Каким способом проверяют гемоглобин

ОСНОВНЫЕ ФУНКЦИИ. СТРОЕНИЕ. СВОЙСТВА

Гемоглобин – основной дыхательный пигмент и главный компонент эритроцита, выполняющий важные функции в организме человека: перенос кислорода из легких в ткани и углекислого газа из тканей в легкие. Он также играет существенную роль в поддержании кислотно-основного равновесия крови. Буферная система, создаваемая гемоглобином, способствует сохранению рН крови в определенных пределах.

Гемоглобин – красный пигмент крови человека и животных. Подсчитано, что в одном эритроците содержится около

340000000 молекул гемоглобина, каждая из которых состоит примерно из 103 атомов. В крови человека в среднем содержится

14,5% гемоглобина, его общее количество

750 г. Гемоглобин представляет собой сложный белок, относящийся к группе гемопротеинов; белковый компонент в котором представлен глобином, небелковый – простетической группой. Простетическая группа в молекуле гемоглобина представлена 4 одинаковыми железопорфириновыми соединениями, которые называются гемами. Молекула гема состоит из порфирина IХ, связанного с железом двумя атомами азота ковалентными и двумя другими атомами азота координационными связями. Атом железа (II) расположен в центре гема и придает крови характерный красный цвет, степень его окисления не изменяется независимо от присоединения или отдачи кислорода.

Видовые различия гемоглобина обусловлены химическим составом и строением глобина. Гемоглобины представляют собой тетрамерные белки, молекулы которых образованы различными типами полипептидных цепей, обозначаемых как α ,β, γ, δ. В состав молекулы входят по 2 полипептидные цепи двух разных типов, каждая из которых оборачивает 1 гем гемоглобина. Гемоглобины различных видов различаются вторичной, третичной и четвертичной структурами, и индивидуальные свойства гемоглобинов неразрывно связаны с их структурами. Известно, что гемоглобин человека состоит из двух равных половин, каждая из которых образована двумя одинаковыми полипептидными цепями. У человека обнаружены гемоглобины различных типов, которые отличаются по химическому строению. В крови взрослого человека содержится гемоглобин А (HbA), состоящий из α2β2 цепей. В дополнение к основному HbA в крови взрослого человека обнаружен гемоглобин A2 (HbA2), на долю которого приходится

2,5% от всего гемоглобина. Кроме того, известен фетальный гемоглобин F (HbF) – гемоглобин новорожденных, имеющий структуру α2γ2, и отличающийся от HbA вторичной, третичной и четвертичной структурами, что обусловливает их различия: по спектральным характеристикам, электрофоретической подвижности, устойчивости к тепловой денатурации и др. Кровь новорожденного ребенка состоит на

80% из HbF, который к концу первого года жизни почти целиком заменяется на HbA (в крови взрослого человека содержится до

1,5% HbF от общего количества гемоглобина).

Гемоглобин – кристаллическое вещество, хорошо растворимое в воде и нерастворимое в спирте, эфире и хлороформе. В эритроцитах гемоглобин находится в растворенном состоянии, несмотря на то, что его содержание более 30%. При изменении аминокислотного состава глобина может произойти и изменение его растворимости, как у HbS.

Растворы гемоглобина окрашены в темно-красный цвет и имеют характерные спектры поглощения в ультрафиолетовой и видимой областях спектра. Изоэлектрическая точка гемоглобина

7. В кислой и щелочной среде гемоглобин легко денатурируется, скорость денатурации различна у различных видов гемоглобинов. В кислой среде связь между гемом и глобином легко разрывается. Свободный гем легко окисляется кислородом воздуха до гематина, в котором атом железа трехвалентен.

Наиболее характерным свойством гемоглобина является обратимое присоединение газов О2, СО и др. Образовавшиеся при этом соединения называются оксигемоглобином и карбоксигемоглобином, соответственно. Реакция присоединения молекулярного кислорода не является истинным окислением гемоглобина, так как валентность железа в гене при этом не изменяется, и эту реакцию правильнее называть оксигенацией. Истинное окисление гемоглобина происходит только тогда, когда железо переходит в трехвалентное состояние.

В крови гемоглобин существует по крайней мере в четырех формах: оксигемоглобин, дезоксигемоглобин, карбоксигемоглобин, метгемоглобин. В эритроцитах молекулярные формы гемоглобина способны к взаимопревращению, их соотношение определено индивидуальными особенностями организма.

Клиническое значение

Снижение концентрации гемоглобина: анемии.

Повышение концентрации гемоглобина: полицитемия, гемоконцентрация при дегитратации, ожогах, кишечной непроходимости, упорной рвоте; пребывание на больших высотах, чрезмерная физическая нагрузка или возбуждение; сердечно-сосудистая патология, обычно врожденная, приводящая к значительному венозному сбросу; заболевания легких, приводящие к снижению легочной перфузии, плохой аэрации легких, легочной артериальной фистуле; хроническое химическое воздействие нитритов, сульфонамидов, вызывающих образование мет- и сульфогемоглобина.

