Какие способы окраски бактерий вы знаете

Методы окраски микроорганизмов

Окраска микроорганизмов — комплекс методов и приемов, применяемый для изучения морфологических свойств микроорганизмов. В нативном (естественном) состоянии бактерии имеют такой же коэффициент преломления, как и стекло, поэтому они невидимы под микроскопом. Благодаря О. м. можно изучать их морфол. особенности, что необходимо при проведении бактериологического исследования. Окрашивание бактерий производится как для обнаружения их в исследуемом материале при бактериоскопической диагностике, так и для их идентификации после выделения чистой культуры из исследуемого материала при бактериол. исследовании.

Приготовление окрашенного препарата состоит из следующих этапов: приготовление мазка, его высушивание, фиксация и окраска. Для приготовления мазка на середину чистого предметного стекла наносят небольшую каплю воды и с помощью бактериальной петли помещают в нее исследуемый материал. Материал равномерно распределяют на стекле таким образом, чтобы образовался тонкий мазок круглой или овальной формы размером 1-2 см2. Затем препарат высушивают либо при комнатной температуре на воздухе, либо в струе теплого воздуха высоко над пламенем горелки. Высушенный мазок подвергают фиксации, вследствие чего он прикрепляется к стеклу (фиксируется), микробы инактивируются и становятся безопасными, возрастает их восприимчивость к окраске. Применяют различные способы фиксации. Наиболее простым и самым распространенным способом является фиксация жаром — нагреванием на пламени горелки (препарат несколько раз проводят через наиболее горячую часть пламени горелки). В нек-рых случаях прибегают к фиксации препарата этиловым или метиловым спиртом, ацетоном, смесью равных объемов этилового спирта и эфира (по Никифорову). После фиксации производят окраску мазка. Наиболее пригодными для окраски микробов являются основные и нейтральные анилиновые красители. Окрашенный препарат промывают водой и высушивают. На высушенный мазок наносят каплю иммерсионного масла и микроскопируют, пользуясь иммерсионной системой микроскопа.

Существуют простые и сложные способы окрашивания микробов. При простой окраске, к-рая позволяет быстро изучить морфол. особенности микробов, обычно используют только один краситель, чаще всего красного цвета — фуксин (окраска производится в течение 1-2 мин) или синего цвета — метиленовый синий (время обработки мазка краской 3-5 мин). При сложных методах окраски применяют два или более контрастных красителя, протравы, дифференцирующие вещества и др. Среди сложных методов окраски различают дифференциальные методы и методы, предназначенные для выявления отдельных структур клетки. К дифференциальным методам относятся методы Грама и Циля-Нельсена, позволяющие различать по цвету микроорганизмы, сходные по морфол. свойствам.

Метод окраски по Граму — наиболее распространенный сложный способ окраски. Бактерии в зависимости от того, подвергаются они окраске по этому методу или нет, разделяют на две группы: грамположительные (красящиеся по Граму) и грамотрицательные (не красящиеся) Различие в окраске обусловлено разным строением клеточной стенки грамположительных и грамотрицательных бактерий.

Методика окраски по Граму заключается в последовательной обработке фиксированного мазка: окраске генцианвиолетом через фильтровальную бумагу (1-2 мин), обработке р-ром Люголя (1 мин), обесцвечивании спиртом (1/2-1 мин — до отхождения фиолетовых струек краски), промывании водой, окрашивании фуксином (1-2 мин). Сущность метода состоит в том, что грамположительные бактерии удерживают комплекс краситель — йод и не обесцвечиваются спиртом, грамотрицательные не обладают этим свойством, т. е. обесцвечиваются спиртом (дифференцирующим веществом) и докрашиваются фуксином. В результате грамположительные бактерии приобретают фиолетовый цвет, грамотрицательные — красный.

Метод Циля-Нельсена предназначен для дифференциации кислотоустойчивых бактерий (возбудителей туберкулеза и лепры) от некислотоустойчивых. При окраске по этому методу используют карболовый фуксин Циля, серную к-ту (дифференцирующее вещество) и метиленовый синий. Кислотоустойчивые бактерии окрашиваются в красный цвет карболовым фуксином Циля и не обесцвечиваются к-той, некислотоустойчивые теряют красную окраску при обработке к-той и докрашиваются метиленовым синим.

