Какими способами окрашивают споры бактерий

33. Простые и сложные методы окраски микроорганизмов. Способы окраски спор, жгутиков, капсул, включений.

Для окрашивания препаратов пользуются кислыми, щелочными и нейтральными анилиновыми красителями. Наиболее широкое применение нашли основной и кислый фуксин, метиленовый синий, генцианвиолет и везувин.

Простой способ окраски мазков производится водным фуксином Пфейффера и метиленовым синим Леффлера. Готовят водный фуксин из фенолового фуксина Циля, разводя его дистиллированной водой в соотношении 1:10. Состав РАСТВОРА ФУКСИНА ЦИЛЯ: основной фуксин – 1 г; спирт этиловый 96 % – 10 мл; фенол кристаллический – 5 г; глицерин – несколько капель; вода дистиллированная – 100 мл.

Метиленовый синий Леффлера готовят, прибавляя к 30 мл насыщенного раствора метиленового синего (10 г метиленового синего в 100 мл 96 % этилового спирта) 1 мл 1% NaOH или KOH и 100 мл дистиллированной воды.

После окрашивания красители сливают, препарат промывают водой и высушивают между листками фильтровальной бумаги. На сухой мазок наносят каплю масла и микроскопируют с использованием иммерсионного объектива оптического микроскопа. Способность микробов воспринимать красители называется тинкториальными свойствами.

При окраске щелочным метиленовым синим по Леффлеру (3–5 мин) гранулы волютина у дифтерийных коринебактерий приобретают темно–синий, а палочка – голубой цвет.

При сложных методах окраски мазков применяют два–три различных по цвету красителя, что позволяет дифференцировать микробы и выявить некоторые нюансы в деталях их строения. К таким методам относят окраску по Граму, Цилю–Нельсену, Нейссеру, Бурри–Гинсу, Романовскому–Гимзе и некоторые другие.

При окраске по НЕЙССЕРУ гранулы ВОЛЮТИНА у дифтерийных коринебактерий окрашиваются в сине–черный, а бактерия – в желтый цвет. Мазок окрашивают: 1) 1 мин уксуснокислым метиленовым синим (метиленовый синий – 0,1 г, спирт – 2 мл, ледяная уксусная кислота – 5 мл, дистиллированная вода – 100 мл); 2) сливают краситель и мазок промывают водой; 3) на 20– 30 с наносят раствор Люголя; 4) 1 –3 мин окрашивают везувином (прокипяченная и отфильтрованная взвесь 2 г везувина в смеси 60 мл спирта и 40 мл дистиллированной воды).

Количественное содержание ПЕПТИДОГЛИКАНА, содержащегося в # стенке, определяет характер окраски бактерий и других прокариот по ГРАМУ. Те из них, которые содержат в клеточной стенке большое его количество (около 90 % пептидогликана), окрашиваются по Граму в сине–фиолетовый цвет и их называют грамположительными, все другие, содержащие в оболочке 5–20 % пептидогликана, – в розовый цвет и их называют грамотрицательными. Толщина слоя пептидогликана в клеточной стенке грамположительных бактерий в несколько раз больше, чем у грамотрицательных. Техника окраски по Граму: 1. Фиксированный мазок 1–2 мин окрашивают раствором генцианвиолета (генцианвиолет – 1 г, этанол 96 % – 10 мл, фенол кристаллический – 2 г, вода дистиллированная – 100 мл; по методу Синева его покрывают пропитанной тем же красителем полоской фильтровальной бумаги, которую смачивают 2–3 каплями воды). 2. Слив генцианвиолет (сняв полоску бумаги Синева), мазок 1 мин обрабатывают раствором Люголя и, не промывая водой, сливают его. 3. Обесцвечивают спиртом в течение 0,5 мин, промывают водой. 4. Окрашивают 1–2 мин фуксином Пфейффера. 5. Мазок ополаскивают водой и высушивают.