Нормальные величины: у мужчин 130-160 г/л; у женщин; 120-140 г/л.

Содержание гемоглобина обычно ниже у недоношенных, чем у доношенных новорожденных. Содержание гемоглобина снижается на

10% в промежутке времени от 17 до 07 час утра, а также после еды. Снижение гемоглобина от нормальных величин на

6% наблюдается при взятии пробы в положении лежа. Незначительное, но диагностически значимое, снижение нижнего порога нормальных величин гемоглобина встречается у мужчин возрастной группы 65-74 года.

МЕТОДЫ АНАЛИЗА

Общая характеристика методов

Определение содержания гемоглобина в крови человека является одним из самых важных и массовых показателей. Для определения гемоглобина чаще всего анализируют производные гемоглобина, образовавшиеся в процессе его окисления и присоединения к гему различных химических групп, приводящих к изменению валентности железа и окраски раствора.

Из «старых» методов, все еще применяемых в ряде лабораторий, остановимся на следующих: сапониновом и методе Сали.

При использовании сапонинового метода тельца Гейнца не растворяются, раствор остается мутноватым, за счет чего может меняться спектр поглощения раствора, и ошибка при этом достигает 20-30%.

В методе Сали измеряется гематин, образовавшийся при взаимодействии гемоглобина с соляной кислотой. Метод основан на визуальной оценке содержания гемоглобина путем сравнения окраски исследуемой пробы со стандартными растворами солянокислого гематина. Ошибка метода достигает

30%, на результаты определения влияют многие факторы: время реакции между гемоглобином и соляной кислотой, которое может колебаться от 2 до 40 мин в зависимости от содержания белков крови; оттенок цвета геминхлорида, зависящий от содержания билирубина в крови; характера освещения и пр.

Химические и спектрофотометрические методы имеют высокую точность и рекомендуются в качестве референсных, но из-за трудоемкости и значительной стоимости анализа для рутинных определений не применяются.

Для рутинных лабораторных исследований наиболее предпочтительны колориметрические методы, как наиболее дешевые, простые и быстрые в исполнении. Кровь человека – это нормальная смесь производных гемоглобина с различными спектрами поглощения. При количественном определении гемоглобина колориметрическими методами возникает проблема в выборе реагента, который превращал бы все производные гемоглобина только в одну форму перед фотометрическим анализом. Лучшими методами, количественно превращающими гемоглобин в его производные, оказались гемиглобинцианидный (HbCN), гемихромный (HbChr) и гемиглобиназидный (HbN3), которые при фотометрировании дают наименьшую ошибку определения среди других методов анализа. Однако, некоторые данные не позволяют использовать гемиглобиназидный метод в качестве альтернативного в силу следующих причин: конечный продукт превращения гемоглобина – HbN3 имеет слабый пик поглощения при λ = 540 нм, что не дает возможности использовать фотометры с широкополосными фильтрами; иногда возникают проблемы, связанные с мутностью растворов; и наконец, раствор HbN3 не хранится при комнатной температуре. Напротив, гемиглобинцианидный и гемихромный методы лишены этих недостатков и при дальнейших исследованиях им было отдано предпочтение.

Интерференция при всех колориметрических методах анализа

Повышение гемоглобина: гипертриглицеридемия, количество лейкоцитов более 25х10 9 /л, прогрессирующие заболевания печени, наличие легко преципитирующихся глобулинов (при миеломной болезни или при макроглобулинемии Вальденстрема).

Понижение гемоглобина: у заядлых курильщиков вследствие образования неактивного HbСО.

Гемиглобинцианидный метод

Принцин гемиглобинцианидного метода основан на переводе всех форм гемоглобина в одну — гемиглобинцианид. Перевод гемоглобина в гемиглобинцианид осуществляется при его взаимодействии с трансформирующим раствором, содержащим феррицианид калия, цианид калия, дигидрофосфат калия и неионный детергент. Дигидрофосфат калия поддерживает уровень рН, при котором реакция проходит за 3-5 минут. Детергент усиливает гемолиз эритроцитов и предотвращает мутность, связанную с белками плазмы. Феррицианид калия окисляет все формы гемоглобина в метгемоглобин, который образует с цианистым калием гемиглобинцианид, имеющий красноватый цвет, интенсивность окраски которого прямо пропорциональна концентрации гемоглобина в пробе.

Гемиглобинцианидный метод, разработанный в 1936 г Драбкиным, был одобрен Международным Комитетом по стандартизации в гематологии (ICSH) в 1963 г.

