Микробиологические способы получения аминокислот

Биотехнология получения аминокислот, витаминов, метаболитов

» data-shape=»round» data-use-links data-color-scheme=»normal» data-direction=»horizontal» data-services=»messenger,vkontakte,facebook,odnoklassniki,telegram,twitter,viber,whatsapp,moimir,lj,blogger»>

БИОТЕХНОЛОГИЯ ПОЛУЧЕНИЯ ПЕРВИЧНЫХ МЕТАБОЛИТОВ

3.1. Производство аминокислот

Среди соединений, получаемых биотехнологическими метода­ми, аминокислоты занимают первое место по объему производства и второе место по стоимости, уступая по последнему параметру лишь антибиотикам. Объем мирового производства аминокислот со­ставляет более 500 тыс. т в год, из которых 300 тыс. т приходится на глутамат натрия, 100 тыс. т на лизин и 140 тыс. т на метионин. Одна­ко указанный объем — лишь небольшая доля от требуемого коли­чества аминокислот. По данным ВОЗ, потребность человечества всего лишь в четырех незаменимых аминокислотах составляет, млн т: для лизина — 5, метионина — 4, треонина — 3,7 и триптофана — 2.

Аминокислоты — структурные единицы белков. Природные ами­нокислоты вовлечены в биосинтез ферментов, ряда гормонов, витаминов, антибиотиков, алкалоидов, токсинов и других азот­содержащих соединений (пурины, пиримидины, гем и пр.). В орга­низме животного практически половина белковых аминокислот не синтезируется. Они называются незаменимыми аминокислотами и должны поступать в организм с пищей. Недостаток каждой из с этих аминокислот в пищевом или кормовом рационе приводит к нарушению обмена веществ, замедлению роста и развития. Сведе­ния о ежедневной потребности человека в незаменимых амино­кислотах представлены в табл. 3.2.

Таблица 3.3. Потребность ряда сельскохозяйственных животных в незаменимых аминокислотах ( % к сырому протеину)

Аминокислота	Свиноматки	Куры-несушки	Коровы
Лизин	5,0	5,0	4,5
Метионин	3,2	3,6	1,7
Триптофан	1,2	1,2	—
Треонин	6,0	4,0	3,4

Пищевая ценность белка определяется сравнением доли неза­менимых аминокислот в пище с этим же показателем при адекватном питании. Чем ближе обе величины, тем выше качество белка. 5епки яйца и молока обладают высокой пищевой ценностью и используются в качестве эталона при оценке других белков. Многие белки растительного происхождения характеризуются дефи­цитом некоторых незаменимых аминокислот. Так, белки пшени­цы и риса обеднены лизином и треонином, а белки кукурузы — пизином и триптофаном.

Введение синтетических незаменимых аминокислот в кормо­вые концентраты позволяет балансировать корма сельскохозяй­ственных животных по уровню белка. При добавлении 2 —4 дефи­цитных аминокислот к 1 т комбикорма общий расход кормов уменьшается на 15 — 20 %, выход продукции увеличивается на 20 %. Добавление к кормам аминокислот способствует переводу живот­новодства на промышленную основу. Данные о потребности не­которых сельскохозяйственных животных в незаменимых амино­кислотах приведены в табл. 3.3.

Помимо применения в качестве пищевых добавок, приправ и усилителей вкуса аминокислоты используют как сырье в хими­ческой, парфюмерной и фармацевтической промышленности и при производстве ряда других веществ:

глицин — подсластитель, антиоксидант, бактериостатик;

аспарагиновая кислота — усилитель вкуса, сырье для синтеза асгтартама;

глутаминовая кислота — усилитель вкуса, препарат для лече­ния психических заболеваний;

гистидин — противовоспалительное средство;

метионин — пищевая и кормовая добавки;

цистеин — фармацевтический препарат;

треонин и триптофан — пищевые и кормовые добавки;

фенилаланин — сырье для получения аспартама;

лизин — пищевая и кормовая добавки, сырье для получения искусственных волокон и пленок.

В промышленных масштабах белковые аминокислоты получают:

1. гидролизом природного белоксодержащего сырья;
2. химическим синтезом;
3. микробиологическим синтезом;
4. биотрансформацией предшественников аминокислот с по­мощью микроорганизмов или выделенных из них ферментов (хи­мико-микробиологический метод).

