Метод центрифугирования как способ изучения клетки

Современные общие методы исследования клетки

1. Метод дифференциального центрифугирования. При быстром вращении в ультрацентрифуге органоиды клеток располагаются слоями в соответствии со своей плотностью и массой. Более плотные органеллы осаждаются при более низких скоростях, а менее плотные — при более высоких скоростях. Далее исследователи эти слои отделяют и изучают. Данный метод позволяет наблюдать свойства и структуру каждого органоида или макромолекулы клетки.

2. Рентгеноструктурный анализ позволяет определить атомную структуру вещества. Рентгеновские лучи короче ультрафиолетовых.

3. Авторадиография (радиоавтография) — метод изучения распределения радиоактивных веществ в исследуемом объекте, при котором эти вещества как бы сами себя фотографируют. Например, при изучении фотосинтеза биологи с помощью этого метода могут увидеть след радиоактивного диоксида углерода.

4. Световые микроскопы появились еще в XIX веке, они дают увеличение до 1350 раз. Разрешающая способность 0,25 мкм (2,5*10 –7 ). С их помощью можно увидеть ядро, большинство органоидов, хромосомы и деление клеток.

5. Электронный микроскоп дает увеличение в миллион раз (10 –6 ). Появился он в середине XX века. Разрешающая способность 2 нм (2*10 –9 ).

6. Флуоресцентная микроскопия. В ультрафиолетовом свете (его лучи короче лучей видимого света) клеточные компоненты могут светиться. Также они могут светиться при добавлении специальных красителей. С использованием данного метода можно видеть места, где скапливаются нуклеиновые кислоты, жиры, витамины и др.

Физико-химические методы исследования клеток

1. Метод меченых атомов. Используется для изучения биохимических процессов в живых клетках. Чтобы отследить превращения вещества из его предшественника, один из атомов заменяют соответствующим изотопом (водорода, фосфора, углерода). Радиоактивное излучение позволяет наблюдать за соединением, установить этапы его превращения, их продолжительность, зависимость от внешних условий.

2. Хроматография. Метод основан на разнице скорости движения растворенных веществ через адсорбент. Вещества имеют разную молекулярную массу и поэтому с разной скоростью двигаются через волокна фильтровальной бумаги, порошок целлюлозы, другие пористые вещества. Изучаемые вещества, например, основные пигменты экстракта листьев — ксантофилы, каротин, хлорофиллы а, b.

3. Электрофорез. Разделение смеси веществ в растворе обеспечивает электрический ток (в геле). Это помогает разделить смеси веществ в клетке, выделить качественный и количественный состав веществ.

4. Цитохимические методы. Этими методами исследуют препараты костного мозга, крови, различных органов и новообразований. Они основаны на использовании специфических химических цветных реакций для определения в клетках различных веществ. Под действием специально подобранных реактивов происходит окрашивание тех или иных веществ в цитоплазме, а по степени и характеру окраски судят о количестве или активности исследуемых веществ.

В чем разница между цитохимическими методами и хроматографией?

При цитохимических методах ведут цветные химические реакции с помощью специальных реактивов, и по окрашиванию веществ определяют их свойства. В хроматографии выводы о свойствах веществ делают по тому, с какой скоростью они двигаются через пористые вещества.

Методы разделения клеток и их культивирования

1. Методы культуры клеток и тканей. Клетки и ткани выращивают, исследуют, наблюдая за ростом, размножением вне организма, изучают влияние различных веществ, получают гибриды.

2. Метод рекомбинантных ДНК. Вырезают ДНК из клетки, встраивают ее в ДНК бактерий, вирусов, изучают механизм наследственности, мутагенез.

Источник

Центрифугирование в чем оно состоит, типы, значимость, примеры

центрифугирование представляет собой метод, способ или процедуру, которая механически или физически разделяет молекулы или частицы с различной плотностью и которые также присутствуют в жидкой среде. Его краеугольным камнем является применение центробежной силы, примененной командой под названием центробежная сила.

