Красители способ окраски по граму

Окрашивание по Граму: методика и теоретическое объяснение

Окрашивание по Граму широко распространено в микробиологии, так как это один из самых простых способов дифференциации бактерий в зависимости от состава их клеточной стенки. По Граму все бактерии можно разделить на грамположительные (Грам(+)) и грамотрицательные (Грам(-)). Метод окрашивания по Граму был разработан в 1884 году, и с того времени не утратил популярности, хотя и неоднократно модифицировался.

Структура клеточной стенки

Окрашивание по Граму позволяет выявить, к грамположительным или грамотрицательным относится та или иная бактерия. Деление бактерий на Грам(+) и Грам(-) осуществляется в соответствие со строением их клеточной стенки.

Клеточная стенка в наибольшем количестве содержит пептидогликан (муреин) — сложное вещество, в состав которого входят пептапептид и гликан. Гликан состоит из чередующихся остатков N-ацетилглюкозамина и N-ацетилмурамовой кислоты, соединенных друг с другом β-1,4-гликозидными связями. Пептидогликан обеспечивает поддержание формы клетки, осмотическую защиту, а также антигенные функции.

Основные различия грамположительных и грамотрицательных бактерий

У различных бактерий толщина слоя пептидогликана не одинакова. У бактерий, которые относят к грамположительным, она составляет от 15 до 80 нм, в то время как у грамотрицательных — от 2 до 8 нм. В то же время у грамотрицательных бактерий под слоем пептидогликана есть особая структура, которой нет у грамположительных бактерий — периплазматическое пространство. Это пространство заполнено гидролитическими ферментами — β-лактамазой, рибонуклеазой 1, фосфатазой. Именно эти ферменты ответственны за резистентность грамотрицательных бактерий в отношении многих антибиотиков.

Слой пептидогликана Грам(-) бактерий связан с липополисахаридом — антигенной структурой, содержащей эндотоксин. У Грам(+) бактерий похожие функции выполняют тейхоевые кислоты.

У грамотрицательных бактерий присутствует дополнительная структура — внешняя мембрана.

Суть метода окрашивания

Перед тем как начать окрашивание, готовят мазки исследуемых бактерий. Для этого на предметное стекло капают воду и бактериальной петлей добавляют туда культуру микроорганизмов. Затем, после полного высыхания воды, мазок фиксируют — предметное стекло проносят несколько раз над пламенем горелки. Окрашивание мазков по Граму более эффективно, чем окрашивание живых бактерий — с мертвыми клетками лучше связываются молекулы красителя.

Окрашивание производится в несколько этапов:

1. На фиксированный мазок накладывают небольшие кусочки фильтровальной бумаги и наливают основной краситель — генцианвиолет или метиленовый синий.
2. Спустя 3-5 минут снимают окрашенную фильтровальную бумагу и заливают мазок раствором Люголя на 1 минуту. При этом препарат темнеет.
3. Сливают раствор Люголя и обрабатывают мазок чистым этиловым спиртом: капают несколько капель на препарат, спустя 20 секунд сливают. Процедуру повторяют 2-3 раза.
4. Промывают стекло с исследуемым препаратом дистиллированной водой.
5. Производят дополнительное окрашивание — докрашивают препарат фуксином. Спустя 1-2 минуты краситель смывают.
6. После высыхания воды изучают мазок под микроскопом. Грамположительные бактерии будут иметь сине-фиолетовый цвет, грамотрицательные — розовый или красный.

Причины различного характера окрашивания

Как было описано выше, при окрашивании бактерий по Граму грамположительные бактерии окрашиваются в сине-фиолетовый цвет, а грамотрицательные — в красный или розовый. Причина дифференциального окрашивания бактерий по этому методу состоит в том, что после попадания в клетку растворимой формы генцианвиолета краситель переходит в нерастворимую йодную форму. Во время обработки бактерии этиловым спиртом под действием этого неполярного растворителя из мембраны экстрагируются липиды. После этого мембрана становится пористой и больше не является существенным препятствием для вымывания красителя. Однако пептидогликан более устойчив к действию неполярных растворителей, в том числе и спирта. Именно он препятствует вымыванию красителя, поэтому бактерии с толстым муреиновым слоем окрашиваются в сине-фиолетовый цвет (грамположительно), и после обработки спиртом свой цвет не меняют.

Тонкий муреиновый слой грамотрицательных бактерий не может удержать в клетке молекулы красителя, поэтому после действия спирта они становятся бесцветными — окрашиваются грамотрицательно.

После воздействия на мазок фуксином при окрашивании по Граму грамположительные бактерии остаются сине-фиолетовыми, а грамотрицательные приобретают розово-красный оттенок.