При гидролизе белоксодержащее сырье (отходы пищевой и молоч­ной промышленности) нагревают с растворами кислот или щело­чей при температуре 100 —105 °С в течение 20—48 ч. Чаще всего используют 20 %-й раствор соляной кислоты, обеспечивающий глу­бокий гидролиз белка. Кроме того, для ускорения реакции гидро­лиза белков используют иммобилизованные протеолитические фер­менты и ионообменные смолы. В ходе кислотного гидролиза белков происходят рацемизация и разрушение некоторых составляющих их аминокислот. При кислотном гидролизе полностью разрушается триптофан и достаточно значительны потери цистеина, метионина и тирозина (10—30%). Лучшим способом уменьшения потерь аминокислот при гидролизе является проведение его в вакууме или в атмосфере инертного газа, а также соблюдение высокого соотно­шения количества кислоты, взятой для гидролиза, и массы белка (200:1). Рациональное использование сырья при гидролизе, харак­терное для многих других биотехнологических производств, обес­печивает создание безотходных технологий и способствует оздо­ровлению окружающей среды. Ранее методом гидролиза получали аминокислоты исключительно для фармацевтических и научных це­лей. В последнее время сфера использования белковых гидролизатов существенно расширилась. Их применяют в медицине, живот­новодстве, пищевой и микробиологической промышленности.

Существенный недостаток методов химического синтеза ами­нокислот состоит в получении целевых препаратов в виде раце­мической смеси D- и L-стереоизомерных форм. Подавляющее боль­шинство природных аминокислот относится к L-ряду. D-a-аминокислоты обнаружены лишь в составе гликопротеинов клеточ­ных стенок бактерий, антибиотиков и некоторых токсинов. Проницаемость L-аминокислот в клетке в 500 раз превышает таковую ее антипода. Стереоспецифичны также транспорт и метаболизм аминокислот. Исключением в этом отношении является лишь ме­тионин, метаболизм которого нестереоизбирателен, благодаря чему данная аминокислота получается преимущественно путем хими­ческого синтеза. Разделение рацематов других аминокислот — до­рогая и чрезвычайно трудоемкая процедура.

Наиболее перспективен и экономически выгоден микробиоло­гический синтез аминокислот. Более 60 % всех производимых в настоящее время промышленностью высокоочищенных препаратов белковых аминокислот получают именно этим способом, главное преимущество которого в сравнении с методами химического синтеза состоит в возможности получения L-аминокислот на основ возобновляемого сырья.

В последние годы при производстве аминокислот все шире ис­пользуют биотрансформацию предшественников аминокислот, особенно с помощью иммобилизованных ферментов или клеток микроорганизмов, предварительно получаемых химическим путем.

Промышленное производство аминокислот стало возможным после открытия способности у некоторых микроорганизмов вы­делять в культуральную среду значительные количества какой-либо одной аминокислоты (С. Киносита, 1955). При этом было подме­чено, что большинство из нескольких тысяч проанализированных диких штаммов микроорганизмов продуцировали аминокислоты во внешнюю среду, но в очень незначительных количествах. Не зафиксировано никакой связи между таксономическим положе­нием микроорганизма и способностью к продуцированию той или иной аминокислоты. Так, среди возможных продуцентов глутаминовой кислоты отмечены организмы, из которых 30 % — дрожжи, 30% — стрептомицеты, 20% — бактерии и 10% — микроскопи­ческие грибы. И лишь один из обследованных штаммов микроорга­низмов — Corynebacterium glutamicum был способен к сверхсинтезу глутамата. Этот штамм использовали при организации первого в мире крупномасштабного производства глутаминовой кислоты микробиологическим методом в Токио (1956). В России изыскания в области промышленного синтеза аминокислот были начаты в 50-х годах прошлого столетия по инициативе акад. А. А. Александрова.

Таблица 3.4 Микроорганизмы ― продуценты аминокислот (по Н. Б. Градовой и О. А. Решетник, 1987)

Перспективные штаммы продуцентов постоянно улучшают по­средством селекции мутантов с измененной генетической про­граммой и регуляторными свойствами. Распространенные объек­ты селекции продуцентов — микроорганизмы, относящиеся к родам Brevibacterium, Micrococcus, Corynebacterium, Arthrobacter (табл. 3.4).

Разработка технологической схемы получения отдельной ами­нокислоты полностью базируется на знании путей и механизмов регуляции биосинтеза конкретной аминокислоты. Необходимого дисбаланса метаболизма, обеспечивающего сверхсинтез целевого продукта, добиваются путем строго контролируемых изменений состава и условий среды.

Микробиологические методы производства аминокислот

Производство лизина. По содержанию лизина наименее сбаланси­рованы белки злаковых культур, у которых его дефицит составляет от 20 до 50 %. На территории России недостаток лизина в кормах не может быть восполнен за счет сои, поэтому в нашей стране произ­водство этой аминокислоты было организовано первым. Для удовле­творения потребностей животноводства в лизине крупнотоннаж­ное производство налажено в Испании, Франции, Японии и США.

В клетках микроорганизмов лизин синтезируется из аспарагиновой кислоты и служит конечным продуктом разветвленного ме­таболического пути биосинтеза, общего для трех аминокислот — лизина, метионина и треонина (рис. 3.3).

