощи сначала макрометрического, а затем микрометрического винта установить препарат в фокусе микроскопа. Микроскопирование необходимо проводить, не снимая руки с микрометрического винта, что дает возможность, изменяя фокусное расстояние, рассмотреть всю поверхность поля зрения. После работы иммерсионная система и столик микроскопа должны быть очищены от масла.
3.Виды микроскопии
Микроскопия в темном поле. Ее применяют для изучения неокрашенных микробов, их подвижности. Этот метод микроскопии требует специального конденсора с затемненной центральной частью, которая, задерживая центральную часть пучка лучей, пропускает лишь боковые косо направленные лучи. В связи с этим поле зрения остается неосвещенным в то время как объекты, находящиеся в препарате, ярко светятся на темном фоне.
Люминесцентная микроскопия. Люминесценция – свечение объекта, возбуждаемое поглощенной световой энергией (коротковолновая и ультрафиолетовая части спектра). Микробы обладают слабой собственной первичной люминесценцией, и поэтому на практике пользуются наведенной люминесценцией путем обработки объекта растворами люминесцирующих красителей (флюорохромами), которые светятся под влиянием ультрафиолетовых и коротковолновых синих лучей. Отдельные флюорохромы обладают избирательностью, т.е. связываются с отдельными клеточными структурами (ядро, цитоплазма, включения). Для люминесцентной микроскопии необходим источник ультрафиолетового света и набор светофильтров.
Фазово-контрастная микроскопия. Изучение живых неокрашенных микробов затруднено в связи с их малой контрастностью. В видимом свете они прозрачны. Однако при прохождении света через микробную клетку происходит изменение фазы световых лучей, что обусловлено различиями толщины и показателей преломления отдельных структур. Эти изменения могут быть обнаружены при использовании специальных фазово-контрастных устройств, в результате чего микроорганизмы и отдельные части микробной клетки становятся контрастными и видимыми человеческим глазом.
В электронном микроскопе вместо световых лучей используется поток электронов, излучаемых специальным источником (электронная пушка). На пути потока электронов помещены электромагнитные линзы, которые для электронных лучей являются фокусирующими, т.е. действуют подобно линзам для световых лучей. Исследуемый препарат, приготовленный на тончайшей пленке, помещают в безвоздушной среде на пути потока электронов после их прохождения через конденсорную линзу. Затем пучок электронов проходит через объективную и проекционные линзы. Изображение микроскопируемого объекта наблюдают на флюоресцирующем экране. Возникновение изображения на экране обусловлено тем, что различные части исследуемого объекта обладают неодинаковой проницаемостью для электронов.Электронная микроскопия дает возможность изучать объекты величиной 10–10000 нм. Ее широко применяют для исследования тончайших структур бактериальной клетки и функциональных особенностей ее компонентов, для изучения морфологии и биологических свойств вирусов и фагов.
В сканирующем зондовом микроскопеиспользуют комбинации инвертированного оптического и зондового микроскопов. Минимальный шаг сканирования составляет 0,01нм. Сканирующая зондовая микроскопия применяется для определения плотности и размеров бактерий и вирусов, определения параметров состояния мембран (эластичности, проводимости), исследования структуры ДНК, особенностей биомакромолекул и антигенов поверхности клеток.
4.Препарат висячая капля . Значение
Приготовление препарата «висячая капля»
На середину покровного стекла нанести каплю исследуемой жидкой культуры. Каплей вниз опустить покровное стекло на предметное стекло с углублением (лункой), края которого смазаны вазелином. Капля должна свободно свисать и не касаться дна краев углубления. Создается герметически закрытая камера, в которой бактерии можно наблюдать длительное время (4–6 часов). При малом увеличении найти край капли, после чего переместить ее в центр поля зрения и микроскопировать с объективом сильного увеличения и с иммерсионным объективом.
5.Приготовление препарата «раздавленная капля»
На середину предметного стекла нанести каплю жидкой бактериальной культуры. Осторожно накрыть её покровным стеклом, чтобы не было пузырьков воздуха, после чего микроскопировать с малым сухим, а затем с большим сухим и иммерсионным объективами.
6. Прижизненная окраска бактерий
Для такой окраски применяются сильно разбавленные растворы красителей, которые не оказывают токсического действия на бактерии. На предметное стекло нанести каплю 0,001 % раствора метиленового синего, в которую внести взвесь бактерий, после чего приготовить препарат «раздавленная капля» и микроскопировать его.
