7.6. Приготовление питательных сред в лабораторных условиях
Белковой основой всех сред является питательный бульон; в зависимости от состава среды остальные ингредиенты добавляют к питательному бульону. Существует два способа приготовления основного питательного бульона: 1) на мясной воде с добавлением готового пептона – это так называемый мясопептонный бульон; 2) на переварах продуктов гидролиза исходного сырья при помощи ферментов (трипсина — бульон Хоттингера, пепсина – бульон Мартена) или кислоты.
Приготовленные в лабораторных условиях гидролизаты разводят до нужного значения аминного азота (от 120 до 200 мг%) и добавляют входящие в рецептуру среды ингредиенты, предварительно отвешенные на лабораторных весах.
Растворение. Подготовленные навески ингредиентов помещают в стеклянную колбу или кастрюлю, доливают требуемое количество бульона или дистиллированной воды, кипятят на электрической плитке до растворения всех компонентов, устанавливают необходимое значение рН: сначала с помощью индикаторной бумажки, а затем потенциометра.
Фильтрование. Жидкие питательные среды фильтруют через двойной складчатый фильтр из фильтровальной бумаги, предварительно смоченной водой, или через фильтровальное полотно, которое накладывают на стеклянную воронку. Полотняные фильтры значительно практичнее бумажных, так как годны к употреблению в течение длительного времени, в то время как бумажные фильтры употребляются лишь однократно. Рекомендуется иметь отдельные полотняные фильтры для каждого вида среды.
Агаровые среды в расплавленном состоянии лучше всего фильтруются через ватно-марлевый фильтр: стеклянную воронку покрывают марлевой салфеткой такого размера, чтобы концы салфетки были перекинуты через края воронки наружу; затем на марлю кладут слой гигроскопической ваты, фильтр смачивают горячей дистиллированной водой. Агар наливают на фильтр горячим.
Желатиновую среду фильтруют через бумажный фильтр, предварительно смоченный дистиллированной водой. Желательно фильтрацию производить быстро в теплом помещении.
Розлив сред. После осветления и фильтрации питательные среды разливают в колбы, флаконы, пробирки, бутыли или матрацы.
Для разливки жидких питательных сред пользуются одной из описанных ниже установок.
- На конец воронки, закрепленной в кольце штатива, надевают резиновую трубку, оканчивающуюся стеклянным наконечником. На резиновую трубку накладывают зажим Мора. Под воронку подставляют сосуд для приема профильтрованной среды.
- • Для отмеривания и разливки определенных объемов среды пользуются градуированной бюреткой или собирают специальную установку (рис. 7.2). Стеклянную воронку и градуированную бюретку соединяют резиновыми трубками с двумя коленами стеклянного тройника, на третье его колено надевают резиновую трубку, заканчивающуюся стеклянным наконечником. На резиновые трубки, соединяющие воронку с тройником, и наконечник накладывают зажимы Мора. Ослабляя первый зажим, наполняют градуированный цилиндр жидкостью, затем, открыв второй зажим, выпускают отмеренное количество жидкости в сосуд для питательной среды. Первые порции жидкости до вытеснения воздуха из трубок не учитываются.
При розливе сред края посуды нельзя смачивать питательной средой, так как ватно-марлевые пробки, Приклеиваясь к стеклу во время стерилизации, вынимаются с трудом и оставляют в просвете отверстия сосуда остатки ваты. Попадая в среду, они могут вызывать загрязнение ее посторонней микрофлорой.
Поверх ватно-марлевой пробки на колбы и флаконы с питательными средами надевают бумажные колпачки.
Разливка плотных стерильных питательных сред в чашки Петри. Плотную питательную среду (агар, желатин) во флаконах или пробирках растапливают в водяной бане (сняв предварительно бумажные колпачки). Среду охлаждают до температуры 45–50 °С, сосуд берут в правую руку, левой рукой над огнем вынимают пробку и держат ее между мизинцем и ладонью, а края флакона или пробирки обжигают. Открытую посуду со средой держат в наклонном положении, чтобы избежать попадания в среду микробов из воздуха. В асептических условиях вносят стерильную кровь, сыворотку или другие необходимые добавки, тщательно перемешивают содержимое сосуда. Левой рукой приподнимают с одной стороны крышку чашки Петри и выливают в нее питательную среду в количестве 15–20 мл, слегка покачивая чашку, чтобы среда распределялась равномерным слоем по ее поверхности (рис. 7.3).
В настоящее время ряд фирм изготовляют приборы-автоматы для разливки агаризованных сред в чашки Петри, обеспечивающие высокую стерильность и точное дозирование разливаемых сред. Один из таких приборов изображен на рис. 7.4.
