Культивирование микроорганизмов глубинным способом

Глубинный способ культивирования микроорганизмов

Глубинный метод выращивания в промышленных условиях патогенных микроорганизмов впервые был применен Н. Е. Лебедевым в 1950 году. Внедрение его в промышленное производство явилось большим достижением в микробиологии, давшим возможность получить большое количество бактериальной массы за короткое время. С применением интенсивной аэрации скорость размножения микроорганизмов бывает еще выше.

Так, на синтетических средах накопление микроорганизмов бактерий кишечной группы за 14 часов культивирования с применением принудительной аэрации составляет 25 млрд/мл, на мясных средах 50—60 млрд/мл, в то время как при культивировании этих же микробов и на тех же средах без аэрации, то есть в стационарных (состоянии покоя) условиях, количество микробов не превышает 1—2 млрд/мл. Такая большая разница в накоплении биомассы объясняется тем, что при аэрации практически отсутствует начальная стационарная фаза, фаза отрицательного ускорения размножения становится более продолжительной. В условиях аэрации бактерии сразу начинают интенсивно размножаться, переходя в фазу ускоренного размножения и логарифмическую фазу.

Для выращивания микроорганизмов в промышленных условиях в настоящее время применяют реакторы с барбатерами и металлическими мешалками для диспергирования воздуха. Размешиваний питательной среды и ее аэрацию следует рассматривать как единый процесс, так как равномерно аэрировать всю культуральную жидкость в больших емкостях, не прибегая к размешиванию, невозможно.

Значительный интерес представляет вопрос о связи между интенсивностью потребления кислорода микроорганизмами и его содержанием в среде. Известно, что кислород плохо растворяется в воде. Вода при 20° С содержит только 0,0009% кислорода, при 37° С в воде, соприкасающейся с воздухом, содержится 0,0007% кислорода. В связи с этим в питательную среду поступление кислорода должно быть очень интенсивным. Скорость поступления кислорода в любую часть культуральной жидкости должна быть не менее скорости его потребления. В противном случае произойдет местное или временное обеднение среды кислородом, что вызовет повреждение микробных клеток.

Глубинный способ культивирования в биопромышленности является основным при производстве большинства биопрепаратов. Он осуществляется, как правило, в реакторах (ферментерах) большой емкости. Их подразделяют на две группы: по конструкции и по принципу перемешивания культуральной жидкости

Рис. 2.3.1.Упрощенные схемы биореакторов различных типов:

А — реактор с механическим перемешиванием; Б — барботажная колонна; В — эрлифтный реактор с внутренней циркуляцией; Г — лифтный реактор с внешней циркуляцией. Стрелки указывают направление потока культуральной среды

В биореакторах, относящихся к первой группе,перемешивание клеток происходит путем аэрирования воздухом. Это барботажный тип биореактора, при котором процесс перемешивания суспензии осуществляется поднимающимися пузырьками воздуха. В случае барботажных биореакторов обычно получают хорошие ростовые характеристики для большого числа клеточных культур. Однако сложность поддержания суспензии в гомогенном состоянии при высоких концентрациях биомассы клеток сужает сферу их применения.

Несколько больших значений максимальной концентрации клеточной биомассы можно достичь при применении эрлифтных биореакторов, в которых создаются направленные циркуляционные потоки.

В эрлифтных биореакторах перемешивание суспензии осуществляется за счет применения специальной конструкции, создающей градиент плотности (как правило, это конструкция с внутренним цилиндром).

Вторая группа биореакторов представляет собой аппараты с применением механических перемешивающих устройств. Биореакторы этого типа позволяют изучать растительные клеточные популяции в очень широком диапазоне концентраций биомассы клеток. Вместе с тем стрессовое воздействие перемешивающего устройства на клеточную популяцию часто ограничивает их применение.

Технологический процесс глубинного выращивания микроорганизмов в реакторах складывается из следующих этапов:

1) подготовка реактора к посеву;

2) отбор штаммов микроорганизмов и работа с ними;

3) приготовление матровой культуры для засева питательной среды;

4) посев матровой культуры в реактор с питательной средой для получения производственной расплодки микроорганизмов;

5) выращивание микроорганизмов и контроль за ходом процесса культивирования.