Центрифугированием компоненты жидкой пробы могут быть разделены и проанализированы. Среди этих компонентов различные классы молекул или частиц. В качестве частиц различные клеточные фрагменты относятся к органеллам клеток, даже к нескольким типам клеток, среди прочих..

Теодор Седжер считается одним из главных пионеров исследований в области центрифугирования. Нобелевская премия 1926 года определила, что молекулы или частицы с их собственными размерами имеют разные коэффициенты седиментации S. «S» происходит от Сведжера, в честь его работ.

Следовательно, частицы обладают характерными скоростями седиментации. Это означает, что не все ведут себя одинаково под действием центробежной силы, выраженной в оборотах в минуту (об / мин), или в зависимости от радиуса ротора (относительная центробежная сила)., г).

К числу факторов, определяющих S и скорость его, относятся, например, характеристики молекул или частиц; свойства среды; методика или метод центрифугирования; и тип используемой центрифуги, среди других аспектов.

Центрифугирование классифицируется в соответствии с его полезностью. В препаративной форме, когда ограничено разделение компонентов образца; и в аналитике, когда он также стремится анализировать отделенную молекулу или частицу. С другой стороны, он также может быть классифицирован в соответствии с условиями процесса.

Центрифугирование в его различных видах имеет важное значение для развития научных знаний. Используемый в исследовательских центрах, он облегчил понимание сложных биохимических и биологических процессов, среди многих других.

• 1 Что это? (Процесс)
  • 1.1 Основа центрифугирования
  • 1.2 Центробежная сила
• 2 типа центрифуг
  • 2.1 Типы роторов
• 3 типа центрифугирования
  • 3.1 Препаративное центрифугирование
  • 3.2 Аналитическое центрифугирование
  • 3.3 Дифференциальное центрифугирование
  • 3.4 Зонное или полосовое центрифугирование
  • 3.5 Изопикническое центрифугирование и другие виды
• 4 Приложения
  • 4.1 Отдельные частицы
  • 4.2 В качестве метода характеризации
• 5 Примеры центрифугирования
• 6 Ссылки

Из чего он состоит? (Процесс)

Основа центрифугирования

Процесс центрифугирования основан на том факте, что молекулы или частицы, составляющие образец в растворе, будут вращаться при вращении в устройстве, называемом центрифугой. Это вызывает отделение частиц от окружающей среды при осаждении на разных скоростях.

Процесс основан конкретно на теории седиментации. В соответствии с этим частицы с большей плотностью оседают, тогда как остальные вещества или компоненты среды остаются суспендированными.

Почему? Потому что молекулы или частицы имеют свои собственные размеры, формы, массы, объемы и плотности. Следовательно, не все из них могут осаждаться одинаково, что приводит к другому коэффициенту седиментации S; и, следовательно, с другой скоростью осаждения.

Эти свойства позволяют отделить молекулы или частицы центробежной силой с определенной скоростью центрифугирования..

Центробежная сила

Центробежная сила будет зависеть от нескольких факторов, которые будут определять седиментацию: те, которые свойственны молекулам или частицам; характеристикам окружающей среды, в которой они находятся; и факторы, связанные с центрифугами, в которых проводится процедура центрифугирования.

По отношению к молекулам или частицам масса, удельный объем и фактор флотации являются факторами, которые влияют на седиментацию..

Что касается окружающей среды, важны масса вытесненного растворителя, плотность среды, сопротивление продвижению и коэффициент трения..

Что касается центрифуги, то наиболее важными факторами, которые влияют на процесс осаждения, являются тип ротора, угловая скорость, центробежная сила и, следовательно, центробежная скорость.

Типы центрифуг

Существует несколько типов центрифуг, с помощью которых образец может подвергаться различным скоростям центрифугирования..

В зависимости от максимальной скорости, которую они достигают, выраженной в центробежном ускорении (Относительная центробежная сила г), можно классифицировать просто как центрифуги, имеющие максимальную скорость около 3000 г.

