Методы измерения в клинической биохимии
Дылдин Д.Р. — директор ООО «Юнимед-Сервис»
Шибанов А.Н. — генеральный директор А/О Юнимед, член правления Ассоциации производителей средств клинической лабораторной диагностики, генеральный секретарь РАМЛД
Все измерения в клинической биохимии (как собственно и во всех других областях) выполняются прямым либо косвенным методом.
В первом случае проводится прямое измерение заданных аналитов.
При косвенном методе измеряется одна величина и пересчитывается в другую. При этом измеряемая величина должна иметь функциональную зависимость от рассчитываемой.
Для прямых измерений используются специальные датчики (или чипы), которые реагируют только на наличие того вещества, для поиска которых они созданы. Это могут быть ионоселективные датчики, датчики глюкозы, лактата, pH, датчики газов. Прямой метод является весьма точным и дешевым способом измерения. Однако, его недостаток состоит в том, что прибор, созданный для измерения какого-либо одного аналита не сможет измерять концентрацию других веществ, что сужает применение приборов данного типа. Для измерения концентрации, скажем, 30-40 веществ (а обычно столько методик и выполняют в лабораториях), необходимо столько же приборов.
Универсальность измерений обеспечивается устройствами, использующими косвенный метод измерения. К таким относятся программируемые и автоматические фотометры. В этом типе приборов реализован принцип фотометрирования, при котором регистрируют оптическую плотность и ее изменения.
Измерение концентрации белков, микроэлементов, ферментов, гормонов в биологических жидкостях осуществляется с использованием специальных наборов реагентов, при взаимодействии которых с соответствующими аналитами происходит измерение окраски реакционной среды, что регистрируется фотометрически.
Следует иметь в виду, что исследуемый материал должен быть оптически прозрачным посуда, в которой производится фотометрирование (в противном случае фотометрирование будет затруднено или вообще невозможно).
Еще сравнительно недавно в лабораториях для биохимических исследований применялись в основном достаточно простые фотометры (типа ФЭК, КФК и т.п.). В последнее время таких инструментов остается все меньше, но до сих пор и они еще встречаются. Измерения сопровождаются вычислениями (иногда довольно трудоемкими). От лаборанта требуется приготовить исследуемый образец, согласно требованиям того набора реагентов, который он собирается использовать, провести биохимическую реакцию, затем произвести фотометрирование, произвести необходимые расчеты и получить результат.
Следующим шагом в развитии приборного оснащения являются программируемые фотометры (приборы типа Stat Fax). Используя эти инструменты, заранее их запрограммировав на достаточно большое количество методик можно существенно ускорить работу. Однако и эти инструменты не выпадают из цепочки: исследуемая среда → измерительный прибор → результат. От качества пробоподготовки, проведения реакции и чистоты посуды существенно зависит точность результатов.
Автоматические биохимические анализаторы позволяют существенно ускорить и упростить процесс получения конечного результата. В этом инструменте проведение реакции (разведение исследуемого образца и реагента, выдерживание времени реакции) и фотометрирование производится автоматически. Роль лаборанта сводится к правильной пробоподготовке (приготовлению исследуемого материала) и загрузкой на борт прибора исследуемых образцов и реагентов. Однако и здесь есть некоторые подводные камни. Вся работа должна в точности соответствовать заданной методике (алгоритму выполнения приготовления реакционной смеси, регистрации и расчета) и попытки что-либо изменить в методике (обычно это делается с целью экономии либо времени, либо расходных материалов) приводит к негативным последствиям, как в точности измерений, так и работе прибора в целом.
Кроме того, при использовании косвенных методов измерения, следует помнить о том, что в самом принципе косвенного метода заложена определенная погрешность.
Поэтому для каждой методики указывается ее точность и воспроизводимость, что необходимо учитывать. Кроме того, в любом инструменте содержатся узлы (а в автоматах их очень много), которые требуют технического обслуживания (очистка, регулировка, замена изношенных деталей). Если этого не делать, то по мере износа прибора точность измерения будет снижаться, а достоверность измерений может вызывать сомнения. Это возникает вследствие износа дозирующих устройств, загрязнения оптического канала, люфтов подвижных устройств.