Экспериментальное изучение данного метода для его стандартизации в гемиглобинометрии имело следующие главные цели: найти точное значение коэффициента молярной экстинкции для HbCN при λ = 540 нм; разработать требования для получения калибровочного раствора HbCN, обеспечивающие его стабильность в течение нескольких лет; усовершенствовать процедуру анализа при определении гемоглобина для снижения экспериментальных ошибок; оценить надежность других методов в сравнении с гемиглобинцианидным. На основе широкомасштабных исследований был определен коэффициент молярной экстинкции гемиглобинцианида, равный 11,00 (ε540 = 11,00), и выработаны требования к его качеству.

Основные достоинства гемиглобинцианидного метода:

• HbCN является стабильным производным гемоглобина, и все имеющиеся в крови формы гемоглобина могут быть быстро и количественно превращены в HbCN;
• спектр поглощения HbCN имеет плоский максимум при λ = 540 нм, поэтому достаточная точность анализа возможна при измерении оптической плотности на фотометрах даже со светофильтрами;
• растворы HbCN строго подчинены закону Ламберта-Бера при λ = 540 в широком диапазоне концентраций;
• калибровочный раствор HbCN устойчив в течение нескольких месяцев и даже лет.

Гемихромный метод

С развитием методов анализа для определения гемоглобина в крови разработан новый колориметрический метод, не содержащий в составе реагентов цианистых соединений, которые заменены жирными кислотами с феррицианидом калия или поверхностноактивными веществами, лучший из которых – додецилсульфат натрия (SDS).

Принцип гемихромного метода

Принцип гемихромного метода основан на переводе всех форм гемоглобина в одну – гемихром. При взаимодействии гемоглобина с трансформирующим раствором, содержащим жирные кислоты с феррицианидом калия или додецилсульфат натрия, происходит его превращение в окисленную низкоспиновую форму – гемихром (HbChr), имеющую красноватый цвет, интенсивность окраски которого прямо пропорциональна концентрации гемоглобина в пробе.

Гемихромный метод определения гемоглобина в крови разработан Ахрем А.А. с соавторами в 1986 г. Набор реагентов для определения гемоглобина в крови, основанный на данном методе, одобрен Комитетом по новой медицинской технике МЗ РФ и рекомендован к применению в клинико-диагностических лабораториях уже в 1998 г.

Основные достоинства гемихромного метода:

• гемихром – стабильное производное гемоглобина, и все имеющиеся в крови формы гемоглобина могут быть быстро и количественно превращены в HbChr;
• спектр поглощения HbChr имеет плоский максимум вблизи λ = 540 нм (533), поэтому достаточная точность анализа возможна при измерении оптической плотности на фотометрах даже со светофильтрами;
• растворы HbChr строго подчинены закону Ламберта-Бера при λ = 540 нм в широком диапазоне концентраций;
• калибровочный раствор HbChr устойчив в течение нескольких месяцев и даже лет;
• трансформирующий реагент не ядовит и безвреден: в его составе не содержится цианистых соединений.

Молярный коэффициент экстинкции HbChr при λ = 540 нм равен

Сравнение гемихромного и гемиглобинцианидного методов

При широкомасштабных испытаниях гемихромного метода было показано, что в интервале концентраций гемоглобина от 40 до 200 г/л калибровочные графики гемиглобинцианида и гемихрома представляют прямую линию, выходящую из начала координат, а близкие углы наклона прямых указывают на сопоставимость обоих методов.

Рисунок 1 – Величина оптической плотности гемихрома (1) и гемиглобинцианида (2)

При определении гемоглобина двумя методами Ахрем А.А. с соавторами показали, что большую точность (и меньшую s) дает гемихромный метод. Авторы предполагают, что SDS способствует солюбилизации мембранных частиц и препятствует адсорбции белка на стекле пробирок и кювет, тем самым обеспечивается высокая точность анализа.

Сравнительная оценка результатов определения гемоглобина в крови двумя методами показала, что результаты сопоставимы, а коэффициент корреляции методов составляет 0,99.

Таким образом, гемихромный метод определения гемоглобина в крови обладает всеми достоинствами гемиглобинцианидного метода, которые дополняются отсутствием в составе трансформирующего реагента высокотоксичных цианидов и других ядовитых веществ.

Источник

Что сдавать при подозрении на анемию: гемоглобин или ферритин?

Наиболее распространенные симптомы анемии встречаются у многих людей, однако большинство «списывает» их на хроническую усталость, планируя выспаться в отпуске или на праздниках. Игнорируя первые признаки анемии, можно сильно навредить своему организму. В этой статье мы расскажем, какие анализы помогут в её диагностике и в чём их отличия.

Что такое анемия?

