Криоконсервация и хранение клеток в криобанке
Известны два принципиально различных типа сохранения биологических продуктов – криопрезервация (замораживание) и лиофилизация (высушивание в вакууме). В настоящее время доказано, что замораживание является более эффективным способом хранения любого биологического объекта.
Усилия биотехнологов должны быть направлены на то, чтобы процессы замораживания-хранения-размораживания не привели к гибели, механическому повреждению и, что не менее важно, утрате клетками основных функциональных свойств. Дело в том, что при воздействии низких температур, обменные процессы, происходящие в клетке, практически полностью останавливаются. Клетка как бы замирает до лучших времен. К сожалению, при замораживании из внутриклеточной воды образуются кристаллы льда, которые своими острыми гранями повреждают внутриклеточные мембраны. Поэтому на подготовительном этапе к клеткам добавляют специальные вещества – криопротекторы, которые способствуют при замораживании формированию кристаллов льда гораздо меньших размеров, не способных повредить внутриклеточные мембраны.
Непосредственно процесс замораживания также является сложной процедурой, которая производится в течении нескольких часов по специальным компьютерным программам, учитывающим тип и количество клеток, а также физико-химические особенности используемого криопротектора. Разработанные программы позволяют максимально сохранно заморозить любой тип клеток, как незрелых (стволовых), так и зрелых (высокоспециализированных, дифференцированных). МЦБ «Биомедстэм» для этих целей использует современный программный замораживатель с набором индивидуальных программ IceCube 1810 Computer Freezer. Постепенное снижение температуры до -196 0 С (температура жидкого азота) позволяет без ущерба для клеток перенести биологический продукт в криобанк для долговременного хранения.
В случае необходимости биологический продукт после предварительной заморозки может длительное время сохраняться в криобанке. Хранение происходит в специальных ёмкостях (сосудах Дьюара) в жидком азоте или его парах. Сверхнизкие температуры позволяют гарантированно сохранять замороженные клетки в течение практически неограниченного срока.
Работу криобанка обеспечивает специально подготовленный технический персонал, задачей которого является постоянное пополнение жидкого азота. Ёмкости для хранения снабжены автоматической системой сигнализации, позволяющей чётко контролировать уровень азота и время его пополнения. Каждый из образцов хранится в специальных ёмкостях – криопробирках или криофлаконах. Они изготовлены из инертного пластика, способного выдерживать температуру жидкого азота.
Для большей надёжности криопробирки в стерильных и герметичных условиях запаивают в криопакеты. Криопробирки и криопакеты маркируют индивидуальным кодом. Перед погружением в сосуд Дьюара эту двойную упаковку помещают в коробку из специального картона; коробки располагаются на полочках металлических штативов, которые можно по одиночке извлечь из сосуда. Таким образом, многократная система маркировки и чётко разработанная схема расположения конкретного образца в ячейке и полке в конечном итоге определяет четырёхкратный уровень защиты от «перепутывания» образцов.
Источник
FAQ — Криосохранение
Несмотря на то, что лед занимает на 9% больше объема, чем вода, она в результате осмотических процессов вытесняется из клетки во время замораживания, так как самые сильные затравочные кристаллы (частицы, вокруг которых вода кристаллизуется в лед) находятся вне клеток, а не внутри них. Процесс замораживания в межклеточном пространстве вызывает осмотическое движение воды из клеток, и они сжимаются, а не разрываются. Лед даже не образует острые кристаллы – повреждение вызывается механическим сдавливанием и повышенной концентрацией ионов в оставшейся жидкой фазе.
Крионисты используют криопротекторы (антифризные смеси) для уменьшения формирования льда. В действительности, витрификация полностью устраняет образование льда. Даже если произошло замораживание тканей пациента, повреждение вовсе не означает непоправимое разрушение, так как нанотехнологии будущего смогут исправить их. Для дальнейшего ознакомления с технологией витрификации, см. статьи Vitrification in Cryonics, Physical Parameters of Cooling in Cryonics и Lessons for Cryonics from Metallurgy and Ceramics.
