Какими способами можно осадить белок не вызывая его денатурацию

Как удалить белки из раствора?

Чтобы выделить белки из раствора или разделить белки по физико-химическим свойствам достаточно удалить один или оба фактора, обеспечивающих их растворимость — заряд и гидратную оболочку . Так как растворимость белков зависит только от них, то исчезновение одного или обоих этих факторов ведет к полному или частичному осаждению белка и, конечно, к потере его функций. Некоторые способы осаждения позволяют впоследствии восстановить нативные свойства и работоспособность белков.

Обратимость осаждения белков обусловлена сохранением первичной структуры белка. Восстановление физико-химических и биологических свойств белка называется ренативация (ренатурация) . Иногда для ренативации достаточно просто удалить повреждающий агент.

Денатурация

Денатурация – необратимое осаждение белка из-за разрыва связей, стабилизирующих четвертичную, третичную, вторичную структуры белка, сопровождаемое изменением растворимости, вязкости, химической активности, снижением или полной потерей биологической функции.

1. Физическая денатурация

Вызывается повышением температуры, ультрафиолетовым и микроволновым излучением, механическими воздействиями, ионизацией заряженными частицами.

2. Химическая денатурация

Зависит от природы денатурирующего реагента:

• кислоты и щелочи образуют водородные связи с пептидными группами,
• органические растворители образуют водородные связи и вызывают дегидратацию,
• алкалоиды образуют связи с полярными группами и разрывают систему водородных и ионных связей,
• тяжелые металлы взаимодействуют с заряженными радикалами, нейтрализуют отрицательные заряды и разрывают систему водородных и ионных связей.

На эффекте химической денатурации основаны устаревшие, но простые и наглядные тимоловая проба и проба Вельтмана, используемые ранее в клиникo-лабораторной диагностике для оценки состава белков крови.

Высаливание

Высаливание – это добавление к раствору белка нейтральных солей (Na₂SO₄, (NH₄)₂SO₄). Механизм высаливания заключается во взаимодействии анионов (SO₄ 2- ) и катионов (Na + , NH₄ + ) с зарядами белка (группы NH₄ + и COO – ). В результате заряд исчезает, и соответственно, исчезает взаимоотталкивание молекул. Одновременно резко уменьшается гидратная оболочка. Все это приводит к «слипанию» молекул и осаждению.

Соли в низких концентрациях способны взаимодействовать с ионными группами белков, отвечающих за внутримолекулярные взаимодействия, приводить к их раскрытию и повышать растворимость.

Так как белки плазмы крови отличаются по размерам, заряду, строению, то можно подобрать такие количества соли, которые вызовут осаждение менее устойчивых белков, пока другие еще будут растворены.

Например, раньше в диагностических целях так определяли соотношение белковых фракций альбумины/глобулины в плазме крови. Альбумины, как более полярные молекулы, остаются в растворенном состоянии при 50% насыщении раствора нейтральными солями, в то время как глобулины в этих условиях уже осаждаются. В норме соотношение альбумины/глобулины в плазме крови равно 1,2-1,8.

Осаждение водоотнимающими средствами

При добавлении водоотнимающих средств (ацетон, этанол) происходит отнятие у белка гидратной оболочки, но не заряда. Растворимость несколько снижается, но денатурации не наступает. Например, в этом заключается антисептическое действие этанола.

Изменение рН

Мягкое изменение рН до изоэлектрической точки белка ведет к исчезновению заряда, одновременному уменьшению гидратной оболочки и, как следствие, снижению растворимости молекулы.

Источник

Осаждение белков — Protein precipitation

Осаждение белков широко используется при последующей переработке биологических продуктов для концентрирования белков и их очистки от различных загрязняющих веществ. Например, в биотехнологической промышленности осаждение белков используется для удаления загрязняющих веществ, обычно содержащихся в крови. Основным механизмом осаждения является изменение сольватационного потенциала растворителя, более конкретно, за счет снижения растворимости растворенного вещества путем добавления реагента.

СОДЕРЖАНИЕ

Общие принципы

Растворимость белков в водных буферах зависит от распределения гидрофильных и гидрофобных аминокислотных остатков на поверхности белка. Гидрофобные остатки преимущественно встречаются в ядре глобулярного белка, но некоторые существуют в виде пятен на поверхности. Белки с высоким содержанием гидрофобных аминокислот на поверхности имеют низкую растворимость в водном растворителе. Заряженные и полярные поверхностные остатки взаимодействуют с ионными группами в растворителе и увеличивают растворимость белка. Знание аминокислотного состава белка поможет определить идеальный растворитель и методы для осаждения.