При застудневании агара образуется большое количество конденсационной воды, которая оседает на внутренней стороне крышки и увлажняет поверхность среды. В связи с этим перед посевом среды подсушивают: чашку в открытом виде помещают в термостат таким образом, чтобы крышка служила опорой для края ее дна, перевернутого средой вниз. Чтобы избежать образования конденсированной влаги, чашки с расплавленным агаром тотчас после заливки накрывают листом фильтровальной бумаги, которую стерилизуют вместе с чашкой. Бумага не должна касаться поверхности среды. Когда среда окончательно остынет, фильтровальную бумагу снимают, а чашки закрывают крышками.
Стерилизация питательных сред. Стерилизацию питательных сред осуществляют различными способами в зависимости от тех ингредиентов, которые входят в их состав.
- Синтетические среды и все жидкие и агаровые среды, не содержащие в своем составе нативного белка и углеводов, стерилизуют 15 мин в автоклаве при температуре 121 °С.
- Среды с углеводами и молоком (в состав которого входит лактоза), питательный желатин стерилизуют текучим паром при температуре 100°С дробно или в автоклаве при 110 – 112°С.
- Среды, в состав которых входят белковые вещества (сыворотка крови, асцитическая жидкость или антибиотики и другие добавки), стерилизуют фильтрованием или стерильные вещества добавляют в питательные среды ex tempore.
Для стерилизации питательных сред, содержащих в своем составе нативные белки, пользуются фильтрацией через мембранные фильтры, изготовляемые различными фирмами.
Приготовленные к употреблению стерильные питательные среды проверяют на стерильность. Для этого их ставят в термостат при температуре 37 °С. Среды, простерилизованные в автоклаве, выдерживают в термостате 1 сут, простерилизованные текучим паром – 3 сут.
Источник
6. 2. Приготовление питательных сред
Обычные питательные среды
К ним относятся мясо-пептонный бульон (МПБ) и мясо-пептонный агар (МПА). Основой для приготовления этих сред служит мясной экстракт. Для его приготовления берут 500 г свежей говядины или телятины, освобожденной от костей, жира и сухожилий, пропускают через мясорубку, фарш заливают 1 литром водопроводной воды, хорошо размешивают. Оставляют на сутки в прохладном месте или помещают на 2 часа в термостат при 37°. Мясной экстракт отжимают через марлю. Кипятят в течение 20 минут для свертывания белков, дают остыть. Фильтруют через ватный фильтр, доливают водой до первоначального объема. Приготовленный мясной экстракт разливают по флаконам и 20-30 минут стерилизуют в автоклаве. Правильно приготовленный мясной экстракт представляет собой слабокислую (рН=6,2) прозрачную желтоватую жидкость без белков. В ней содержится большое количество аминокислот, солей, углеводов, факторов роста и экстрактивных веществ.
Мясо-пептонный бульон (МПБ) – жидкая питательная среда, прозрачная. В 1 л мясного экстракта растворяют при подогревании и помешивании 10 г пептона (1 %) и 5 г (0,5 %) поваренной соли. Устанавливают рН среды 7,6. Кипятят 30-45 минут для выпадения осадка. Охлаждают, фильтруют через бумажный фильтр, заливают водой до первоначального объема, проверяют рН. Разливают по пробиркам, флаконам и стерилизуют 15-20 мин в автоклаве при давлении 1 атм.
Пептон представляет собой первичные продукты гидролизата белка. Он состоит из смеси альбумоз, полипептидов и аминокислот, полученных путем пепсинно-трипсинного гидролиза. На мясокомбинатах для производства сухого пептона используют фибрин, кровь и другие отходы. Сушат пептон в распылительной вакуум-сушилке.
Мясо-пептонный агар (МПА) – плотная питательная среда. Для его приготовления к мясо-пептонному бульону добавляют 2-3 % агар-агара, расплавляют в водяной бане, фильтруют, разливают по колбам или пробиркам и стерилизуют в автоклаве при давлении 1 атм 15-20 минут.
Для приготовления «скошенного» МПА среда, разлитая до ¼ высоты пробирки, вновь расплавляется и помещается на наклонную плоскость.
Для уплотнения сред чаще всего используют агар-агар, который представляет собой полисахарид, получаемый из красных морских водорослей. Большинство микроорганизмов не используют его в качестве питательного субстрата. В воде агар образует гели, плавящиеся при 100°, а затвердевающие при 40°.
Мясо-пептонный желатин (МПЖ) – к мясо-пептонному бульону добавляют 10-15 % мелко нарезанного желатина, после набухания его нагревают до полного расплавления. Устанавливают рН 7,0-7,1 и стерилизуют текучим паром 3 дня подряд по 30 мин. Для обнаружения протеолитических свойств культуру бактерий сеют уколом в столбик желатина, посевы оставляют на несколько дней при комнатной температуре для учета характера разжижения.