При глубинном выращивании микроорганизмов их культуры могут находиться в периодических и хемостатных (непрерывных) системах.

Периодическая система

Периодической системой культивирования называют систему, в которой после внесения бактерий (засева) в питательную среду не производится ни добавления, ни удаления каких-либо компонентов, кроме газовой фазы. Отсюда следует, что периодическая система может поддерживать размножение клеток в течение ограниченного времени, на протяжении которого состав питательной среды изменяется от благоприятного (оптимального) для их роста до неблагоприятного, вплоть до полного прекращения процесса размножения.

Рост в такой «закрытой системе» подчиняется определенным закономерностям. Общую закономерность роста и размножения бактериальной популяции принято показывать графически в виде кривой, отражающей зависимость логарифма числа живых клеток от времени культивирования.

Типичная кривая (рис. 2.3.2.) имеет S-обзразную форму и позволяет различать несколько фаз роста, сменяющих друг друга в определенной последовательности: начальную (или лаг-)фазу, экспоненциальную (или логарифметическую, лог-)фазу, стационарную и фазу отмирания.

Рис. 2.3.2. График фаз роста бактерий

Начальная фаза. Эта фаза охватывает промежуток времени между инокуляцией (момент посева) и достижением максимальной скорости деления микробов. Продолжительность этой фазы зависит главным образом от предшествующих условий культивирования и возраста инокулята,а так же от степени пригодности питательной среды для роста данного микроба. Если инокулят взят из старой культуры, то клеткам приходится сначала адаптироваться к новым условиям путем синтеза РНК, образования рибосом и синтеза ферментов. Если источники энергии и углерода в новой среде отличаются от таковых предшествующей культуры, приспособление к новым условиям может быть связано с синтезом новых ферментов, которые ранее не были нужны и поэтому не синтезировались. Образование новых ферментов индуцируется новым субстратом.

Экспоненциальная фаза, или фаза логарифмического роста характеризируется постоянной максимальной скоростью деления клеток.

Период генерализации (лат. Generatio – рождение, воспроизведение) – это время между двумя последовательными делениями бактерий – в этой стадии будет постоянным для данного вида, а количество бактерий будет увеличиваться в геометрической прогрессии.

Следовательно, после “n” генерации количество клеток в культуре будет равно “2n”. Длительность лог-фазы – обычно 5-6 часов.

Величина клеток и количество содержания в них белка у многих бактерий в лог-фазе то же остаются постоянными и в целом микробная популяция состоит из «стандартных клеток». Если увеличение биомассы бактерий, включая белки, РНК, липиды и другие макромолекулы, происходит пропорционально увеличение численности бактериальных клеток, то такое состояние определяют понятием «сбалансированный рост». Поэтому за ростом культуры в стадии «сбалансированного роста» лог-фазы можно следить, пользуясь каким-нибудь одним из этих показателей.

За стадией сбалансированного роста уже в лог-фазе наступает стадия отрицательного ускорения, при которой скорость размножения бактерий перестает быть максимальной. В результате число делящихся особей – уменьшается, а число погибших – увеличивается. Ее длительность около 2-х часов. Причина замедления размножения: истощение питательной среды, накопление продуктов метаболизма, увеличение плотности клеточной суспензии и мн.др.

В связи с тем, что в экспоненциальной фазе скорость деления клеток относительно постоянна, эта фаза наиболее удобна для определения скорости деления (и скорости роста).

Стационарная фаза максимума. В ней число новых живых бактерий почти равно числу отмерших (равновесие). Переход от лог-фазы к стационарной происходит постепенно. Причины замедления роста нами обозначены при описании стадии отрицательного ускорения (нехватка питательной среды, большая плотность бактериальной популяции, низкое порциальное давление О₂, накопление токсических продуктов обмена). Все эти факторы вызывают переход к стационарной фазе.

Но и в стационарной фазе могут еще происходить такие процессы, как использование запасных веществ, распад части рибосом и синтез ферментов. Наблюдаемая картина зависит от того, какой именно фактор лимитирует рост.

Быстро гибнут лишь очень чувствительные клетки, другие – еще долго сохраняют жизнеспособность – до тех пор, пока еще есть возможность получать необходимую для этого энергию в процессе окисления каких-либо запасных веществ или клеточных белков. Количество биомассы, достигнутое в стационарной фазе, называют выходом или урожаем. Урожай зависит от природы и количества используемых питательных веществ, а так же от условий культивировании.