Хотя в так называемой supercentrifugadoras, Может быть достигнут больший диапазон скоростей около 25000 г. И в Ультрацентрифуги, скорость намного больше, достигая 100 000 г.

Согласно другим критериям, есть микроцентрифуги или настольные центрифуги, которые специально предназначены для выполнения процесса центрифугирования при небольшом объеме образца, достигают диапазона от 12000 до 15000 г..

Существуют высокопроизводительные центрифуги, которые позволяют центрифугировать более крупные и высокоскоростные образцы, такие как ультрацентрифуги..

Как правило, необходимо контролировать несколько факторов, чтобы защитить ротор и образец от перегрева. Для этого были созданы ультрацентрифуги с особыми условиями вакуума или охлаждения..

Типы роторов

Одним из определяющих элементов является тип ротора, устройство, которое вращается и где размещены трубы. Существуют разные типы роторов. Среди основных — роторы наклона, роторы с фиксированным углом и вертикальные роторы.

В поворотных роторах при размещении труб в устройствах такого типа и при повороте трубки приобретают расположение, перпендикулярное оси вращения..

В роторах с фиксированным углом образцы будут располагаться внутри твердой структуры; как видно на изображении и во многих центрифугах.

А в вертикальных роторах в некоторых ультрацентрифугах трубы будут вращаться параллельно оси вращения.

Типы центрифугирования

Типы центрифугирования варьируются в зависимости от цели его применения и условий, в которых выполняется процесс. Эти условия могут отличаться в зависимости от типа образца и характера того, что вы хотите отделить и / или проанализировать.

Существует первый критерий классификации, основанный на цели или цели его реализации: препаративное центрифугирование и аналитическое центрифугирование..

Препаративное центрифугирование

Он получает это название, когда центрифугирование используется главным образом для выделения или разделения молекул, частиц, фрагментов клеток или клеток для последующего использования или анализа. Количество образца, которое обычно используется для этой цели, относительно велико..

Аналитическое центрифугирование

Аналитическое центрифугирование проводится с целью измерения или анализа физических свойств, таких как коэффициент осаждения и молекулярная масса осажденных частиц..

Центрифугирование, основанное на этой цели, может быть выполнено путем применения различных стандартизированных условий; как это имеет место, например, с одним из аналитических методов ультрацентрифугирования, который позволяет анализировать молекулы или частицы, которые отделяются, даже когда происходит седиментация.

В некоторых особых случаях может потребоваться использование кварцевых центрифужных пробирок. Таким образом, они позволяют пропускать видимый и ультрафиолетовый свет, поскольку во время процесса центрифугирования молекулы наблюдаются и анализируются с помощью оптической системы..

Точно, существуют другие критерии классификации в зависимости от характеристик или условий, в которых выполняется процесс центрифугирования. К ним относятся: дифференциальное центрифугирование, зональное или ленточное центрифугирование и изопикническое или равновесное седиментационное центрифугирование.

Дифференциальное центрифугирование

Этот тип центрифугирования состоит в том, что образец подвергают центрифугированию, обычно с угловым ротором, в течение определенного времени и скорости..

Он основан на разделении частиц по разнице в скорости оседания, которая напрямую связана с их размерами. Те с большим размером и большим S, осадок в нижней части трубы; в то время как те, которые меньше, останутся приостановленными.

Взвешенное отделение осадка является жизненно важным в этом типе центрифугирования. Взвешенные частицы должны быть декантированы или удалены из пробирки, чтобы гранула или гранула могли быть суспендированы в другом растворителе для дальнейшей очистки; то есть снова центрифугируется.

Этот тип техники бесполезен для разделения молекул. Вместо этого его можно использовать для отделения, например, клеточных органелл от клеток, среди других частиц..