После остановки сердца и констатации смерти важно быстро охладить тело пациента, оказать кардио-пульмональную поддержку (CPS), ввести препараты для предотвращения свертывания крови и сокращения ишемии, провести вымывание крови и перфузию с использованием криопротекторных смесей и охладить тело до криогенных (ниже -130°C) температур. Для более подробного ознакомления с процедурами, см. Cryonics Protocol − A Summary.
Радиация порождает свободные радикалы (молекулы с неспаренными электронами), которые повреждают обычные биологические молекулы. Молекулярная подвижность весьма незначительна при криогенных температурах, поэтому, когда возникают свободные радикалы, они не могут двигаться настолько интенсивно, чтобы вызвать сильные повреждения. Таким образом, криопациенты не нуждаются в свинцовой защите.
Если наука будущего сможет устранять повреждения вследствие замораживания и другие виды повреждений – в том числе вызванные болезнями и старением – она по всей вероятности также сможет и выращивать новые усовершенствованные тела. Криосохранение головы намного дешевле, чем целого тела, поэтому существует экономический стимул для нейросохранения. Кроме того, головы можно охлаждать и подвергать перфузии гораздо быстрее, чем целые тела и они, соответственно, витрифицируются гораздо легче, что обеспечивает лучшее криосохранение.
Однако многие люди считают, что их тела содержат информацию, которую им не хотелось бы терять. Если наука будущего сможет с помощью каких-либо изощренных технологий расшифровывать эту информацию, это может привести к тому, что мозг будет передавать эту информацию телу, где она будет запечатлеваться, как, например, отпечаток ноги на песке, и эта информация может быть утеряна, если реконструкция личности, сохраняющейся в мозге пациента, не будет произведена надлежащим образом. Тем не менее, нейроконсервация может произвести мрачное впечатление на родственников пациента и юристов, чья поддержка в этом деле очень важна. Если технологии временного прекращения жизненных функций будут развиваться быстрее, чем нанотехнология, сохранение всего тела может способствовать быстрейшему оживлению.
Это маловероятно. Криопаценты обычно хранятся в «термосах» с жидким азотом (дьюарах или криостатах), а не в электрических охладителях. Жидкий азот испаряется неделями, а всегда имеются в наличии запасы этого вещества. Конечно, нарушение энергоснабжения в течение нескольких месяцев или лет может создать серьезные проблемы, но в распоряжении специалистов будет много времени, чтобы найти решение этих проблем. Не было случаев, чтобы криопациент был разморожен в результате перебоев в энергопитании, а один пациент находится в состоянии и криосохранения с 1967.
Это дополнительная защитная мера. Голова пациентов, чьи тела сохраняются целиком, размещается в самой нижней позиции, чтобы в случае сильного испарения жидкого азота голова была последней частью тела, которая может оттаять.
Несмотря на то, что электрическая активность мозга прекращается при остановке обмена веществ при низких температурах, это не должно вызывать повреждений структур мозга или его функциональных характеристик. Люди, находящиеся под воздействием барбитуратов или в процессе хирургической операции с применением криогенных температур, не показывали признаков электрической активности мозга, но тем не менее, не лишились личности или памяти. Несмотря на то, что может произойти потеря непосредственной (кратковременной) памяти, существует достаточно причин полагать, что личность человека и долгосрочная память закодированы в синапсах и межнейронных связях, которые сохраняться при крионировании. (Более подробную информацию по этой проблеме и связанным с ней темам вы можете найти в статьях Neurophysiology and Mental Function и An Overview of Neural Networks.)
Это не так. Первоначальные повреждения возникают в результате ишемии (нарушении кровообращения, что приводит к недостаточному снабжению питательными веществами и кислородом) и реперфузии (восстановления кровообращения), в результате которых страдают кровеносные сосуды, причем основные повреждения наносятся реперфузией, а не ишемией. При низких температурах мозг может выдерживать гораздо более продолжительные периоды ишемии без каких-либо повреждений – даже для кровеносных сосудов.