Фаза отмирания. В этой фазе можно выделить три стадии:

а) стадия ускорения, гибели, характеризующаяся превышением числа отмирающих клеток над количеством вновь образующихся (около 3 часов);

б) стадия логарифметической гибели – отмирание клеток происходит с постоянной скоростью ( 5 часов);

в) стадия уменьшения скорости отмирании, во время которой оставшиеся в живых клетки переходят в стадию покоя.

Одновременно с ростом биомассы одних клеток, происходит увеличение числа клеток в популяции за счет деления других и постоянная утилизация субстратов питательной среды. Такой рост возможен лишь в том случае, если питательная среда сбалансирована по всем компонентам, необходимым бактериальной клетке для роста и размножения.

Следовательно, нелимитированность питательной среды по какому-либо питательному компоненту – одно из основных обязательных условий максимального роста микробной популяции.

Если же питательная среда лимитирована по какому-либо питательному компоненту, то скорость роста замедляется вплоть до полной остановки роста после полной утилизации этого компонента. Иногда в комплексной питательной среде бактериальные клетки используют имеющиеся субстраты последовательно. Это происходит тогда, когда присутствие одного субстрата в среде приводит к подавлению синтеза фермента, участвующего в метаболизме других питательных веществ.

В этих условиях «подавляемые» ферменты начинают синтезироваться и осуществлять метаболизм лишь тогда, когда ингибирующий (подавляющий) их субстрат будет израсходован бактериальными клетками. Такая регуляция физиологии бактерий концентрацией питательных веществ в субстрате приводит к изменениям в скорости роста, а следовательно, и в кривой роста, на которой появляется одна или несколько переходных (т.е. временных) стационарных фаз.

Преимущества периодических систем:

— малая стоимость аппарата и системы управления;

— гибкость, т. е. возможность наработки в одном биореакторе разных продуктов;

— время культивирования можно произвольно менять;

— процесс менее подвержен инфицированию, мутациям ток вследствие отсутствия протока и притока из-за относительно малого времени ферментации;

— процесс удобен для получения малых количеств продукта;

— условия культивирования можно поддерживать в оптимуме как в фазе роста биомассы, так и в фазе биосинтеза продукта, причем оптимальные условия для биомассы и продукта могут быть различны;

— процесс удобен для реализации биосинтеза вторичных метаболитов.

Недостатки:

— необходимость приготовления посевного материала

— велико непродуктивное время ферментации;

— в связи с частой стерилизацией быстрее изнашиваются измерительные приборы, особенно датчики величины рН.

— производительность по биомассе и продукту часто ниже, чем при непрерывном процессе

Непрерывная система

Проточное (непрерывное) культивирование характеризуется постоянным добавлением в биореактор свежей питательной среды и постоянным отбором либо суспензии (открытое проточное культивирование), либо отработанной среды (закрытое проточное культивирование). В непрерывных процессах биообъект постоянно поддерживается в экспоненциальной фазе роста. Непрерывная культура представляет собой открытую систему, стремящуюся к установлению динамического равновесия.

Для микроорганизмов создаются неизменные условия среды. Проточное культивирование конструктивно более сложно и поддерживается автоматическим регулированием, так как связано с включением в схему биореактора дополнительных устройств перистальтических насосов, разделительных устройств и др.

Принцип непрерывного (проточного) культивирования микробов состоит в том, что в сосуд, где размножаются микроорганизмы, непрерывно подается свежая питательная среда и одновременно втекает такой же объем культуры. По такому принципу организуются две разновидности технического процесса непрерывного культивирования: процесс (технология) полного вытеснения и технология полного смещения.

Источник

Способы культивирования микроорганизмов.

Культивирование микроорганизмов можно поводить поверхностным или глубинным, периодическим или непрерывным методами, в аэробных или анаэробных условиях. Большое значение при выборе способа культивирования имеет отношение выбранного культивируемого микроорганизма к молекулярному кислороду и конечная цель культивировании, которой может быть либо накопление биомассы клеток, либо получение определенного метаболита (спирта, кислорода, фермента и т.д.). настоящем Здесь мы рассмотрим, в основном методы, используемые в технологии пищевых и микробиологических производств с использованием аэробных микроорганизмов.