Для выявления грамположительных КИСЛОТО– И СПИРТОУСТОЙЧИВЫХ микобактерий туберкулеза и лепры, которые из–за большого количества в клеточных оболочках жировосковых веществ, миколовой кислоты и других оксикислот непроницаемы для разведенных растворов красителей, используют окраску по методу ЦИЛЯ – НИЛЬСЕНА. Окрашивание их по этому способу достигается при помощи концентрированного фенолового фуксина Циля с подогреванием над пламенем горелки до закипания и отхождения паров. Окрашенные с применением термокислотной обработки микобактерии не обесцвечиваются слабыми растворами минеральных кислот и этилового спирта. Техника окраски. 1. Фиксированный мазок покрывают полоской фильтровальной бумаги, на которую наносят фуксин Циля, и несколько раз подогревают над пламенем горелки до появления паров, подливая краситель, далее бумагу снимают и промывают водой. 2. Препарат обрабатывают (обесцвечивают) 5 % раствором серной кислоты и промывают водой. 3. На мазок наливают водно–спиртовой раствор метиленового синего, спустя 3–5 мин промывают водой и высушивают. Кислотоустойчивые бактерии окрашиваются в интенсивно красный цвет, остальные виды микробов, обесцвечивающиеся в процессе обработки препарата кислотой, – в светло–синий.

При необходимости дифференциации возбудителей лепры от микобактерии туберкулеза используют окраску мазков по методу Семеновича–Марциновского – микобактерии лепры окрашиваются в красный цвет, а микобактерии туберкулеза остаются неокрашенными.

Для обнаружения КАПСУЛ бактерий, плохо воспринимающих красители, используют метод БУРРИ–ГИНСА: в каплю туши, разведенной в 10 раз водой, вносят исследуемые бактерии и равномерно распределяют их петлей по предметному стеклу; мазок высушивают, фиксируют (наносят 2–3 капли спирта и сжигают его на стекле), окрашивают в течение 3–5 мин фуксином Пфейффера, промывают водой, высушивают; на темном фоне препарата капсулы видны в виде светлых ореолов вокруг красных бактерий.

О наличии ЖГУТИКОВ чаще всего судят по направленному характеру движения бактерий в раздавленной и висячей каплях. Но можно использовать и некоторые методы окраски, например по МОРОЗОВУ: 1) обработка препарата кислотой, при этом оболочки и жгутики разрыхляются; 2) закрепление разрыхленных структур танином; 3) обработка азотнокислым серебром, оно окутывает каждый жгутик и саму # толстым слоем, давая различные оттенки от жёлтого до тёмно-коричневого.

СПОРЫ. Эндоспоры бактерий выдерживают длительное кипячение, действие горячего воздуха (140–150°С) и химических дезинфицирующих веществ, многие годы сохраняются в почве, на растительности и предметах. Попадая в организм человека и животных, споры патогенных бактерий прорастают в материнские клетки за несколько часов.

Водным фуксином, водно–спиртовым метиленовым синим и по Граму эндоспоры не окрашиваются, так как их плотная многослойная оболочка непроницаема для обычных красителей. В мазках из патологических материалов, культур бацилл и клостридии, окрашенных простыми красителями, споры выглядят в виде бесцветных телец внутри окрашенных в соответствующий цвет вегетативных клеток или вне их. Окрашивать их можно по методу Циля–Нельсена, используя для обесцвечивания мазков после обработки их фуксином Циля не 5%, а 1% серную кислоту. При этом эндоспоры, так же как микобактерии туберкулеза, красятся в розовый цвет и будут хорошо видны на синем фоне бактерий. Для окрашивания спор можно использовать метод по ОЖЕШКО: 1) протравка оболочки споры горячей кислотой; 2) окраска по Цилю–Нильсену.

При исследовании морфологии паразитов крови (спирохеты – бледная трепонема, простейшие – малярийный плазмодий), а т/же ФЭ, используют окраску по РОМАНОВСКОМУ–ГИМЗА. Краска состоит из смеси азура, эозина и метиленовой сини. Окрашивает ЦИТОПЛАЦМУ в голубой, а ЯДРА в красно–фиолетовый цвет. Этот метод позволяет обнаружить различные цитологические детали.

Мазок для люминесцентной микроскопии готовят обычным образом, фиксируют в ацетоне и наносят на него флюорохром на 20–30 мин. Сделанный препарат промывают проточной водой, покрывают покровным стеклом и микроскопируют.

Источник

Основа, методы и способы окрашивания спор

окрашивание спор методология, используемая для окрашивания структур устойчивости, которые образуют некоторые бактериальные роды, когда они находятся в неблагоприятных условиях; эти структуры соответствуют способу выживания.