Отталкивающая электростатическая сила

Отталкивающие электростатические силы образуются, когда белки растворяются в растворе электролита . Эти силы отталкивания между белками предотвращают агрегацию и способствуют растворению. При растворении в растворе электролита противоионы растворителя мигрируют к заряженным поверхностным остаткам на белке, образуя жесткую матрицу противоионов на поверхности белка. Рядом с этим слоем находится другой слой сольватации, который менее жесткий и по мере удаления от поверхности белка содержит уменьшающуюся концентрацию противоионов и увеличивающуюся концентрацию коионов. Присутствие этих сольватационных слоев заставляет белок иметь меньше ионных взаимодействий с другими белками и снижает вероятность агрегации. Отталкивающие электростатические силы также образуются, когда белки растворяются в воде. Вода образует сольватационный слой вокруг гидрофильных поверхностных остатков белка. Вода создает градиент концентрации вокруг белка с максимальной концентрацией на поверхности белка. Эта водная сеть оказывает демпфирующее действие на силы притяжения между белками.

Слой ионной сольватации

Привлекательная электростатическая сила

Между белками существуют дисперсионные или притягивающие силы через постоянные и индуцированные диполи . Например, основные остатки на белке могут иметь электростатические взаимодействия с кислотными остатками на другом белке. Однако сольватация ионами в растворе электролита или в воде снижает силы притяжения белок-белок. Следовательно, чтобы осаждать или вызывать накопление белков, слой гидратации вокруг белка должен быть уменьшен. Целью добавленных реагентов при осаждении белка является уменьшение гидратного слоя.

Образование осадка

Образование осадка белка происходит поэтапно. Сначала добавляется осаждающий агент, и раствор постоянно перемешивается. Смешивание вызывает столкновение осадителя и белка. Для того чтобы молекулы могли диффундировать через жидкие водовороты, требуется достаточно времени для перемешивания. Затем белки проходят фазу зародышеобразования , когда образуются белковые агрегаты или частицы субмикроскопических размеров. Рост этих частиц находится под контролем броуновской диффузии. Как только частицы достигают критического размера (от 0,1 мкм до 10 мкм для высокого и низкого полей сдвига соответственно), путем диффузионного добавления к ним отдельных белковых молекул, они продолжают расти, сталкиваясь друг с другом и слипаясь или флокулируя . Эта фаза происходит медленнее. На заключительном этапе, называемом старением в поле сдвига, частицы осадка неоднократно сталкиваются и слипаются, а затем распадаются, пока не будет достигнут стабильный средний размер частиц, который зависит от отдельных белков. Механическая прочность белковых частиц коррелирует с произведением средней скорости сдвига и времени старения, которое известно как число Кэмпа. Старение помогает частицам противостоять сдвиговым силам жидкости, возникающим в насосах и центрифугах, без уменьшения размера.

Методы

Высаливание

Высаливание — наиболее распространенный метод осаждения белка. Добавление нейтральной соли, такой как сульфат аммония , сжимает сольватационный слой и увеличивает межбелковые взаимодействия. По мере увеличения концентрации соли в растворе заряды на поверхности белка взаимодействуют с солью, а не с водой, тем самым обнажая гидрофобные пятна на поверхности белка и вызывая выпадение белка из раствора (агрегирование и осаждение).

Энергетика, занимающаяся высаливанием

Высаливание — это самопроизвольный процесс, когда в растворе достигается нужная концентрация соли. Гидрофобные пятна на поверхности белка образуют высокоупорядоченные водные оболочки. Это приводит к небольшому уменьшению энтальпии Δ H и большему уменьшению энтропии Δ S упорядоченных молекул воды по сравнению с молекулами в объеме раствора. Общее изменение свободной энергии , Δ G , процесса определяется уравнением свободной энергии Гиббса:

Δ грамм знак равно Δ ЧАС — Т Δ S . <\ Displaystyle \ Delta G = \ Delta HT \ Delta S.>

Δ G = изменение свободной энергии, Δ H = изменение энтальпии при осаждении, Δ S = изменение энтропии при осаждении, T = абсолютная температура. Когда молекулы воды в жестком сольватационном слое возвращаются в объемную фазу за счет взаимодействия с добавленной солью, их большая свобода движения вызывает значительное увеличение их энтропии. Таким образом, Δ G становится отрицательным и осаждение происходит самопроизвольно.