Примеры Грам(+) и Грам(-) бактерий

К грамотрицательным относятся цианобактерии, серобактерии, железобактерии, хламидии, риккетсии, уксусные бактерии, многие метилобактерии, тионовые бактерии, арсенитобактерии, карбоксидобактерии.

Грамположительными являются бифидобактерии, многие водные бактерии, стрептококки и стафилококки.

Источник

Окраска по Граму

Немного истории

Ганс Кристиан Йоахим Грам (дат. Hans Christian Joachim Gram ; 13 сентября 1853 — 14 ноября 1938) — датский бактериолог. Родился в семье Фредерика Теркеля Юлиуса Грама, профессора юриспруденции и Луизы Кристины Рулунд.

Грам изучал ботанику в Университете Копенгагена и был ассистентом ботаники у зоолога Япетуса Стенструпа. Работа с растениями позволила ему узнать основы фармакологии и научиться пользоваться микроскопом. Он поступил в медицинскую школу в 1878 году и закончил её в 1883.

Между 1878 и 1885 годами Грам путешествовал по Европе. В Берлине, в 1884, он разработал метод разделения двух основных классов бактерий. Эта техника, Метод окраски Грама, продолжает оставаться стандартной процедурой в медицинской микробиологии.

Грам был скромным человеком и в своей первой публикации отметил, «И таким образом я публикую метод, несмотря на то, что знаю что сейчас он имеет недостатки и несовершенен; но я также надеюсь что в руках других исследователей он превратится во что-то полезное.» В настоящее время известно много модификаций окраски по Граму.

Теория

Окраска по Граму основана на различиях в строении клеточной стенки прокариот. Грамположительные бактерии имеют толстую, прочную, просто устроенную стенку (толщина более 50 нм) Основным компонентом клеточной стенки этих бактерий является многослойный пептидогликан (муреин), построенный их остатком N-ацетил мурамовой кислоты. Прочность линейному полимеру придают поперечные тетрапептидные сшивки, соединяющие отдельные слои пептидогликана. С петидогликаном клеточной стенки грамположительных бактерий ковалентно связаны тейхоевые или липотейхоевые кислоты (от греч. teichos — стенка), молекулы которых представляют собой цепи из 8-50 остатков глицерола и рибитола, соединенных фосфатными мостиками. Молекулы тейхоевых кислот являются рецепторами адгезии (адгезинами), специфическими антигенами многих бактерий. С пептидогликаном могут быть связаны белки (А, М, Т, R и др.), которые располагаются снаружи также кластерами. Эти белки являются антифагинами, репелентами фагоцитоза, рецепторами для антител. Смесь S.aureus и E.coli

Грамотрицательные бактерии содержат очень небольшое количество пептидогликана, не имеющего поперечных сшивок. Над слоем муреина располагается периплазматическое пространство, играющее важную роль в обменных процесса (периплазматические ферменты) Далее располагается наружная мембрана, которая имеет строение, характерное для биологических мембран. Внешний листок наружной мембраны содержит липополисахарид (ЛПС), состоящий из трех компонентов: липида А, стержневой (базисной) части, или ядра, и полисахаридной цепи, образованной повторяющимися олигосахаридными последовательностями.

Основной краситель интенсивно связывается муреиновым слоем. Поскольку этот слой у грамотрицательных бактерий очень тонкий и экранируется внешней мембраной, эти микроорганизмы сорбируют значительно меньше красителя, чем грамположительные.

Йод образует с красителем и муреином сложный комплекс, который труднее вымывается обесцвечивающими растворами. Дифференцирующие растворы вымывают весь краситель из клеточной стенки грамотрицательных бактерий, в то время, как грамположительные еще содержат достаточное количество красителя.

Дополнительный краситель докрашивает обесцвеченные грамотрицательные бактерии в контрасный цвет.

Варианты окраски

«Классический» метод

Красители и реактивы

Методика окраски

1. На фиксированный мазок положить кусочек фильтровальной бумаги и нанести с избытком основной краситель (1-2 мин)
2. Слить краситель, промыть препарат водой, нанести раствор Люголя. (1-2 мин)
3. Слить раствор Люголя, препарат поместить в спирт (или налить спирт на препарат). (30-60 сек)
4. Тщательно промыть дистиллированной водой.
5. Докрасить одним из дополнительных красителей. (1-2 мин)
6. Промыть и подсушить препарат

Модификация Hucker

Красители и реактивы

Методика окраски

1. На фиксированный мазок нанести основной краситель (1 мин)
2. Слить краситель, промыть препарат водопроводной водой (не более 2 сек)
3. Поместить препарат в раствор Люголя (1 мин)
4. Промыть водопроводной водой и тщательно высушить
5. Препарат поместить в спирт и обесцвечивать, слегка покачивая. Тщательно высушить
6. Докрасить одним из дополнительных красителей (10 сек)
7. Промыть и подсушить препарат