При изучении структуры микробной клетки используют целый ряд сложных методов. Так, для выявления капсулы у бактерий применяют метод Гинса, для обнаружения спор бактерий — метод Ауески, зерна волютина можно окрасить с помощью метода Нейссера. Для выявления жгутиков используют методы «сверхокраски», при к-рых клетки и отдельные их структуры увеличиваются в размерах и становятся видимыми под световым микроскопом. К методам «сверхокраски» относится, в частности, метод серебрения по Морозову. Он также может быть использован для окрашивания спирохет и даже наиболее крупных вирусов — вирусов оспы.

Универсальным методом О. м. является окраска по Романовскому-Гимзе (смесью азура, эозина и метиленового синего). При окрашивании простейших их цитоплазма приобретает голубой цвет, а ядра — красно-фиолетовый. Этот метод используют также при исследовании риккетсий, хламидий, спирохет, форменных элементов крови.

Источник

Методы окраски бактерий

Простые и сложные методы окраски микробов

Бактериоскопический метод исследования предусматривает изучение микроорганизмов в живом или фиксированном и окрашенном состоянии. Для изучения микроорганизмов в живом состоянии используют метод раздавленной капли и метод висячей капли. Наиболее часто применяют микроскопию бактерий в фиксированном и окрашенном состоянии.

Для приготовления фиксированного и окрашенного препарата на обезжиренное предметное стекло наносят каплю воды или изотонического раствора хлорида натрия, в которую петлей вносят исследуемый материал и распределяют его таким образом, чтобы получить тонкий и равномерный мазок диаметром около 1-1,5 см. Если исследуют жидкий материал, то его непосредственно петлей наносят на предметное стекло и готовят мазок. Мазки высушивают на воздухе.

Для фиксации используют физические и химические методы. Для фиксации мазка физическим методом предметное стекло медленно проводят 3 раза через пламя горелки. Мазки крови, мазки-отпечатки органов и тканей фиксируют химическим методом путем погружения их на 5-20 минут в метиловый или этиловый спирт, смесь Никифорова и другие фиксирующие жидкости.

Для окрашивания микробов используют простые и сложные методы. При простом методе фиксированный мазок окрашивают каким-либо одним красителем, например, водным раствором фуксина (1-2 минуты) или метиленовым синим (3-5 минут), промывают водой, высушивают и микроскопируют. Сложные методы окрашивания включают использование нескольких красителей. Это позволяет выявить определенные структуры клеток и дифференцировать одни виды микроорганизмов от других.

Окраска по Граму:

1. На фиксированный мазок наносят карболово-спиртовый раствор генцианового фиолетового через полоску фильтровальной бумаги. Через 2-3 минуты ее снимают, а краситель сливают.

2. Наносят раствор Люголя на 1-2 минуты.

3. Обесцвечивают препарат этиловым спиртом в течение 30-60 секунд до прекращения отхождения фиолетовых струек красителя.

4. Промывают препарат водой.

5. Докрашивают мазок водным раствором фуксина в течение 1-2 минут, промывают водой, высушивают и микроскопируют.

Грамположительные бактерии окрашиваются в фиолетовый цвет, грамотрицательные – в красный цвет.

При окраске по методу Грама в модификации Синевана первом этапе используют фильтровальные бумажки, пропитанные генциановым или кристаллическим фиолетовым. Для этого полоски бумаги пропитывают 1% раствором красителя и высушивают. На фиксированный мазок помещают пропитанную красителем бумажку, заливают небольшим количеством воды и выдерживают в течение 2 минут. После этого бумажку удаляют пинцетом, сливают краску и, не промывая препарат водой, наносят раствор Люголя. Последующее окрашивание проводят общепринятым методом.

Распределение микроорганизмов в зависимости от окраски по Граму:

1. Грамположительные бактерии:

— кокки (за исключением гонококков и менингококков);

— бациллы и клостридии (спорообразующие палочки);

— микобактерии, коринебактерии и листерии.

2. Грамотрицательные бактерии:

— некоторые кокки (гонококки и менингококки);

— все остальные палочковидные бактерии;

— все извитые формы (вибрионы, спириллы, спирохеты).

