Методы изучения морфологии спирохет способы окраски

Методы изучения морфологии спирохет способы окраски

Спирохеты (speira — изгиб, chaite — волосы) — спирально извитые, обладающие активной подвижностью бактерии. Размеры спирохет колеблются в толщину от 0,1-0,3 мкм, в длину от 7-500 мкм. Движения разнообразные – от винтообразных до сгибательных.

Электронно-микроскопическое исследование позволило различить у спирохет протоплазматический цилиндр (тело клетки), аксиальную (опорную) нить и трехслойную наружную оболочку. Аксиальная нить находится в периплазматическом пространстве между наружной оболочкой и протоплазматическим цилиндром и состоит из отдельных фибрилл (эндофлагелл), число которых у разных видов различно: у трепонем и лептоспир – 3-4; у борелий – до 30. Каждая из фибрилл (эндожгутиков) закрепляется в области прикрепительных дисков на концах протоплазматического цилиндра и тянется к противоположному его концу, обвивая его и заканчиваясь свободно. Химический состав фибрилл аналогичен составу жгутиков.

В протоплазматическом цилиндре содержатся: нуклеоид, рибосомы, мезосомы, включения. Наружная оболочка (клеточная стенка) содержит тонкий слой пептидогликана, эластична и не обладает ригидностью. Эндоспор, капсул и экзожгутиков эти бактерии не образуют, грамотрицательны, в мазке располагаются беспорядочно.

Спирохеты относятся к порядку Spirochaetales, семейство Spirochaetaceae, которое включает три рода:

1. Borrelia — имеет 3-10 неравномерных отлогих завитков, концы заострены, длиной 10-30 мкм. Движение толчкообразное, по Романовскому-Гимзе окрашиваются в сине-фиолетовый цвет (представитель Borrelia recurrentis – вызывает эпидемический возвратный тиф; Borrelia burgdorferi — вызывает лаймоборрелиоз).
2. Treponema — имеет 8-14 туго закрученных, одинаковых по амплитуде завитков, длина 5-15 мкм. Движение плавное, медленное с вращением вокруг продольной оси, по Романовскому-Гимзе окрашиваются в бледно розовый цвет (представитель Treponema pallidum – возбудитель сифилиса).
3. Leptospira — имеет до двух десятков мелких частых завитков, заканчивающихся крючком с пуговчатым утолщением, длиной 5-15 мкм. Движение очень активное, поступательное перемещение вперед, сгибание и вращение вокруг оси. По Романовскому-Гимзе окрашиваются слабо в розовато-сиреневый цвет (представитель Leptospira interrogans – возбудитель лептоспироза).

Методы исследования. В живом состоянии спирохеты изучают в фазово-контрастном микроскопе и темнопольном микроскопе, наблюдая за активным характерным движением спирохет, особенностями их формы.

Готовят препараты по Бурри (на темном фоне препарата становятся видимыми светлые извитые нити спирохет), окрашивают по Романовскому-Гимзе, по методу Морозова.

Источник

1.Спирохеты. Особенности морфологии и ультраструктуры. Принципы классификации. Способы микроскопического изучения.

Спирохеты (speira – виток, изгиб, chaite – волосы) – спиралевидные прокариоты, животной природы, не имеют ядра, не имеют клеточной стенки, движутся за счет осевой нити, при неблагоприятных условиях образуют цисты.

Патогенностью обладают спирохеты из родов Treponema (сифилис), Borellia (эпидемический и клещевой возвратный тиф), Leptospira (лептоспироз). Обладают способностью к активному движению – в клеточной стенке содержатся упорядоченно расположенные микрофибриллы – эндофлагеллы. Клетка спирохеты в структурном отношении представляет собой цитоплазматический цилиндр, ограниченный ЦПМ и покрытый клеточной стенкой. В цитоплазме содержатся нуклеоид, рибосомы, мезосомы, включения. Клеточная стенка тонкая, состоит из наружной мембраны и пептидогликанового слоя, тесно прилежащего к ЦПМ.