При комнатной температуре клетки мозга могут существовать в течение многих часов, не умирая – хоты может начаться пока неподвластный современной медицине процесс саморазрушения (апоптоз), который обычно длится много часов или дней до окончательного завершения. Этот процесс саморазрушения может быть в значительной степени замедлен при понижении температуры и может быть остановлен, когда крионисты восстанавливают кровообращение после юридической смерти пациента. Процесс апоптоза, который в настоящее время нельзя повернуть вспять с помощью существующих технологий, в будущем вполне может быть сделан обратимым с использованием молекулярной медицины. (Более подробную информацию по этой теме вы можете найти в статье Minimizing Ischemic Damage to Cryonics Patients.)
Для успешной витрификации требуется быстрое охлаждение. Целое тело обладает большим количеством тепла, чем голова, и, таким образом, его труднее быстро охладить для качественной витрификации.
До сих пор охлаждение витрифицированных тканей до температур намного ниже температуры, при которой криопротекторы переходят в стеклообразное состояние (около -130°C) приводило к растрескиванию в результате термического стресса (температура жидкого азота — -196°C). Возможно, будут найдены пути устранения этого растрескивания, однако, исследования в области крионики в основном сосредотачиваются на разработке методов экономичного хранения пациентов при температуре около -130°C. При этом возникает меньше трещин и их легче устранить по сравнению с повреждениями, наносимыми кристаллами льда, поэтому даже при хранении при температуре жидкого азота предпочтительна витрификация.
Несмотря на то, что с помощью витрификации можно избежать формирования кристаллов льда, криоконсервация все еще влечет за собой биохимические и прочие виды повреждений, что осложняет дальнейшее размораживание и возвращение всех жизненных функций.
21st Century Medicine (21CM) в настоящее время проводит работу по обратимой криоконсервации почек. 21CM удалось провести успешное криосохранение почек кролика при температуре -135°C с дальнейшей пересадкой этих почек кроликам при полном восстановлении функций. Если ту же процедуру удастся применить к другим органам и, в конечном итоге, ко всему организму, временная приостановка жизнедеятельности станет реальностью.
В штате Института крионики ( Cryonics Institute (CI)) имеется криобиолог, основной задачей которого является разработка технологий витрификации и их применение при крионировании пациентов. Suspended Animation, Inc. также имеет исследовательскую программу, посвященную улучшению методов криосохранения и витрификации всего тела пациента. Даже когда удастся провести успешное криосохранение почек и мозга, применение этой процедуры в отношении всего тела потребует обратимой криоконсервации всех органов — включая кости и глазные яблоки. Что касается костей, это будет несложно осуществить, так как там, где нет воды, не формируются вызывающие повреждения кристаллы льда.
В июле 2005 на конференции Общества криобиологии (Society for Cryobiology) было заявлено, что 21st Century Medicine удалось провести полную витрификацию почки кролика до твердого состояния при температуре -135ºC, которая потом была разморожена и пересажена кролику с полным восстановлением функций. Вероятность того, что это удастся проделать в отношении мозга млекопитающих, очень велика. Несмотря на то, что пока не удалось целиком заморозить млекопитающее при криогенных температурах, а потом оживить его, наука упорно развивается в этом направлении.
Нанотехнология будущего с использованием механизмов размером с молекул сможет устранять повреждения, вызванные замораживанием, а также болезнями и старением. Подобные возможности устранения повреждений подробно описаны в книге ENGINES OF CREATION, автором которой является K. Eric Drexler.
Витрификация значительно облегчает работу по устранению повреждений. А при создании технологии временного приостановления жизненных функций наномедицине (nanomedicine) придется лишь устранять повреждения вследствие болезней и старения.
К 2018 г. в криохранилищах находились 383 криопациента Из них 58 человек было крионировано в нашей компании «КриоРус», остальные хранятся в Соединенных Штатах: в «Алькоре» (Alcor) — 158, в «Институте крионики» (The Cryonics Institute), — 160, а пятеро — в Trans Time. Также известно, что мозг крионированного в 2016 году испанского криониста Ксавье Руиса хранится в Дрездене и еще один — в Бразилии.