Зональное или ленточное центрифугирование

Зональное или полосовое центрифугирование выполняет разделение компонентов образца на основе разницы S при прохождении среды с предварительно сформированным градиентом плотности; как Ficoll, или сахароза, например.

Образец помещается поверх градиента пробирки. Затем он переходит к центрифуге на высокой скорости, и происходит разделение на разные полосы, расположенные вдоль среды (как если бы это был желатин с несколькими слоями).

Частицы с более низким значением S находятся в начале среды, в то время как частицы, которые больше или имеют более высокое значение S, направлены к нижней части трубки..

С помощью этой процедуры компоненты, обнаруженные в разных полосах седиментации, могут быть разделены. Важно хорошо контролировать время, чтобы не допустить оседания всех молекул или частиц в образце на дне пробирки..

Изопикническое центрифугирование и другие виды

-Существует много других типов центрифугирования, таких как изопикник. Это специализируется на разделении макромолекул, даже если они одного типа. ДНК очень хорошо вписывается в этот тип макромолекул, так как она представляет вариации в последовательностях и количестве ее азотистых оснований; и, следовательно, осадок на разных скоростях.

-Существует также ультрацентрифугирование, посредством которого изучаются седиментационные характеристики биомолекул, процесс, который можно контролировать, например, с помощью ультрафиолетового излучения..

Это было полезно в знании субклеточных структур или органелл. Это также позволило прогресс в молекулярной биологии и разработке полимеров.

приложений

Есть бесчисленное множество областей ежедневной работы, в которых используются различные виды центрифугирования. Они служат для здравоохранения, в биоаналитических лабораториях, в фармацевтической промышленности и других областях. Однако его важность можно суммировать в двух словах: разделить и охарактеризовать.

Отделяет частицы

В химии различные методы центрифугирования были чрезвычайно важны по многим причинам..

Это позволяет разделить две молекулы или смешивающиеся частицы. Помогает устранить примеси, вещества или нежелательные частицы в образце; например, образец, в котором желательно сохранить только белки.

В биологическом образце, таком как кровь, плазма может быть отделена от клеточного компонента центрифугированием. Это способствует реализации различных типов биохимических или иммунологических тестов в плазме или сыворотке, а также для рутинных или специальных исследований..

Даже центрифугирование позволяет разделить клетки разных типов. Например, из образца крови можно отделить эритроциты от лейкоцитов или лейкоцитов, а также от тромбоцитов.

Такую же полезность можно получить с помощью центрифугирования в любой биологической жидкости: моче, спинномозговой жидкости, амниотической жидкости и многих других. Таким образом, может быть проведен большой анализ.

Как метод характеристики

Это также позволило изучить или проанализировать характеристики или гидродинамические свойства многих молекул; в основном из сложных молекул или макромолекул.

А также многочисленные макромолекулы, такие как нуклеиновые кислоты. Это даже облегчило характеристику деталей подтипов той же молекулы, что и РНК, среди многих других приложений.

Примеры центрифугирования

-Благодаря различным методам центрифугирования были достигнуты успехи в точном знании сложных биологических процессов, таких как инфекция и обмен веществ, среди прочего..

-Благодаря центрифугированию выяснены многие ультраструктурные и функциональные аспекты молекул и биомолекул. Среди таких биомолекул могут быть упомянуты белки инсулин и гемоглобин; и с другой стороны, нуклеиновые кислоты (ДНК и РНК).

-При поддержке центрифугирования расширились знания и понимание многих процессов, поддерживающих жизнь. Одним из них является цикл Кребса.

В этой же области применения повлияло знание о молекулах, составляющих дыхательную цепь. Таким образом, проливая свет на понимание сложного процесса окислительного фосфорилирования или истинного клеточного дыхания, среди многих других процессов.

-Наконец, он способствовал изучению различных процессов, таких как инфекционные, позволяя проанализировать путь, по которому идет ДНК, инъецированная фагом (бактериальным вирусом), и белки, которые клетка-хозяин может синтезировать..

Источник