Микроскопия: Морфологию спирохет изучают в световом микроскопе в окрашенных препаратах, в живом состоянии в фазово-контрастном или темнопольном микроскопе. Спирохеты различаются по способности окрашиваться: одни хорошо окрашиваются обычными анилиновыми красителями — фуксином (боррелии – грамотрицательные), другие требуют специальных методов окраски (чаще всего по Романовскому-Гимзе).

Число и характер завитков

Окраска по методу Романовского-Гимзе

3-6, крупные, неравномерные

8-10, мелкие, равномерные

очень активное, вращательно-поступательное

2.Реакция преципитации (РП). Ускроенные серологические р-ии. Высокая чувств-ть. А: гаптен ,токсин. АТ содержатся в преципитирующей сыворотке. С пом. РП определяют видовую принадлежность белковых и кровяных пятен (в суд.медицине),вид. специфич-ть белковых добавок в пищ . продуктах.

Способ получения гаптена: суточную агаровую културу бактерий сываютизотонич. р-ром NaCl,кипятят,фильтруют и титруют. В резуль-те преципитации при титровании разводят не сыворотку,а АГ. Титр преципитир. р-ии–наименьшее кол-во АГ(наиб. его разведение) ,дающее видимую р-ю.

Способ постановки р-ии: 1)р-я кольципитации. На преципитир. сыворотку наслаивают гаптен. При «+» р-ии на гр-це 2-х сред появляется мутное кольцо; 2) р-я преципит-ии в геле. Ингредиенты р-ии (АГ+АТ) помещают в отдельные лунки в прозрачном агаре. При «+» р-и в местах встречи диффундир-их в среду АГ и АТ образ-ся белые линии преципитата.

Варианты РП в геле: А) радиальная иммунодиффузия по Манчини. Использ-ся для определения ур-я Ig в сыворотке кр. больного пприопредел-иииммун. статуса. Для поставноуи р-ии необходимы наборы моноспецифических диагностич. сывороток протиIg-ов человека: IgA(H), IgG(H+L), IgM(H). Эти сыворотки получ. гипериммуниз-ей кроликов,овец или коз иммуноглоб-амиIgG ,A ,M чел-ка.

Способ постановки: На стеклянную пластинку,покрытую тонки слоем агара с лунками, вносят сыворотку больного и диагностическую монорецепторные сыворотки. Пластинки выдерж во влажной камере при t 24 С’- 48часов. учет результатов произв. по изм-ю диаметра колец преципит-ии.Кол-во Igпроизв-ят по колибровочной кривой: на оси абсцисс-диметр кольца преципит-ии,на оси ординат-ур-ньIg в МЕ/мл.

Б)Иммуноэлектрофорез. Метод иммуноблоттинга. АГ нанос-ся на нитроцеллюлозную мембр,добав. АТ сыворотки кр. больного,кот. разгоняют в электрофарезе. В случае «+» р-ииАГ+АТ образ-ся полоски преципитата. Эту р-ю использ. для выявл-я у больного с ВИЧ-инфекцией различ. анти ВИЧ-АТ к разным белкам вируса.

Источник

21. Морфология и ультраструктура спирохет. Методы микроскопии.

Систематическое положение спирохет.

Семейство 1. Spirochaetaceae

8 – 12 завитков одинаковой амплитуды

Первичные завитки практически не видны, а вторичные крупные и образуют на концах «крючья», направлены в одну или в разные стороны

Амплитуда и количество завитков не постоянны (от 3 до 20)

В периплазматическом пространстве клеточной стенки вдоль всего тела бактерий проходит осевая нить (аксиальная нить или фибрилла), состоящая – аналогично жгутику – из сократительного белка флагеллина и служащая органом движения. Поэтому спирохеты двигаются благодаря сокращению всего тела

Окраска по Романовскому-Гимзе

Преимущественно используемый для обнаружения вид микроскопии

Любой вид микроскопии

Методы выявления спирохет.