В большинстве случаев, хорошие кандидаты в доноры органов не являются потенциальными криопациентами, а большинство потенциальных криопациентов не являются хорошими кандидатами в доноры органов. Донором органов может быть лишь человек, мозг которого «умер» в результате травмы, полученной, например, в результате автомобильной аварии. Доноры органов предпочтительно должны быть молодыми и органы ни в коем случае не принимаются от пожилых людей. Средний возраст смерти в большинстве западных стран выше возраста, приемлемого для донорства органов. Люди, умирающие рака, заразных или аутоиммунных болезней не могут быть донорами органов. Почти все криопациенты могут быть отклонены в качестве доноров органов из-за причины смерти или возраста.
Вероятность того, что крионирование будет успешным, в большой степени зависит от условий, в которых проводилось криосохранение. В редких случаях удалось провести охлаждение и кардио-пульмональную поддержку сразу после объявления смерти, а также качественную перфузию, обеспечивающую витрификацию мозга. Некоторые пациенты были обнаружены через несколько дней после смерти в результате остановки сердца и были заморожены без перфузии с использованием криопротекторов.
В среднем, криоконсервации, проведенные в этом году, технически совершеннее, чем те, которые проводились год назад, так как технологии криоконсервации постоянно улучшаются. Чем выше качество сохранения, тем больше шансов на оживление. Оценка вероятности появления технологии оживления в будущем – это всего лишь догадки, хотя технология устранения повреждений на молекулярном уровне уже сейчас представляется вполне реальной.
Способность криофирмы решать правовые, политические, финансовые и социоэкономические проблемы также следует учитывать при оценке шансов на успех. Оценку вероятности успеха крионики можно сравнит с попытками оценить вероятность погибнуть в автомобильной аварии, ничего не предпринимая для разработки более безопасных автомобилей, их покупки и соблюдения правил безопасной езды.
Вероятность того, будет ли крионирование успешным для пациента просто-напросто зависит от того, насколько хорошо этот человек подготовит условия для оптимальной криконсервации. Вместо того, чтобы пытаться оценить вероятность успеха, человеку следует понять, что подготовительная работа с целью предотвращения потенциальных проблем в значительной степени может увеличить шансы на успешное криосохранение для него и его любимых.
Вероятность успеха очень сильно зависит от того, сколько денежных средств и усилий вкладывается в развитие технологий и улучшение организации, что также может способствовать повышению эффективности крионики. Вложение денежных средств в деятельность криофирм с целью их усиления и проведения научных исследований в этой области, идет на пользу всем крионистам, а не только тем, кто вкладывает деньги. Многие предпочтут откладывать последние деньги, не потраченные на криоконсервацию, для создания доверительного фонда для будущего оживления. Если все будут действовать так, качество криосохранения и возможности криофирм будут намного ниже, чем если бы они избрали другой подход.
Возможно, что технология настоящей обратимой криоконсервации («временное прекращение жизненных функций») может быть усовершенствована в течение последующих 30 лет. В этом случае оживление пациентов, сохраненных с помощью этой передовой технологии криоконсервации, может происходить в любое время. Крионика будет придерживаться принципа LIFO – «последним пришел, первым вышел». Криопациенты, сохраняемые в плохих условиях с использованием примитивных криопротекторов (глицерола, а не витрификационного криопротектора), будут оживлены последними, если вообще это произойдет.
Большинство крионистов считают, что оживление тех, кто был крионирован сейчас, станет возможным через 50 – 100. Тогда можно будет лечить практически все болезни и пожилые люди, возможно, смогут пройти процедуру омоложения. Устранение повреждений, вызванных замораживанием и токсическим действием криопротекторов, скорее всего, также станет возможным. Конечно, у нас нет магического кристалла, позволяющего видеть будущее, но эти предположения представляются весьма вероятными для большинства хорошо информированных крионистов.
Майк Дарвин (Mike Darwin) составил наиболее подробное описание этих случаев. Часть этого описания (за 1994 г.) можно найти в Cryonet Archives: Part I, Part II, иPart III. В библиотеке на web-сайте Alcor есть раздел, посвященный отчетам: Alcor Case Reports. Там также есть перечень случаев криоконсервации: Complete List of Alcor Cryopreservations. На web-сайте Института крионики есть раздел, где представлены отчеты: Cryonics Institute Case Reports. Менее профессиональное изложение, почти полностью представленное канадскими любителями: The First Cryonics Case in Toronto, Canada.
Источник