Желатин представляет собой белок, который получают путем выварки костей, хрящей и др.
Сахарный МПБ и МПА. К обычным средам добавляют 1-2% глюкозы, разливают по пробиркам и стерилизуют текучим паром дробно или авто-клавируют при 0,5 атм 20 минут.
Сывороточный МПБ и МПА. К МПБ добавляют 5-10% стерильной сыворотки крови и разливают по пробиркам.
МПА расплавляют, остужают до 45-50° и добавляют 5-10% сыворотки крови. Полученную среду разливают в чашки Петри или пробирки.
Свернутая сыворотка. Сыворотку разливают по пробиркам (4-5 мл) и в наклонном положении свертывают в аппарате Коха (рис. 13). Свертывание проводят при 80° в течение полутора часов. Среду контролируют на стерильность в термостате в течение суток.
Кровяной МПА. К стерильному расплавленному и охлажденному до 45° МПА, разлитому в пробирки или чашки Петри, стерильно прибавляют 5-10% дефибринированной крови (кролика, барана).
Жидкие среды Гисса. Для их приготовления используется 1%-ная пептонная вода (рН=7,0) с 0,5 % соответствующего углевода и индикатора (бромтимолблау, Андредэ и др.). Улавливание газа производится путем помещения на дно пробирки поплавков (стеклянных трубок), запаянных с одного (верхнего) конца.
Для улавливания пузырьков газа можно также к жидкой среде Гисса добавить 0,5 % агар-агара.
Рис. 13. Аппарат Коха
Стерилизуют среды Гисса при 110° в течение 10 минут или текучим паром в течение 30 минут 3 дня подряд.
В настоящее время среды с углеводами выпускают в сухом виде фабричным способом. Они состоят из питательного агара, соответствующего углевода и индикатора ВР (смесь водного голубого красителя с розоловой кислотой). Для приготовления полужидкой среды 2 г сухой среды растворяют при подогревании в 100 мл дистиллированной воды и доводят до кипения, разливают в стерильные пробирки и стерилизуют 10 минут при 110° или дробно. Среда имеет цвет питательного агара.
При ферментации углеводов с образованием кислоты наблюдается посинение среды, с образованием щелочи – покраснение.
Для выделения чистой культуры возбудителей кишечных болезней и их дифференциации с Е. coli длительное время использовались среды Эндо и Левина, в настоящее время применяется главным образом среда Плоскирева.
Среда Эндо, выпускаемая в сухом виде, готовится следующим образом: 5 г порошка растворяют при подогревании в 100 мл дистиллированной воды, кипятят 2-3 минуты при постоянном помешивании и разливают в чашки.
При отсутствии сухой среды Эндо она может быть приготовлена ех tempore. К 100 мл стерильного расплавленного МПА добавляют 1 г лактозы, растворенной и прокипяченной в 5 мл дистиллированной воды, и 1 мл насыщенного спиртового раствора основного фуксина, обесцвеченного перед добавлением к агару 10%-ным водным раствором сульфита натрия до бледно-розового оттенка. Среду смешивают, разливают по чашкам и подсушивают в термостате.
Е. coli ферментирует лактозу с образованием кислоты. Обесцвеченный фуксин в среде Эндо с изменением реакции в кислую сторону приобретает первоначальный цвет, что и обусловливает красный с металлическим блеском цвет колоний Е. coli. Патогенные бактерии – возбудители кишечных болезней – не ферментируют лактозу и растут на среде Эндо в виде бесцветных колоний.
Среда Левина. Сухая среда Левина готовится аналогично сухой среде Эндо. При необходимости она может быть приготовлена ех tempore. К 100 мл стерильного расплавленного питательного агара добавляют 2 г лактозы, растворенной и прокипяченной в небольшом количестве дистиллированной воды, 2 мл 0,5%-ного предварительно прогретого водного раствора метиленовой сини и 1,5 мл 1%-ного водного раствора эозина (растворы красителей готовят заранее, стерилизуют текучим паром), 0,2 г двухосновного фосфорнокислого калия (К2НРО4), среду перемешивают и разливают по чашкам. Среда темно-лилового цвета. Колонии Е. соli имеют сине-черный цвет, бактерии, не ферментирующие лактозу, образуют бесцветные колонии. Данная среда, как и среда Эндо, используется в настоящее время главным образом для выделения Е. соli.
Среда Плоскирева содержит сухой питательный агар, набор различных солей, соли желчных кислот, бриллиантовую зелень и нейтральный красный индикатор. Е. соli в связи с подавлением ее жизнедеятельности солями желчных кислот и бриллиантовой зеленью, растут на этой среде скудно, в виде колоний розового цвета. Микробы из воздуха не растут (чашки в открытом виде подсушивают на воздухе в течение 1 часа). Патогенные бактерии сальмонеллы образуют на среде бесцветные прозрачные колонии.