— Спирохеты плохо воспринимают красители. Обычно их окрашивают по методу Романовского-Гимзе или серебрением по Морозову, а также применяют негативное окрашивание по методу Бурри; в живом виде их исследуют с помощью фазово-котрастной и темнопольной микроскопии.

Метод Романовского-Гимзе. Краситель состоит из эозина, метиленового синего и азура растворенных в смеси метанола с глицерином. Базофильная зернистость окрашивается в синий цвет, эозинофильная — в красный, а нейтрофильная — в сиреневый цвет.

1. Приготовить микроскопический препарат и обработать его в жидком фиксаторе.

2. Поместить фиксированный препарат на два стеклянных валика в чашку Петри вниз ко дну и подливают разведенный в 10-20 раз свежеприготовленный краситель. Окрашивание длится от 30-60 минут до нескольких часов.

3. Мазки промывают водой и высушивают на воздухе.

22. Актиномицеты. Систематическое положение. Роль в природе. Идентификация.

Систематическое положение актиномицетов.

Актиномицеты — это бактерии, сходные с мицеллярными грибами. С бактериями у них общее строение клетки, с грибами — форма клетки и размножение. Большинство актиномицетов обитают в почве и составляют 20-60% общей микробной популяции. Патогенные представители — Actinomyces israelii, Actinomyces naeslundii вызывают актиномикоз. Стрептомицеты продуцируют антибиотики.

1. По Грамму (грамположительны). В пораженных тканях они образуют актиномикотическую друзу, которая представляет собой агрегаты переплетенного мицелия в центре с отдельными, отходящими наподобие лучей гифами с колбовидным утолщением на концах — по периферии. При окраске по Граму центр окрашивается позитивно, а поверхность негативно.

2. Микроскопические препараты из актиномицетов можно окрасить по методу Романовского-Гимзе и по Цилю–Нельсену (некоторые актиномицеты кислотоустойчивы).

3. Актиномицеты хорошо воспринимают анилиновые красители, например, метиленовый синий.

Морфология: представляют собой слабоветвящиеся (актиномицеты) палочки или сильноветвящиеся гифы (стрептомицеты). Стрептомицеты образуют экзоспоры. Пептидогликан содержит сахара, отсутствующие у других прокариот.

Источник

Методы выявления спирохет и лептоспир

1. Метод изучения спирохет и лептоспир в нативном препарате.

Для исследования живых спирохет и лептоспир используется метод тёмного поля и прямая люминесцентная микроскопия.

Препараты для них готовят одинаково с небольшими различиями

— берут 1 каплю биосубстрата (кровь, вода, соскоб из язвы и пр.), наносят на стекло

— осторожно закрепляют покровным стеклом и устанавливают на столик темнопольного, либо люминесцентного микроскопа

— микроскопируют с иммерсионной системой.

Микроскопия в тёмном поле

1. Конденсор Аббе в обычном световом микроскопе заменяют на специальный тёмнопольный. При его отсутствии модернизируют обычный. Для этого:

— из чёрной фотографической бумаги вырезают круг размером с 50 копеечную монету;

— наклеивают на середину верхней линзы конденсора строго посередине с круговым зазором для света;

— фиксируют конденсор в микроскопе.

2. Перед микроскопией на конденсор наносят каплю дистиллированной воды для предотвращения рассеивания света, но можно не наносить.

3. На покровное стекло препарата наносят каплю иммерсионного масла и микроскопируют.

4. При работе с большим объектом в биоматериале можно вместо ОИ-90 использовать один из сухих объективов (*7, * 10, *20, *40), а масло заменить дистиллированной водой.

При микроскопии на тёмном фоне видны серебристые движущиеся спирохеты.

Люминесцентная прямая микроскопия.

— При приготовлении препарата к биоматериалу для прижизненной окраски добавляют флюорохром акридин оранжевый в рабочем разведении 1:1000 и только после этого накрывают покровным стеклом. Микроскопируют в люминесцентном микроскопе МЛ-1 или МЛ-2 с набором пропускающих и запирающих фильтров для УФ-лучей.