7. Приготовления фиксированного мазка и простой способ окрашивания . Значение.Для приготовления мазка на чистое обезжиренное предметное стекло наносят каплю физиологического раствора, в которую петлей вносят исследуемый материал с плотной питательной среды и распределяют так, чтобы получить тонкий и равномерный мазок диаметром около 1–1,5 см. При приготовлении мазков из жидких культур исследуемый материал непосредственно наносится на предметное стекло.
Фиксация мазка производится с целью прикрепления микроорганизмов к стеклу и обеззараживания препарата. Кроме того, фиксированные бактерии лучше воспринимают красители. Для фиксации мазков высушенный препарат проводят 3–4 раза через пламя горелки, причём в пламени препарат следует выдерживать не более 2 секунд. Если фиксация проведена правильно, стекло при прикосновении к тыльной поверхности руки тотчас после окончания процесса фиксации слегка обжигает кожу. В некоторых случаях мазки можно фиксировать путем погружения в этиловый спирт на 15–20 минут, в смесь равных объёмов этилового спирта и эфира (смесь Никифорова) на 15–20 минут, в ацетон на 5 минут.
Окрашивание мазков осуществляется растворами анилиновых красителей. В основе окраски лежат сложные химические и физико-химические процессы взаимодействия компонентов микробной клетки с анилиновыми красителями. Красящая способность последних зависит от наличия у них карбоксильных, серосодержащих аминогрупп, от заряда микробной клетки. Для окраски микроорганизмов используют главным образом основные красители – метиленовый синий, кристаллический фиолетовый, генциан фиолетовый, фуксин, гематоксилин, везувин и др. Для выявления различных структурных элементов бактериальной клетки применяют нейтральные и кислые красители (нейтральный красный, кислый фуксин, Конго, пикриновая кислота и др.). Отношение микроорганизмов к красителям определяет их тинкториальные свойства.
8. Принцип техники окраски по Граму
Техника окраски по Граму
а) на фиксированный препарат поместить полоску фильтровальной бумаги и на неё нанести раствор карболового генцианвиолета на 1–2 минуты;
б) краситель слить, снять фильтровальную бумагу и обработать препарат в течение 1–2 минут раствором Люголя до почернения препарата;
в) слить раствор Люголя и на препарат нанести несколько капель этилового спирта на 30–60 сек;
г) промыть водой и докрасить препарат водным фуксином в течение
1–2 минут;
д) слить краску, промыть водой, высушить и микроскопировать препарат с иммерсионной системой.
При данном методе одни бактерии окрашиваются в тёмно-фиолетовый цвет (грамположительные), другие – в красный или розовый (грамотрицательные). Сущность метода состоит в том, что клеточная стенка грамположительных бактерий прочно фиксирует комплекс «генцианвиолет – раствор Люголя», не обесцвечивается этанолом и потому не воспринимает дополнительный краситель (фуксин). У грамотрицательных микробов комплекс легко вымывается из клетки этанолом, и они окрашиваются дополнительным красителем.
9. Выявление капсул по методу Бурри – Гинса
а) на край предметного стекла нанести каплю туши, а рядом каплю исследуемой культуры. Капли быстро перемешать и с помощью шлифованного стекла приготовить тонкий мазок;
б) после высушивания мазок фиксировать над пламенем и окрасить фуксином в течение 1–2 минут;
в) осторожно промыть водой и высушить.
Бактерии окрашиваются в красный цвет, капсула не окрашивается и имеет вид светлой зоны вокруг бактерий на тёмном фоне.
10. Окраска включений волютина по методу Нейссера
Приготовить мазок и окрасить по методу Нейссера для выявления зёрен волютина, микроскопировать:
а) фиксированный мазок окрасить в течение 2–3 минут уксусно-кислой синькой Нейссера;
б) препарат 10–30 секунд обрабатывать раствором Люголя;
в) не промывая водой, мазок докрасить в течение 30–60 секунд везувином.
Зёрна везувина окрашиваются в синий цвет, тела клеток – в жёлтый.
Дата добавления: 2018-02-28 ; просмотров: 1194 ; Мы поможем в написании вашей работы!
Источник
Микробиологический способ или метод
1. Методы исследования микроорганизмов: микроскопические, микробиологические, биологические, серологические и иммуно-химические, молекулярно-биологические.
Методы медицинской микробиологии
· Микроскопические (препараты для прижизненного исследования м/о и фиксированные препараты).
· Микробиологические (выделение м/о в чистой культуре и изучение физиолого-биохимических особенностей).