Поверхностное культивирование. При поверхностном культивировании микроорганизмы развиваются на поверхности питательной среды. Среды могут быть плотными, сыпучими или представлять собой тонкий слой жидкой среды. Практически метод применим только для культивирования аэробных микроорганизмов. В этом случае микроорганизмы получают кислород непосредственно из воздуха. Важным условием реализации метода является большая площадь соприкосновения поверхности питательной среды с окружающим воздухом. В жидких средах аэробные микроорганизмы часто растут, образуя на поверхности пленку. Факультативные анаэробы развиваются не только на поверхности, но и в толще жидкой среды, вызывая более или менее равномерное ее помутнение.

Этим методом ранее в промышленных масштабах получали лимонную кислоту и некоторые ферментные препараты для собственных нужд на заводах малой мощности. В настоящее время в промышленности его почти не применяют и подобная технология считается устаревшей. Поверхностное культивирование микроорганизмов используют в основном, в лабораторной практике в научных исследованиях и в музеях чистых культур.

Глубинное культивирование. Глубинный метод культивирования является более совершенным по сравнению с поверхностным. При этом микроорганизмы растут и развиваются во всем объеме питательной среды, а не только на ее поверхности. Осуществляют его, применяя жидкие питательные среды. Метод можно использовать как при культивировании аэробов, так и анаэробов.

Совокупность остатков питательной среды, растущих в ней микроорганизмов и продуктов их жизнедеятельности, образующихся при глубинном культивировании, называется культуральной жидкостью.

При культивировании аэробных микроорганизмов необходимо обеспечить большую поверхность соприкосновения питательной среды с кислородом воздуха, так как при глубинном культивировании в жидких средах микроорганизмы используют растворенный в среде кислород. Вместе с тем растворимость кислорода в воде невелика, поэтому для обеспечения роста аэробных микроорганизмов в толще среды, ее необходимо постоянно аэрировать — подводить кислород во всю толщу жидкой среды. В результате питательная среда насыщается кислородом воздуха и создаются благоприятные условия для развития аэробов.

В лабораторной практике способ глубинного культивирования реализуется путем использования специальных установок – качалок, обеспечивающих встряхивание или вращение колб и пробирок со скоростью 100-200 об/мин и более. Чем больше скорость вращения, тем больше поверхность соприкосновения среды с воздухом и выше насыщение ее кислородом. Помимо перемешивания, аэрировать питательную среду можно продуванием (барботированием) через ее толщу стерильного воздуха. Этот способ также используется в лабораторных исследованиях, но особенно широкое применение он нашел в промышленной микробиологии, где его применяют при получении микробной биомассы, в производстве антибиотиков, ферментов, витаминов, кислот. В промышленных масштабах глубинное культивирование осуществляют в специальных аппаратах – ферментаторах.

Ферментатор представляет собой цилиндрический аппарат сосферическими крышкой и днищем, снабженный мешалкой, отбойниками и устройством для диспергирования стерильного воздуха – барботером. Снаружи ферментатор снабжен рубашкой, в которую подается теплоноситель (обычно это вода) для поддержания в ферментаторе необходимой температуры. Иногда с этой же целью внутри ферментатора устанавливают змеевик.

Глубинное культивирование имеет ряд преимуществ по отношению к поверхностному:

— улучшаются санитарно-гигиенические условия труда;

— сокращаются производственные площади;

— появляется возможность автоматизации технологического процесса;

— удобство выделения целевого продукта из культуральной жидкости;

— возможность осуществления процесса непрерывного культивирования.

Периодическое культивирование. Глубинное культивирование микроорганизмов может быть периодическим и непрерывным.

При периодическом режиме культивирования весь объем питательной среды засевают посевной культурой, и выращивание ведут в оптимальных условиях определенный период времени до накопления нужного количества целевого продукта.

При таком режиме в течение всего периода культивирования непрерывно изменяется скорость роста культуры, ее физиолого-биохимические и морфологические показатели.

В связи с этим культура в своем развитии проходит несколько фаз роста и размножения, из которых можно выделить четыре основных (рис. 4.2).

g N