Есть много родов, которые образуют споры; Однако основными из них являются Bacillus и Clostridium. Эти роды считаются более актуальными, потому что они имеют патогенные виды для людей.

Каждая бацилла может породить спору. Во время окрашивания препарата спора может быть найдена внутри бациллы (эндоспора) или снаружи (экзоспора). При использовании традиционных методов окрашивания бактерий, таких как окрашивание по Граму, споры остаются бесцветными..

В настоящее время существует несколько методик окраски, которые способны пересекать толстую структуру споры и окрашивать ее. Эти методологии очень разнообразны; среди них можно упомянуть технику Дорнера, мельеровскую окраску и методологию Шеффера-Фултона, также известную как Вирц-Конклин..

Из всех упомянутых методик методология Шеффера-Фултона является наиболее используемой в рутинных лабораториях. Он обязан своим именем двум микробиологам, создавшим окраску в 1930 году: Алисии Шеффер и Макдональду Фултону. Однако иногда эту технику называют Вирц-Конклин в честь двух бактериологов 1900-х годов..

1 фундамент
2 Техника окраски спор
- 2.1 Техника Дорнера
- 2.2 Модифицированная техника Дорнера
- 2.3 Техника Шеффера-Фултона или Вирца-Конклина
- 2.4 Техника Мёллера
- 2.5 Модифицированная техника Мёллера без нагрева
3 использования
- 3.1 Примеры
4 Ссылки

фундамент

Споры не окрашиваются обычными окрасками, потому что имеют очень толстую стенку. Сложный состав спор предотвращает проникновение большинства красителей.

Если споры изучаются снаружи внутрь, наблюдаются следующие слои: во-первых, экзоспорий, который является самым тонким наружным слоем, образованным гликопротеинами..

Затем следует кутикула, которая обеспечивает устойчивость к высоким температурам, за которой следует кора, состоящая из пептидогликана. Тогда есть стена основания, которая защищает протопласт.

Спора представляет собой обезвоженную структуру, которая содержит 15% кальция и дипиколиновой кислоты. Поэтому большинство методов окрашивания спор основаны на применении тепла, чтобы краситель мог проникать в толстую структуру..

Как только спора окрашена, она не может устранить краситель. В методике Шеффера-Фултона малахитовый зеленый проникает в вегетативные клетки и при воздействии тепла проникает в эндоспоры, а также в экзоспоры..

При промывании водой краситель удаляется из вегетативной клетки. Это происходит потому, что зеленый малахитовый краситель является слегка основным, поэтому он слабо связывается с вегетативной клеткой.

С другой стороны, он не может выйти из споры, и, наконец, контрастирует бацилла с сафранином. Эта основа действительна для остальных техник, в которых происходит нечто подобное.

Техника окраски спор

Чтобы споры окрасились, у вас должна быть чистая культура подозреваемого штамма, которую вы хотите изучить.

Культура подвергается воздействию экстремальных температур в течение 24 часов, чтобы стимулировать микроорганизм к споруляции. Для этого культуру можно поместить в духовку при 44 ° С или в холодильник (8 ° С) на 24 или 48 часов..

Если при указанных температурах останется слишком много времени, будут наблюдаться только экзоспоры, поскольку все эндоспоры покинут бациллу..

В конце времени, несколько капель стерильного физиологического раствора должны быть помещены на чистое предметное стекло. Затем берется небольшая часть урожая и производится мелкий спред.

После этого его оставляют сохнуть, его фиксируют на высокой температуре и окрашивают некоторыми методами, которые описаны ниже:

Техника Дорнера

1- Приготовьте в пробирке концентрированную суспензию спорулированного микроорганизма в дистиллированной воде и добавьте равный объем отфильтрованного Kinyoun фенольного фуксина.

2- Поместите пробирку в ванну с кипящей водой на 5-10 минут..

3- На чистом предметном стекле смешайте каплю предыдущей суспензии с каплей 10% водного раствора нигрозина, вскипятите и отфильтруйте.

4- быстро растягивается и сохнет при умеренном нагревании.

5- Исследуйте с 100X объективом (погружение).