Структура бактериальной клетки

Структурные компоненты бактериальной клетки делят на 2 вида:

— основные структуры (клеточная стенка, цитоплазматическая мембрана с ее производными, цитоплазма с рибосомами и различными включениями, нуклеоид);

— временные структуры (капсула, слизистый чехол, жгутики, ворсинки, эндоспоры, образующиеся лишь на определенных этапах жизненного цикла бактерий).

Основные структуры.

Клеточная стенканаходится с внешней стороны от цитоплазматической мембраны. Цитоплазматическая мембрана не входит в состав клеточной оболочки. Функции клеточной стенки:

— защита бактерий от осмотического шока и других повреждающих факторов;

— определение формы бактерий;

— участие в метаболизме бактерий;

— токсичность за счет наличия поверхностных антигенов (у некоторых патогенных бактерий);

— наличие рецепторов для бактериофагов (у части бактерий).

В 1884 году датский микробиолог Ганс Христиан Грам предложил метод окраски бактерий с использованием генцианвиолета, йода, этилового спирта и фуксина. Все бактерии в зависимости от окраски по Грамму подразделяют на 2 группы: грамположительные и грамотрицательные бактерии.

Клеточная стенка грамположительных бактерий состоит из одного толстого слоя пептидогликана и тейхоевых кислот. Пептидогликан (муреин) – это многослойный линейный полимер, в котором чередуются остатки N-ацетилмурамовой кислоты и N-ацетилглюкозамина. У грамположительных бактерий содержание пептидогликана составляет от 50 до 90%. Слои пептидогликана связаны (прошиты) между собой тейхоевой и липотейхоевой кислотами. Тейхоевые кислоты выступают на поверхности клеточной стенки и являются главными антигенами грамположительных бактерий. Клеточная стенка грамположительных бактерий плотно прилегает к цитоплазматической мембране, ее толщина составляет 20-100 нм.

Грамположительные бактерии прочно фиксируют комплекс генцианвиолета и йода, не обесцвечиваются этанолом и поэтому не воспринимают дополнительный краситель фуксин, в результате чего клетка остается окрашенной в фиолетовый цвет.

Клеточная стенка грамотрицательных бактерий состоит из 2-х тонких слоев. Внутренний слой (периплазма) представлен пептидогликаномв виде тонкой непрерывной сетки. У грамотрицательных бактерий содержание пептидогликана составляет 1-10%. Наружный слой (внешняя мембрана) состоит из липополисахарида, белков и фосфолипидов. Толщина клеточной стенки грамотрицательных бактерий составляет 14-17 нм. Липополисахариды всех грамотрицательных бактерий обладают токсическими и пирогенными свойствами и называются эндотоксинами. У грамотрицательных бактерий комплекс генцианвиолета с йодом легко вымывается из клетки этанолом, и после дополнительного нанесения фуксина клетка окрашивается в красный цвет.

В некоторых условиях бактерии лишаются способности полностью или частично синтезировать компоненты клеточной стенки, в результате чего образуются протопласты, сферопласты и L-формы бактерий. Сферопласты – это бактерии с частично разрушенной клеточной стенкой с сохранением элементов наружной мембраны. Они наблюдаются у грамотрицательных бактерий. Протопласты — это формы, полностью лишенные клеточной стенки. Они образуются грамположительными бактериями. L-формы бактерий — это мутанты бактерий, частично или полностью утратившие способность синтезировать пептидогликан клеточной стенки (бактерии с дефектной клеточной стенкой). Свое название они получили от названия института Листера в Англии, где были открыты в 1935 году.

Цитоплазматическая мембрана (ЦПМ) и ее производные.Цитоплазматическая мембрана (плазмолемма) — это полупроницаемая липопротеидная структура бактериальной клетки, отделяющая цитоплазму от клеточной стенки. Она составляет 8-15% сухой массы клетки. Ее разрушение приводит к гибели клетки. При электронной микроскопии выявлено ее трехслойное строение. Цитоплазматическая мембрана представляет собой комплекс белков (50-75%) и липидов (15-20%). Основная масса липидов представлена фосфолипидами. Кроме того, в составе мембраны обнаружено небольшое ко­личество углеводов.