Модификация Burke

Красители и реактивы

Методика окраски

1. Мазок высушивают на воздухе без нагревания. Не фиксируют
2. Окраска основным красителем. На мазок наливают раствор а и добавляют 2-3 капли раствора b. (2-3 мин)
3. Смывают раствором Люголя. Наливают на мазок раствор Люголя (2 мин или более)
4. Промыть водопроводной водой и осторожно удалить избыток воды фильтровальной бумагой (не сушить)
5. Обесцветить, добавляя по каплям смесь ацетона и эфира до прекращения отхождения красителя (обычно около 10 сек)
6. Препарат высушить на воздухе.
7. Докрасить дополнительным красителем. (5-10 сек)
8. Промыть и подсушить препарат

Модификация Kopeloff-Beerman

Красители и реактивы

Методика окраски

1. Мазок высушивают на воздухе без нагревания. Не фиксируют
2. Окраска основным красителем. Растворы а и b смешивают в соотношении 15:4. Наносят на мазок (5 мин и более)
3. Смывают раствором Люголя. Наливают на мазок раствор Люголя (2 мин или более)
4. Стряхнуть избыток раствора Люголя. Не промывать
5. Обесцветить, добавляя по каплям смесь ацетона и эфира до прекращения отхождения красителя (обычно около 10 сек)
6. Препарат высушить на воздухе.
7. Докрасить дополнительным красителем. (1-2 мин)
8. Промыть и подсушить препарат

Модификация Синева

Красители и реактивы

Методика окраски

1. На фиксированный мазок наложить фильтровальную бумагу с основным красителем. Нанести сверху несколько капель воды (1 мин)
2. Стряхнуть основной краситель. Налить на препарат раствор Люголя. (1 мин)
3. Стряхнуть раствор Люголя. Не промывать
4. Препарат поместить в спирт и обесцвечивать, слегка покачивая (или нанести спирт на мазок).
5. Тщательно промыть дистиллированной водой.
6. На препарат положить фильтровальную бумагу с дополнительным красителем. Нанести несколько капель воды.(1 мин)
7. Промыть и подсушить препарат

Модификация Preston-Morrell (требует редакции)

Красители и реактивы

Методика окраски

1. На фиксированный мазок нанести основной краситель (1 мин)
2. Слить краситель, промыть препарат водопроводной водой (не более 2 сек)
3. Поместить препарат в раствор Люголя (1 мин)
4. Промыть водопроводной водой и тщательно высушить
5. Препарат поместить в спирт и обесцвечивать, слегка покачивая. Тщательно высушить
6. Докрасить одним из дополнительных красителей (10 сек)
7. Промыть и подсушить препарат

Ошибки

Грамположительные бактерии окрасились в красный цвет

Мазок переобесцвечен (самая частая ошибка)

1. Приготовить новый мазок и повторить окраску, уменьшив время обработки обесцвечивающим раствором
2. Просмотреть много полей зрения в испорченном мазке. Иногда удается найти подходящие
3. Если нет возможности приготовить новый мазок, полностью обесцветить имеющийся, тщательно промыть водой, высушить и повторить окраску

Старая культура Окраска по Граму учитывается для суточных культур (для медленно растущих бактерий — через двое-трое суток). При длительном хранении на питательной среде наблюдается дегенарация муреинового слоя. Используйте культуру подходящего возраста Культура выращена в неблагоприятных условиях При выращивании на селективных средах может образовываться слишком тонкий муреиновый слой Культивируйте микроорганизм на полноценной среде Особенности строения клеточной стенки (грамвариабельные бактерии) нет

Грамотрицательные бактерии окрасились в синий цвет

Слишком густой мазок или наличие конгломератов (например, при аутоагглютинации)

Краситель удерживается не клеточной стенкой, а за счет капиллярности пространств между клетками в скоплении

1. Просмотреть много полей зрения, возможно в препарате есть поля зрения с нормальной \»густотой\» мазка
2. Повторить приготовление препарата, взяв меньше культуры и приготовив мазок на большей площади
3. При аутоагглютинации культуры взять для приготовления мазка дистиллированную воду

Мазок плохо обесцвечен

1. Просмотреть много полей зрения, возможно в препарате есть поля зрения с нормальным обесцвечиванием
2. Повторить приготовление препарата и его окраску
3. Дообесцветить имеющийся мазок
4. Проверить правильность приготовления обесцвечивающего раствора. При повторении ошибки — заменить раствор.

Особенности строения клеточной стенки (грамвариабельные бактерии)

Источник

Окрашивание по Граму

В практической бактериологии окрашивание по Граму позволяет быстро определить морфологию бактерий, а также их отношение к красителям. Восприимчивость микроорганизмов к красителям называется «тинкториальные свойства». Эти свойства зависят от состава клеточной стенки и важны для определения дальнейших методов исследования.