Фотометрирование в биохимии служит для определения искомого вещества в исследуемой среде и (или) вычисления его концентрации, либо активности, используя изменение окраски реакционной смеси (либо интенсивности окраски, т.е. ее оптической плотности). Как правило, фотометрирование производится на определенной длине волны, которая подбирается таким образом, чтобы поглощение света для данной реакционной смеси было максимальным.
Рисунок 1. Принципиальная схема фотометрического анализа
Расчет результатов измерений производится в зависимости от типа реакции. В частности здесь будут рассмотрены методы расчета по конечной точке, кинетические, псевдокинетические и их производные. В каждом случае расчеты производятся по коэффициенту (фактору), по одному стандарту, либо по калибровочной зависимости сложного вида (мультистандартная калибровка).
Определение по конечной точке
После смешивания реактива и образца, начинается химическая реакция, которая сопровождается изменением оптической плотности (Abs). По истечении времени инкубации, которое задается в методике, реакция прекращается, и изменение оптической плотности также прекращается. Оптическая плотность становится более-менее постоянной величиной, пропорциональной концентрации искомого вещества. В этот момент и производится измерение оптической плотности.
Рисунок 2.
Остановимся на этом моменте подробнее.
При калибровке по стандарту, выполняется замер оптической плотности реакционной смеси, где концентрация искомого вещества заведомо равна нулю (бланк). Затем, измеряется оптическая плотность реакционной смеси, где концентрация искомого вещества известна с высокой точностью (калибратор или, как еще говорят – стандарт), и химическая реакция подошла к концу (т.е. время инкубации закончилось). Калибратор обычно прилагается к набору реагентов. Допустим, что 250 – это оптическая плотность бланка, 700 – это оптическая плотность стандарта. Получив эти величины, мы можем построить график, где на горизонтальной оси — концентрация, а по вертикальной – оптическая плотность, причем оптическая плотность прямо пропорциональна концентрации.
Factor = сtg a
Рисунок 3.
Получив такой график, который называется калибровочным, измеряя оптические плотности последующих образцов (исследуемых), можно высчитать концентрацию искомого вещества.
При использовании калибровки по стандарту, расчет производится по следующей формуле:
При использовании современных инструментов фотометрирования (специализированных фотометров), концентрация высчитывается автоматически. При этом автоматически высчитывается фактор – пропорциональный углу наклона калибровочного графика по отношению к горизонтали (на самом деле высчитывается тангенс угла наклона).
Еще одна разновидность реакции по конечной точке – расчет по фактору.
В этом случае замеряется оптическая плотность бланка и по уже заданному фактору (который пропорционален углу наклона) производится измерение плотностей исследуемых образцов.
Формула для расчета будет следующей:
Еще одна разновидность конечно-точечной реакции – определение по сложной калибровочной кривой. Такая калибровочная зависимость применяется, когда интенсивность изменения окраски не прямо пропорциональна концентрации искомого вещества. В таких случаях используют несколько стандартов (до 9).
Рисунок 4.
Если говорить о современных методах исследований, то такая калибровка применяется чаще всего в методах иммунохимии.
Кроме всего, следует упомянуть о методах бихроматического фотометрирования. Этот метод является частным случаем метода по конечной точке. Вместо оптической плотности измеренной на одной длине волны, в расчете используется разность оптических плотностей, измеренных на двух длинах волн – основной и вспомогательной (часто в терминологии используется термин – дифференциальный). Такой метод определения используется, когда нужно «отфильтроваться» от помех, обусловленных оптическими свойствами емкости, в которой производится фотометрирование (например, цилиндрическая пробирка), мутностью исследуемого образца (а иногда и окраской).
Еще одним частным случаем метода определения по конечной точке является дифференциальный метод (метод с холостой пробой по образцу). При использовании этого метода на одном и том же исследуемом образце приготавливается две пробы – одна с неполной композицией реагентов (когда не происходит специфическое окрашивание образца), вторая с полной композицией реагентов, когда специфическое окрашивание происходит. Разница оптических плотностей этих двух проб пропорциональна концентрации исследуемого вещества.