— Вместо обычного иммерсионного масла используют нелюминисцирующее иммерсионное или его заменители (репелленты — дибутилфталат, диметилфталат). Микроскопируют в затемнённом помещении.

При микроскопии жизнеспособные клетки двигаются, имеют чаще зелёное свечение, нежизнеспособные и умирающие оранжевые и обездвижены. Оба метода особенно удобны при обнаружении лептоспир, которые невозможно окрасить.

Окраска спирохет в чистом виде и в биоматериале

1. Серебрение по Морозову.

2. Окраска по Романовскому-Гимзе

— препарат фиксируют химическим фиксатором

— окрашивают раствором красителя краски Гимзе (2 капли — азур-эозин с метиленовой синью на 1 мл щелочной дистиллированной воды) 20 минут

— промывают водой, высушивают

— микроскопируют с иммерсией. Ядерные элементы имеют красно-фиолетовый цвет, цитоплазма — голубая или слабо-розовая. Примечание: если краситель спиртовой, то мазок не фиксируется

3. Окраска по Граму.

4. Обработка по Бурри.

Вопросы для тестового контроля усвоения темы

1. Возбудители спирохетозов выявляют на препаратах по а) Ожешко б) Граму в) методом темного поля

2. Какие структурных элементов нет у спирохет? а) первичных анатомических завитков б) вторичных функциональных завитков в) осевой эластической нити д) фибрилы е) спор ж) цист

3. Чем микоплазмы отличаются от других видов бактерий: а) имеют ядро б) не имеют цитоплазматической мембраны в) не имеют клеточной стенки г) имеют нуклеоид

4. Какие из бактерий имеют две формы существования — стадию «ЭТ» — элементарного тельца вне клетки и стадию «РТ» — ретикулярного тельца внутри клетки? а) спирохеты б) хламидии в) микоплазмы г) простейшие

5. Какие из перечисленных микроорганизмов могут образовывать в организме больного цисты: а) риккетсии б) спирохеты в) микоплазмы

6. Назовите форму риккетсий: а) шаровидная б) палочковидная в) нитевидная г) полиморфная д) бациллярная

7. Риккетсии окрашивают по:

8. Риккетсии окрашиваются в цвет:

9. По своим биологическим свойствам простейшие относятся к:

10. По своим биологическим свойствам грибы относятся к:

11. По своим биологическим свойствам спирохеты относятся к:

12. Трофозоиды простейших окрашивают:

а) раствором Люголя б) по Романовскому — Гимзе

13. Цисты простейших окрашивают: а) раствором Люголя б) по Романовскому — Гимзе

14. Кому из грибов принадлежат мицелий и гифы: а) дрожжи и дрожжеподобные б) лучистые в) нитчатые г) все вышеперечисленные

15. Кому из грибов свойственно почкование и зерна волютина: а) дрожжи и дрожжеподобные б) лучистые в) нитчатые

16. Кому из грибов принадлежат друзы: а) дрожжи и дрожжеподобные б) гифальные

17. Чем являются для грибов аски (эндоспоры): а) органами размножения б) органеллами защиты в) органом дыхания г) органом сохранения вида

18. Чем являются для бактерий споры: а) органами размножения б) органеллами защиты в) органом дыхания г) органом сохранения вида

1. Лекция по теме.

2. Методическая разработка по теме.

3. Борисов Л.Б. Медицинская микробиология, вирусология, иммунология. С-Пб., 2005. С. 41-45.

4. Медицинская микробиология, вирусология и иммунология. Под ред. Воробьева А.А. М., 2006. С. 30-50.

5. Мотавкина Н.С., Артёмкин В.Д. Атлас по микробиологии и вирусологии. М. 1976. С. 7- 12.

6. Кашкин П.Н. Медицинская микробиология. М., 1999. С. 529-531.

Медицинская микробиология. Под редакцией В.И. Покровского, О.К. Поздеева. М., 1999.

2. Атлас по медицинской микробиологии, вирусологии и иммунологии. Под ред. Воробьева А.А., Быкова А.С. М., 2003. С.78-82, 85-92, 141-181.

Источник