· Серологические (выявление антигенов м/о и антител в сыворотке крови).
· Биологические (заражение лабораторных животных и изучение инфекционного процесса)
Микроскопические методы исследования м/о
С использованием светового микроскопа
(предел разрешения 0,12мкм)
· Темнопольная микроскопия (до 0,01мкм)
С использованием электронного микроскопа
(предел разрешения до 0,1нм)
Микроскопические методы исследований включают приготовление мазков и препаратов для микроскопирования. В большинстве случаев результаты микроскопических исследований носят ориентировочный характер (например, определяют отношение возбудителей к окраске), так как многие микроорганизмы лишены морфологических и тинкториальных особенностей. Тем не менее микроскопией материала можно определить некоторые морфологические признаки возбудителей (наличие ядер, жгутиков, внутриклеточных включений и т.д.), а также установить факт наличия или отсутствия микроорганизмов в присланных образцах.
Микробиологические методы исследований — «золотой стандарт» микробиологической диагностики, так как результаты микробиологических исследований позволяют точно установить факт наличия возбудителя в исследуемом материале. Идентификацию чистых культур (до вида микроорганизма) проводят с учётом морфологических, тинкториальных, культуральных, биохимических, токсигенных и антигенных свойств микроорганизма. Большинство исследований включает определение чувствительности к антимикробным препаратам у выделенного возбудителя. Для эпидемиологической оценки роли микроорганизма проводят внутривидовую идентификацию определением фаговаров, биоваров, резистентваров и т.д.
Биологические методы исследований направлены на определение наличия токсинов возбудителя в исследуемом материале и на обнаружение возбудителя (особенно при незначительном исходном содержании в исследуемом образце). Методы включают заражение лабораторных животных исследуемым материалом с последующим выделением чистой культуры патогена либо установлением факта присутствия микробного токсина и его природы. Моделирование экспериментальных инфекций у чувствительных животных — важный инструмент изучения патогенеза заболевания и характера взаимодействий внутри системы микроорганизм-макроорганизм. Для проведения биологических проб используют только здоровых животных определённых массы тела и возраста. Инфекционный материал вводят внутрь, в дыхательные пути, внутрибрюшинно, внутривенно, внутримышечно, внутрикожно и подкожно, в переднюю камеру глаза, через трепанационное отверстие черепа, субокципитально (в большую цистерну головного мозга). У животных прижизненно забирают кровь, экссудат из брюшины, после гибели — кровь, кусочки различных органов, СМЖ, экссудат из различных полостей.
Серологические методы исследований выявления специфических AT и Аг возбудителя — важный инструмент в диагностике инфекционных заболеваний. Особую ценность они имеют в тех случаях, когда выделить возбудитель не представляется возможным. При этом необходимо выявить повышение титров AT, в связи с чем исследуют парные образцы сыворотки, взятые в интервале 10-20 сут (иногда этот интервал может быть более длительным). AT обычно появляются в крови на 1-2-ю неделю заболевания и циркулируют в организме относительно долго, что позволяет использовать их выявление для ретроспективных эпидемиологических исследований. Определение классов Ig чётко характеризует этапы инфекционного процесса, а также может служить косвенным прогностическим критерием. Особое значение имеют методы выявления микробных Аг. В значимых количествах они появляются уже на самых ранних сроках, что делает их идентификацию важным инструментом экспресс-диагностики инфекционных заболеваний, а количественное их определение в динамике инфекционного процесса служит критерием эффективности проводимой антимикробной терапии.
Иммунохимические методы анализа, основанные на специфическом связывании определяемого соединения соответствующими антителами, вошли в аналитическую практику и широко используются в различных областях медицины. Как правило, к антителу прикрепляется метка, которая обнаруживает себя при образовании комплекса «антиген — антитело». В качестве метки может использоваться фермент, осуществляющий цветную реакцию (иммуноферментный анализ), или флюоресцентный краситель (иммунофлюоресценция).
Антигеном — веществом, против которого могут быть получены антитела, могут являться белки, полисахариды, реже — нуклеиновые кислоты, т. е. довольно крупные молекулы или клетки, на поверхности которых такие молекулы имеются. Таким образом, иммунохимические методы выявляют не возбудителя заболевания, а молекулы, сопутствующие ему, следовательно, они являются непрямыми методами анализа.
Молекулярно-биологические методы диагностики основаны на идентификации ДНК и РНК, специфичных для данного вида микробов, и включают гибридизацию на основе ДНК-зондов и диагностику на основе ПЦР.
Источник