Кинетические методы измерения
Кинетические методы измерения – это методы, когда изменения оптической плотности регистрируются во времени и измеряется скорость изменения, которая пропорциональна либо концентрации исследуемого вещества, либо активности этого вещества (например, ферментов).
Ниже показан типичный пример кинетического измерения.
Рисунок 5.
Расчет производится либо по фактору, либо по стандарту.
Активность ферментов обычно вычисляется по фактору:
Расчет с калибровкой по стандарту:
В случае калибровки по стандарту, расчет происходит по той же самой формуле, только здесь фактор не является параметром, заданным в методике на реагенты, а вычисляется по формуле:
Псевдокинетические методы измерения (двухточечная кинетика).
Здесь также определяется скорость изменения оптической плотности по времени реакции, только здесь измеряется оптическая плотность в начале интервала измерения (после ЛАГ-фазы) и в конце.
Источник
16.Методы определения и способы выражения активности ферментов.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ ФЕРМЕНТОВ
О количестве ферментов судят по скорости катализируемой реакции в определенных, согласованных условиях измерения. При оптимальных условиях температуры, рН среды и полном насыщении фермента субстратом скорость катализируемой реакции пропорциональна концентрации фермента. О скорости ферментативной реакции судят или 1)по скорости убыли субстрата, или 2)по скорости образования продукта реакции.
Для выражения концентрации фермента и количественной оценки его активности в условных единицах
Комиссией по ферментам Международного биохимического союза была рекомендована стандартная международная единица (Е или U): за единицу активности любого фермента принимается то количество его, которое в оптимальных условиях катализирует превращение 1 микромоля субстрата или образование 1 микромоля продукта в минуту (мкмоль/мин). В связи с введением Международной системы единиц (СИ) предложено новое выражение активности фермента в каталах (кат, kat): 1 кат есть каталитическая активность, способная осуществлять реакцию со скоростью, равной 1 молю в 1 с (1 моль/с). Отношение международной единицы (U) к каталу можно выразить следующим образом: 1 кат = 1 моль•с–1 = 60 моль•мин–1 = 60•106 мкмоль•мин–1 = 6•107 U, или: 1 U = 1 мкмоль•мин–1 = (1/60) мкмоль•с–1 = (1/60) мккат = 16,67 нкат. Таким образом, 1 U фермента соответствует 16,67 нкат. Рекомендовано, кроме того, измерять активность фермента при температуре 25°С, оптимуме рН и концентрации субстрата, превышающей концентрацию насыщения. В этих случаях скорость соответствует нулевому порядку реакции в отношении субстрата и будет зависеть только от концентрации фермента. Для выражения активности в практической работе с ферментами часто пользуются произвольными понятиями удельной и молярной активности. Удельную активность фермента принято выражать числом единиц ферментативной активности на 1 мг белка (или числом каталов на 1 кг активного белка). Количество молекул субстрата, подвергающихся превращению одной молекулой фермента в продукт в процессе реакции в единицу времени при полном насыщении фермента субстратом, принято называть числом оборотов фермента, или молярной активностью (молярная каталитическая активность выражается в каталах на 1 г-моль фермента). Одна молекула каталазы эритроцитов способна, например, расщепить в 1 с 44000 молекул перекиси водорода. Принципы определения активности ферментов: по скорости исчезновения субстрата; по скорости накопления продуктов реакции.
Для определения ферментативной активности используют следующие методы: 1. Химический метод – количественное определение субстрата или продуктов с помощью химических реагентов (О-гликозилгидролазы – по образованию восстанавливающих сахаров). 2. Спектрофотометрический метод – измерение скорости ферментативной реакции по изменению поглощения субстрата при характеристической длине волны (лиазы – по образованию двойной связи). 3. Манометрический метод – определение количества газа, выделяющегося в процессе реакции (оксидазы – по поглощению О2, декарбоксилазы – по выделению СО2). 4. Поляриметрический метод – фиксируется изменение оптического вращения (β-фруктофуранозидаза). 5. Хроматографический – количественное определение субстрата или продуктов с помощью различных видов хроматографии: бумажной (анализ сахаров), тонкослойной (гликозидов со сложными агликонами), ВЭЖХ (аминокислотный анализ и др.).
Источник