Среда Сент-Иваньи, в состав которой входит МПА с 0,1 % кристаллвиолета и 1 % азида натрия. На этой среде вырастает только возбудитель рожи свиней.
Для выделения чистой культуры гриба рода кандида применяют среду, содержащую МПА со стрептомицином.
Сухие питательные среды
В последние годы в бактериологии широко используются сухие питательные среды, что позволяет лабораториям избавиться от громоздкого процесса приготовления сред.
Для этого навеску, указанную на этикетке, всыпают в емкость с холодной дистиллированной водой и нагревают до кипения до полного растворения порошка.
Выпускают обычные, специальные, дифференциально-диагностические и элективные сухие среды.
Часто приходится разливать питательные среды мерно. С этой целью в лабораторной практике используют специальные приспособления (рис. 14).
Определение рН питательных сред производится электрометрическим методом – потенциометром (рис. 15). После установления рН питательной среды (МПБ обычно имеет рН 6,6-6,8) доводят его до нужного (рН 7,4). Для этого по каплям микропипеткой добавляют 0,1 н. едкий натр в стакан с питательной средой, в который опущены электроды потенциометра. После установления количества щелочи, необходимой для получения 7,4 на 1 мл среды делают расчет на нужное количество. Если на 1 мл затрачено 0,08 мл 0,1 н. раствора едкого натра, то к 10 литрам среды необходимо добавить 800 мл щелочи.
Во избежание разбавления питательной среды для получения необходимого рН к ней добавляют 1 н. раствор едкого натра, т.е. всего 80 мл.
Для определения рН плотных питательных сред расплавленный агар или желатин, учитывая буферность этих сред, разводят в 7 раз теплой дистиллированной водой. После установления соответствующего рН среду кипятят, фильтруют, осветляют, разливают во флаконы, пробирки и стерилизуют. Следует учитывать, что после стерилизации среда становится более кислой на 0,2 единицы.
Задания для самостоятельной работы
1. Ознакомиться с классификацией питательных сред, с основными принципами их приготовления.
2. Приготовить простые питательные среды – МПБ и МПА.
3. Определить и установить нужный рН в этих средах.
4. Питательные среды разлить по колбам, пробиркам и подготовить их к стерилизации.
Рис. 14. Аппаратура для мерного разлива питательных сред
Рис. 15. Схема лабораторного рН-метра ЛПУ-01 и его электронной системы: 1 – полый шарик из электродного стекла; 2 – стеклянный электрод; 3 – внутренний контактный электрод; 4 – вспомогательный электрод; 5 – электролитический контакт; 6 – пористая перегородка; 7 – контролируемый раствор; 8 – раствор, заполняющий внутреннюю полость электрода; 9 – раствор КСl; 10 – показывающий прибор; 11 – светофильтр контрольной лампы; 12 – тумблер; 13 – переключатель вида работ; 14 – переключатель пределов измерения; 15 — переменное сопротивление настройки крутизны; 16 – переменное сопротивление настройки по буферному раствору; 17 – переменное сопротивление ручной температурной компенсации; 18 — клемма заземления датчика; 19 – винт фиксации узла ручного температурного компенсатора
Вопросы для самоподготовки и контроля знаний
1. Какие компоненты используются при приготовлении МПБ?
А. Мясной экстракт, пептон, поваренная соль.
Б. Мясной экстракт, пептон, агар-агар.
В. Водопроводная вода, поваренная соль, пептон.
Г. Мясной экстракт, пептон, соль, сыворотка крови.
2. С какой целью при приготовлении МПА включают 2-3 % агар-агара?
А. Для повышения питательных свойств среды.
Б. Для создания плотной консистенции.
В. Для установления рН.
Г. Для создания изотоничности.
3. Установите, в качестве какого источника питания для бактерий служит пептон, входящий в состав многих питательных сред?
4. Мясо-пептонный агар по консистенции относится к средам:
5. К какой группе относятся питательные среды по применению?
А. Мясо-пептонный агар и мясо-пептонный бульон.
Б. МПБ и МПА с желчью, с сывороткой крови.
В. Среда Эндо, среда Гисса.
Г. МПА с 10 % поваренной соли для стафилококков.
1. Обычные питательные среды.
6. С какой целью используют элективные питательные среды?
А. Для выделения определенной группы или вида бактерий.
Б. Для накопления бактерий.
В. Для дифференциации.
7. Какой рН питательных сред для выращивания многих патогенных бактерий является оптимальным?
Источник