Серия Хофмайстера

Космотропы или «стабилизаторы структуры воды» представляют собой соли, которые способствуют рассеиванию / диспергированию воды из сольватационного слоя вокруг белка. Затем на поверхности белка экспонируются гидрофобные пятна, и они взаимодействуют с гидрофобными участками на других белках. Эти соли усиливают агрегацию и осаждение белков. Хаотропы или «разрушители структуры воды» имеют противоположный эффект Космотропов. Эти соли способствуют увеличению сольватационного слоя вокруг белка. Эффективность космотропных солей в осаждении белков соответствует порядку ряда Хофмайстера:

Наибольшее количество осадков наименьшее количество осадков SO_<4>^<2->>COO^<->>Cl^<->> >»> п О 4 3 — > S О 4 2 — > C О О — > C л — <\ displaystyle \ mathrm ^ <3 ->> SO_ <4>^ <2 ->> COO ^ <->> Cl ^ <->>> SO _ <<4>> ^ <<2 ->>> COO ^ <<->>> Cl ^ <<->>>>»>

Наибольшее количество осадков наименьшее количество осадков K^<+>>Na^<+>> >»> N ЧАС 4 + > K + > N а + <\ displaystyle \ mathrm ^ <+>> K ^ <+>> Na ^ <+>>> K ^ <<+>>> Na ^ <<+>>>>»>

Высаливание на практике

Уменьшение растворимости белка следует нормализованной кривой растворимости показанного типа. Связь между растворимостью белка и увеличением ионной силы раствора можно представить уравнением Кона :

бревно ⁡ S знак равно B — K я <\ Displaystyle \ журнал S = B-KI \,>

S = растворимость белка, B — идеализированная растворимость, K — константа , зависящая от соли, а I — ионная сила раствора, которая приписывается добавленной соли.

я знак равно 1 2 ∑ я знак равно 1 п c я z я 2 <\ displaystyle I = <\ begin <\ frac <1><2>> \ end > \ sum _ ^ c_ z_ ^ <2 >>

z _i — заряд иона соли, а c _i — концентрация соли. Идеальная соль для осаждения белка наиболее эффективна для определенного аминокислотного состава, недорогая, не буферизирующая и не загрязняющая окружающую среду. Наиболее часто используемая соль — сульфат аммония . Изменение высаливания при температуре от 0 ° C до 30 ° C невелико. Белковые осадки, оставшиеся в солевом растворе, могут оставаться стабильными в течение многих лет, защищенные от протеолиза и бактериального загрязнения высокими концентрациями соли.

Изоэлектрические осадки

Изоэлектрической точкой (ИЭТ) является рН раствора , при котором сеть первичного заряда белка становится равной нулю. При pH раствора выше pI поверхность белка преимущественно заряжена отрицательно, и поэтому одноименно заряженные молекулы будут проявлять силы отталкивания. Аналогичным образом, при pH раствора ниже pI поверхность белка преимущественно заряжена положительно, и между белками происходит отталкивание. Однако в точке pI отрицательные и положительные заряды нейтрализуются, отталкивающие электростатические силы уменьшаются, а силы притяжения преобладают. Силы притяжения вызовут агрегацию и осаждение. PI большинства белков находится в диапазоне pH 4–6. Минеральные кислоты, такие как соляная и серная кислоты , используются в качестве осадителей. Самым большим недостатком осаждения изоэлектрической точки является необратимая денатурация, вызванная минеральными кислотами. По этой причине осаждение изоэлектрической точки чаще всего используется для осаждения загрязняющих белков, а не целевого белка. Осаждение казеина во время производства сыра или казеината натрия представляет собой изоэлектрическое осаждение.