Споры окрашиваются в красный цвет, а бактериальные клетки выглядят почти бесцветными на темно-сером фоне.

Модифицированная техника Дорнера

1- Суспензия спорулированного микроорганизма распределяется на предметном стекле и фиксируется на высокой температуре..

2- Образец покрывается полоской фильтровальной бумаги, к которой добавляется фуксин фениновой кислоты. Краситель нагревают в течение 5-7 минут с помощью пламени горелки Бунзена до тех пор, пока не образуются выделения паров. Затем бумага удаляется.

3- Вымойте препарат водой, а затем высушите с помощью впитывающей бумаги..

4- Покройте мазок тонкой пленкой из 10% нигрозина, используя второе предметное стекло, чтобы распределить нигрозин или иглу.

Окраска, полученная спорами и бактериями, такая же, как описанная в предшествующем уровне техники..

Техника Шеффера-Фултона или Вирца-Конклина

1- Сделайте тонкий спред с суспензией спорулированного микроорганизма на предметном стекле и закрепите его для нагревания..

2- Накройте предметное стекло водным раствором 5% малахитового зеленого (на листе можно разместить фильтровальную бумагу).

3. Нагрейте пламя горелки Бунзена, чтобы пар вышел и удалял пламя. Повторите операцию от 6 до 10 минут. Если во время процедуры малахитовый зеленый раствор испаряется слишком много, можно добавить еще.

4- Удалите фильтровальную бумагу (если она была размещена) и промойте водой.

5- Накройте предметное стекло 0,5% водным сафранином в течение 30 секунд (в некоторых вариантах техники используется 0,1% водный сафранин и оставьте его на 3 минуты).

С этой техникой споры зеленые и бациллы красные.

Недостатком является то, что эндоспоры молодых культур плохо окрашиваются, так как выглядят очень прозрачными или бесцветными. Чтобы избежать этого, рекомендуется использовать культуры 48 часов инкубации.

Техника Мёллера

1- Покройте мазок хлороформом в течение 2 минут..

2- Откажитесь от хлороформа.

3- Покройте 5% -ной хромовой кислотой в течение 5 минут.

4- промыть дистиллированной водой

5- Лист покрыт фуксин-фенольным карпом и подвергается воздействию пламени горелки Бунзена до момента выделения паров; затем он удаляется из пламени на несколько мгновений. Операция повторяется до 10 минут.

7- Используйте подкисленный этанол (соляной спирт) для обесцвечивания. Осталось на 20 или 30 секунд.

8- Промыть дистиллированной водой.

9- Противодействовать покрытию листа метиленовым синим в течение 5 минут..

10- Промыть дистиллированной водой.

11 — Осталось высохнуть, и образец взят под микроскопом..

Споры выглядят красными и синими бациллами. Важно не вдыхать пары, потому что они токсичны и в долгосрочной перспективе могут быть канцерогенными.

Модифицированная техника Мёллера без тепла

В 2007 году Хаяма и его сотрудники создали модификацию метода Мёллера. Они удалили этап нагревания красителя и заменили его добавлением 2 капель поверхностно-активного вещества Tergitol 7 на каждые 10 мл фуксин-фенольного карболического раствора. Те же результаты были получены.

приложений

Окраска спор предоставляет очень ценную и полезную информацию для идентификации возбудителя, так как наличие его, его форма, расположение в бацилле и способность деформировать вегетативную клетку или нет, являются данными, которые могут направлять вид участвует в определенном поле.

В этом контексте стоит упомянуть, что споры могут быть круглыми или овальными, они могут располагаться в центре или также в парацентральном, субтерминальном или терминальном положении.

примеров

— Clostridium difficile образует овальную спору в терминальном положении, которая деформирует бациллу.

— Спора Clostridium Tertium Он овальный, не деформирует бациллу и расположен на уровне терминала.

— Эндоспора Clostridium тетэни он терминальный и деформирует палочку, придавая вид голени.

— Споры Clostridium botulinum, С. histolyticum, С. Новый и C. septicum они округлые или субтерминальные овальные и деформируют бациллу.

— Эндоспора Clostridium sordelli он расположен в центральном положении, с небольшой деформацией.

Источник

Какими способами окрашивают споры бактерий

6.5. Окраска спор микробов