Анемия, которую также называют малокровием, проявляется у человека снижением в крови уровня белка гемоглобина и/или снижением количества переносящих кислород красных кровяных клеток — эритроцитов. При развитии анемии в организме постепенно наступает кислородное голодание, а после истощения всех внутренних резервов железа начинается медленное нарушение работы всех систем организма.

Если врач ставит диагноз анемия, то это также означает наличие в организме скрыто протекающих патологических процессов, поскольку анемия не является самостоятельным заболеванием, а лишь указывает на другие проблемы. Условно говоря, анемию можно назвать «симптомом» инфекционного, воспалительного, онкологического или другого заболевания.

Причины и классификация анемии

Врачи классифицируют много видов анемии, которые для простоты понимая можно разделить на три группы.

К первой относятся состояния кровопотери, когда человек в результате несчастного случая потерял очень много крови или в организме происходит желудочно-кишечное или другое хроническое кровотечение. Ко второй категории анемии относятся состояния, при которых нарушается производство нормальных эритроцитов и синтез гемоглобина. К третьей – когда происходит ускоренное разрушение эритроцитов по каким-либо причинам.

Наиболее распространенной в мире считается железодефицитная анемия, которая составляет около 70-90% от всех случаев. К другим причинам развития анемии можно отнести дефицит витамина В12 и А, фолиевой кислоты, острые и хронические воспаления, а также другие патологические процессы в организме, которые влияют на синтез гемоглобина.

Симптомы, которые могут указывать на анемию

Для большинства видов анемии на первых этапах развития болезни в основном характерны следующие внешние симптомы:

• быстрая утомляемость,
• хроническая усталость,
• сонливость в течение дня,
• одышка, нарушение сердечного ритма,
• бледность и сухость кожных покровов,
• шум в ушах,
• головокружение и «мушки» перед глазами,
• ломкость ногтей, сильное выпадение волос и другие.

Лабораторная диагностика анемии

Различные показатели в анализе могут указывать на дефицит железа в организме, однако установить диагноз анемия можно только по комплексу лабораторных исследований. Обычно при подозрении на анемию пациенту назначается общий и биохимический анализы крови, где главными показателями являются:

Железо сыворотки – этот показатель отражает количество железа в кровотоке, резервный уровень запасов железа в тканях;

Ферритин – биомаркер железодефицитных состояний. В белке ферритине скапливаются запасы железа, которые не были использованы эритроцитами. Уровень этого резерва очень важно знать, поскольку истощение запасов постепенно приводит к развитию анемии. Хорошая новость заключается в том, что снижение ферритина происходит постепенно и ранняя диагностика человеку не допустить прогрессирования анемии;

Трансферрин – укажет на метаболизм железа, причину и вид развивающейся анемии;

Витамин В12 – поможет выяснить, всасывается ли поступающее из пищи железо. Длительный дефицит В12 опасен, поскольку витамин необходим для формирования клеток крови и правильной работы нервной системы;

Общая железосвязывающая способность сыворотки (ОЖСС) – определяет количество железа в организме и его взаимосвязи с другими белками. ОЖСС считается стабильным показателем, которые указывает на циркуляцию железа независимо от питания в течение дня (в течение суток уровень железа меняется, поэтому важно правильно интерпретировать общую «картину» в организме);

Показатели уровня гемоглобина и эритроцитов – среднее количество гемоглобина в эритроцитах. Изменения в этих показателях являются первыми «звоночками» для пациента и врача о патологических изменениях в организме.

В зависимости от общего состояния и жалоб пациента врач может назначить выполнение отдельных показателей крови или всего комплекса анализов.

«Симптомы анемии часто принимают за хроническую усталость или переутомление, однако важно быть на чеку: выявить ее и начать терапию. Ферритин – самый важный показатель при диагностике анемий» — комментирует эксперт по лабораторной диагностике LabQuest Латынина Юлия Сергеевна.

Профилактика и лечение анемии

Ранние стадии железодефицита можно скорректировать специальной диетой и приемом витаминов, однако важно вовремя обнаружить проблему, правильно подобрать дозировку витаминов и изменить рацион в сторону продуктов, богатых железом – мяса, рыбы и морепродуктов, яиц (желтков), бобовых, злаковых, орехов, семечек, свежих фруктов и овощей, а также сухофруктов.

Нередко для улучшения всасываемости железа из пищи врач назначает прием комплекса витаминов, который ускорит лечебный процесс. Рацион считается основным источником железа, однако организм не всегда может усвоить необходимое ему количество железа.

Тяжелые формы анемии лечатся комплексно и помимо витаминов и изменения рациона включает лекарственную терапию.

В лаборатории LabQuest можно провести полное обследование организма, если вы заподозрили у себя признаки анемии. По результатам выполняется бесплатная интерпретация выполненных анализов врачом-экспертом лабораторной диагностики.

Источник