Далее в статье вы узнаете о реактивах, используемых при окрашивании по Граму, последовательности их нанесения и значении окрашивания по Граму в систематике бактерий.

1. Реактивы, используемые при окраске по Граму, последовательность их нанесения и механизм воздействия на бактериальную окраску

2. Зависимость различного отношения к окраске по Грамму от различий в химическом составе и строении бактериальных клеток. Понятие о тинкториальных свойствах бактерий

Значение окрашивания по Граму

Окраска по Граму имеет большое значение в систематике бактерий, а также для микробиологической диагностики инфекционных заболеваний.

Кокковые и спороносные формы бактерий, а также дрожжей — грамположительны и окрашиваются в иссиня-черный (темно-синий) цвет, многие неспороносные бактерии — грамотрицательны и окрашиваются в красный цвет, ядра клеток приобретают ярко-красный цвет, цитоплазма — розовый.

Окраска по Граму относится к сложному способу окраски, когда на мазок воздействуют двумя красителями, из которых один является основным, а другой — дополнительным. Кроме красящих веществ при сложных способах окраски применяют обесцвечивающие вещества: спирт, кислоты и др.

Красители, используемые при окрашивании по Граму

Для окраски по Граму чаще используют красители трифенилметановой группы: генциановый, метиловый фиолетовый или кристаллвиолет. Грамположительные Грам (+) микроорганизмы дают прочное соединение с указанными красителями и йодом. При этом они не обесцвечиваются при воздействии на них спиртом, вследствие чего при дополнительной окраске фуксином Грам (+) микроорганизмы не изменяют первоначально принятый фиолетовый цвет.

Грамотрицательные Грам (-) микроорганизмы образуют с основными красителями и йодом легко разрушающееся под действием спирта соединение. В результате микробы обесцвечиваются, и затем окрашиваются фуксином, приобретая красный цвет.

Подготовка материала для окраски по Граму

Исследуемый материал распределяют тонким слоем по поверхности хорошо обезжиренного предметного стекла. Приготовленный мазок высушивают на воздухе и после полного высыхания фиксируют.

Фиксация. При фиксировании мазок закрепляется на поверхности предметного стекла, и поэтому при последующей окраске препарата микробные клетки не смываются. Кроме того, убитые микробные клетки окрашиваются лучше, чем живые.

Различают физический способ фиксации, в основу которого положено воздействие высокой температуры на микробную клетку, и химические способы, предусматривающие применение химических средств, вызывающих коагуляцию белков цитоплазмы.

• Физический способ фиксации:

Предметное стекло с препаратом берут пинцетом или I и II пальцами правой руки за рёбра мазком кверху и плавным движением проводят 2-3 раза над верхней частью пламени горелки. Весь процесс фиксации должен занимать не более 2 секунд.

Надёжность фиксации проверяют следующим приёмом: свободную от мазка поверхность предметного стекла прикладывают к тыльной поверхности левой кисти. При правильном фиксировании мазка стекло должно быть горячим, но не вызывать ощущения ожога (70—80 °С).

• Химический способ фиксации:

Для фиксации мазков применяют метиловый спирт, ацетон, смесь Никифорова (смесь этилового спирта 96 % и наркозного эфира в соотношении 1:1), жидкость Карнуа (этилового спирта 96 % — 60 %, хлороформа 30 %, ледяной уксусной кислоты 10 %). Предметное стекло с высушенным мазком погружают в склянку с фиксирующим веществом на 10-15 минут и затем высушивают на воздухе.

Процесс окрашивания по Граму

1. На фиксированный мазок наливают один из основных красителей на 2—3 минуты. Во избежание осадков окрашивают через фильтровальную бумагу.

2. Сливают краску, аккуратно удаляют фильтровальную бумагу. Мазок заливают на 1—2 мин раствором Люголя или йодистым раствором по Граму (водный раствор йодида калия и кристаллического йода в соотношении 2:1) на 1—2 минуты до почернения препарата.

3. Раствор сливают, мазок прополаскивают 96° этиловым спиртом или ацетоном, наливая и сливая его, пока и мазок не обесцветится и стекающая жидкость не станет чистой (приблизительно 20-40-60 секунд).

4. Тщательно промывают стекла в проточной или дистиллированной воде 1—2 мин.

5. Для выявления грамотрицательной группы бактерий препараты дополнительно окрашивают фуксином или сафранином (2—5 мин).

6. Промывают в проточной воде и высушивают фильтровальной бумагой.

Тинкториальные свойства — свойства бактерий, грибов и простейших, характеризующие их способность вступать в реакцию с красителями (см. Красители) и окрашиваться определенным образом.

Источник