Таким образом, в процессе новообразования аминокислот из об­щего предшественника одновременно с лизином возникают две дру­гие аминокислоты — метионин и треонин. В этом случае эффекта накопления в среде всего одной целевой аминокислоты добиваются путем блокирования процессов, ведущих к синтезу побочных амино­кислот, возникающих в связи с разветвлением метаболического пути.

Образование лизина в клетке бактерии находится под строгим метаболическим контролем. У типичных продуцентов L-лизина — Brevibacterium flavum и Corynebacterium glutamicum — фермент аспартаткиназа, открывающий метаболический путь, является аллостерическим белком, чувствительным к ингибированию по прин­ципу обратной связи при совместном и согласованном действие побочных продуктов L-треонина и L-лизина. При накоплении треонина и лизина в избыточной концентрации ингибируется аспартаткиназа и их синтез останавливается, при пониженной концен­трации любой из двух аминокислот процесс активизируется.

Чтобы добиться образования лизина в больших количества: получают мутанты двух типов. У мутантов первого типа не синтезруется или не функционирует гомосериндегидрогеназа, в результа­те чего блокируется синтез метионина и треонина. Такие мутанты являются ауксотрофами по гомосерину или треонину (метионину); внутриклеточная концентрация треонина у них существенно сни­жена, что снимает блокаду с аспартаткиназы. Поэтому при выра­щивании мутантных штаммов в среде, где присутствуют лимити­рующие концентрации метионина и треонина, они способны об­разовывать избыточные количества лизина. Мутанты второго типа дефектны по структурному гену, детерминирующему конформацию аспартаткиназы. В итоге фермент теряет чувствительность к высоким концентрациям аллостерического ингибитора — лизина.

Важный фактор, обеспечивающий в культуральной среде вы­сокие концентрации аминокислоты, синтезированной внутри клетки, — проницаемость клеточных мембран. Проницаемость кле­точной мембраны увеличивают либо с помощью мутаций, либо путем изменения состава питательной среды. В последнем случае в культуральной среде создают дефицит биотина (1 — 5 мкл/л), до­бавляют пенициллин (2 — 4 мкг/л), детергенты (твин-40 и твин- 60) или производные высших жирных кислот (пальмитаты, стеараты). Биотин контролирует содержание в клеточной мембране фосфолипидов, а пенициллин нарушает биосинтез клеточных сте­нок бактерий, что повышает выделение аминокислот в среду.

Для культивирования штаммов микроорганизмов при произ­водстве аминокислот как источники углерода наиболее доступны углеводы — глюкоза, сахароза и реже фруктоза и мальтоза. Для снижения стоимости питательной среды в качестве источников углерода используют вторичное сырье: свекловичную мелассу, молочную сыворотку, гидролизаты крахмала, сульфитные щело­ка. Технология этого процесса совершенствуется в направлении разработки дешевых синтетических питательных сред на основе уксусной кислоты (до 1,5%), пропионовой кислоты, метанола, этанола (до 1 %) и н-парафинов. В качестве источников азота при­меняют мочевину и соли аммония (сульфаты и фосфаты).

Для ус­пешного развития микроорганизмы нуждаются в стимуляторах роста, в качестве которых выступают экстракты кукурузы, дрож­жей и солодовых ростков, гидролизаты отрубей и дрожжей, вита­мины группы В. Кроме того, в питательную среду добавляют не­обходимые для жизнедеятельности макро- и микроэлементы (Р, Са, Mg, Мп, Feи др.). На процесс биосинтеза аминокислот суще­ственное влияние оказывает снабжение воздухом, при этом сте­пень аэрации индивидуальна для производства каждой конкрет­ной аминокислоты. Стерильный воздух подается специальными тур­бинными мешалками (рис. 3.4). Опыты показали, что лизин появ­ляется в культуральной среде начиная с середины экспоненци­альной фазы роста культуры клеток микроорганизма и достигает максимума к ее концу. Поэтому на первой стадии технологического процесса формируют биомассу продуцента, которую выращивают в специальных посевных аппаратах в течение суток (рН 7,0 — 7,2; температура 28 — 30 °С), а затем подают в производственный фер­ментер, заполненный питательной средой. Лизин начинает посту­пать в культуральную жидкость через 25 — 30 ч после начала фермен­тации. По завершении процесса ферментации (через 55 — 72 ч) жидкую фазу отделяют от культуры клеток микроорганизма филь­трованием и используют для выделения из нее лизина.

Высокоочищенные препараты лизина получают после фрак­ционирования фильтрата культуральной жидкости методом ионо­обменной хроматографии на катеоните. С этой целью лизин пере­водят в форму катиона:

Для данного процесса фильтрат обрабатывают соляной кисло­той до рН 1,6—2,0 (рН

Источник