Осаждение смешивающимися растворителями

Добавление смешивающихся растворителей, таких как этанол или метанол, к раствору может вызвать осаждение белков в растворе. Сольватационный слой вокруг белка будет уменьшаться по мере того, как органический растворитель постепенно вытесняет воду с поверхности белка и связывает ее в гидратных слоях вокруг молекул органического растворителя. С меньшими слоями гидратации белки могут агрегироваться за счет притягивающих электростатических и дипольных сил. Важными параметрами, которые следует учитывать, являются температура, которая должна быть ниже 0 ° C, чтобы избежать денатурации , pH и концентрация белка в растворе. Смешиваемые органические растворители уменьшают диэлектрическую проницаемость воды, что фактически позволяет двум белкам сближаться. В изоэлектрической точке соотношение между диэлектрической проницаемостью и растворимостью белка определяется выражением:

бревно ⁡ S знак равно k / е 2 + бревно ⁡ S 0 <\ Displaystyle \ журнал S = к / е ^ <2>+ \ журнал S ^ <0>\,>

S 0 — экстраполированное значение S , e — диэлектрическая проницаемость смеси, а k — постоянная, относящаяся к диэлектрической проницаемости воды. Процесс Кона для фракционирования белков плазмы основан на осаждении растворителем этанолом для выделения отдельных белков плазмы.

Клиническое применение метанола в качестве агента, осаждающего белок, заключается в оценке билирубина.

Неионные гидрофильные полимеры

Полимеры , такие как декстраны и полиэтиленгликоли , часто используются для осаждения белков, поскольку они обладают низкой воспламеняемостью и с меньшей вероятностью денатурируют биоматериалы, чем изоэлектрическое осаждение. Эти полимеры в растворе притягивают молекулы воды от сольватационного слоя вокруг белка. Это увеличивает межбелковые взаимодействия и усиливает преципитацию. Для конкретного случая полиэтиленгликоля осаждение можно моделировать уравнением:

пер ⁡ ( S ) + п S знак равно Икс — а C <\ Displaystyle \ пер (S) + pS = X-AC \,>

C — концентрация полимера, P — коэффициент взаимодействия белок-белок, a — коэффициент взаимодействия белок-полимер и

Икс знак равно ( μ я — μ я 0 ) р Т <\ Displaystyle х = (\ му _ <я>— \ му _ <я>^ <0>) RT>

Флокуляция полиэлектролитами

Альгинат , карбоксиметилцеллюлоза, полиакриловая кислота, дубильная кислота и полифосфаты могут образовывать протяженные сети между молекулами белка в растворе. Эффективность этих полиэлектролитов зависит от pH раствора. Анионные полиэлектролиты используются при значениях pH ниже изоэлектрической точки. Катионные полиэлектролиты находятся при значениях pH выше pI. Важно отметить, что избыток полиэлектролитов заставит осадок снова раствориться в растворе. Примером полиэлектролитной флокуляции является удаление белкового облака из пивного сусла с помощью ирландского мха .

Поливалентные ионы металлов

Соли металлов можно использовать в низких концентрациях для осаждения ферментов и нуклеиновых кислот из растворов. Часто используемые поливалентные ионы металлов — это Ca 2+ , Mg 2+ , Mn 2+ или Fe 2+ .

Реакторы осаждения

Существует множество реакторов промышленного масштаба, которые можно использовать для осаждения больших количеств белков, таких как рекомбинантные ДНК-полимеразы, из раствора. [1]

Реакторы периодического действия

Реакторы периодического действия — самый простой тип реакторов осаждения. Осаждающий агент медленно добавляют к раствору белка при перемешивании. Агрегирующие белковые частицы имеют тенденцию быть компактными и правильными по форме. Поскольку частицы подвергаются воздействию широкого диапазона касательных напряжений в течение длительного периода времени, они имеют тенденцию быть компактными, плотными и механически стабильными.

Трубчатые реакторы

В трубчатых реакторах раствор исходного белка и осаждающий реагент контактируют в зоне эффективного перемешивания, а затем подают в длинные трубки, где происходит осаждение. Жидкость в элементах объема приближается к пробковому потоку, когда они движутся через трубы реактора. Турбулентный поток создается за счет вставок из проволочной сетки в трубке. Трубчатый реактор не требует движущихся механических частей и недорог в изготовлении. Однако реактор может стать непрактично длинным, если частицы собираются медленно.

Реакторы непрерывного действия с мешалкой (CSTR)

Реакторы CSTR работают в установившемся режиме с непрерывным потоком реагентов и продуктов в хорошо перемешанном резервуаре. Свежий протеиновый корм контактирует с суспензией, которая уже содержит частицы осадка и реагенты для осаждения.

Источник