ЦПМ бактерий выполняет следующие функции:

— барьерная функция (молекулярное “сито”);

— избирательный перенос раз­личных органических и неорганических молекул и ионов с помощью специальных переносчиков – транслоказ или пермеаз;

— превращение клеточ­ной энергии;

— репликация и последующее разделение хро­мосомы.

В процессе роста клетки цитоплазматическая мембрана образует многочисленные впячивания (инвагинаты), получившие название мезосом. По морфологическим особенностям различают ламеллярные (пластинчатые), везикулярные (имеющие форму пузырьков), тубулярные (трубчатые) мезосомы.

Цитоплазма — это содержимое бактериальной клетки, ограниченное цитоплазматической мембраной. Она состоит из цитозоля и структурных элементов.

Цитозоль — гомогенная фракция, включающая растворимые компоненты РНК, ферменты, продукты метаболизма.

Структурные элементы — это рибосомы, внутрицитоплазматические мембраны, включения и нуклеоид.

Рибосомы — органоиды, осуществляющие биосинтез белка. Они состоят из белка и РНК. Представляют собой гранулы диаметром 15-20 нм. Одна бактериальная клетка содержит от 5000 до 50000 рибосом. Рибосомы являются местом синтеза белка.

В цитоплазме прокариот обнаруживаются различные включе­ния, представляющие запасные вещества клетки. Из полисахаридов в клетках откладываются гликоген, крахмал и крахмалоподобное вещество — гранулеза. Полифосфаты содержатся в гранулах, назы­ваемых волютиновыми, или метахроматиновыми, зернами.

Нуклеоидявляется аналогом ядра у прокариот. Он состоит из одной замкнутой в кольцо двуспиральной нити ДНК, которую рассматривают как бактериальную хромосому. У нуклеоида отсутствует ядерная оболочка.

Кроме нуклеоида в бактериальной клетке обнаружены внехромосомные генетические элементы – плазмиды, которые представляют собой небольшие кольцевые молекулы ДНК, способные к автономной репликации. Роль плазмид состоит в том, что они кодируют дополнительные признаки, дающие клетке преимущества в определенных условиях существования. Наиболее распространены плазмиды, детерминирующие признаки антибиотикорезистентности бактерий (R-плазмиды), синтез энтеротоксинов (Ent-плазмиды) или гемолизинов (Hly-плазмиды).

К временным структурам относятся капсула, жгутики, пили, эндоспоры бактерий.

Капсула — это слизистый слой на поверхности клеточной стенки бактерий. Капсула синтезируется на наружной поверхности цитоплазматической мембраны и выделяется на поверхность клеточной стенки в специфических участках.

— место локализации капсульных антигенов, определяющих вирулентность, антигенную специфичность и иммуногенность бактерий;

— защита клеток от механических повреждений, высыхания, токсических веществ, заражения фагами, действия защитных факторов макроорганизма;

— способность прикрепления клеток к субстрату.

Жгутики – это органы движения бактерий. Жгутики не являются жизненно важными структурами, поэтому могут присутствовать у бактерий или отсутствовать в зависимости от условий выращивания. Количество жгутиков и места их расположения у разных бактерий неодинаково. В зависимости от этого выделяют следующие группы жгутиковых бактерий:

— монотрихи – бактерии с одним полярно расположенным жгутиком;

— амфитрихи – бактерии с двумя полярно расположенными жгутиками или имеющие по пучку жгутиков на обоих концах;

— лофотрихи – бактерии, имеющие пучок жгутиков на одном конце клетки;

— перитрихи – бактерии с множеством жгутиков, расположенных по бокам клетки или на всей ее поверхности.

Химический состав жгутиков представлен белком флагеллином.

К поверхностным структурам бактериальной клетки относятся также ворсинки и пили. Эти структуры участвуют в адсорбции клеток на субстрате (ворсинки, пили общего типа) и в процессах переноса генетического материала (половые пили). Они образованы специфическим гидрофобным белком пилином.

У некоторых бактерий в определенных условиях образуются покоящиеся формы, которые обеспечивают переживание клеток в течение длительного времени в неблагоприятных условиях — эндоспо­ры. Они устойчивы к неблагоприятным факторам внешней среды.

Расположение спор в клетке:

— центральное (возбудитель сибирской язвы);

— субтерминальное — ближе к концу (возбудитель ботулизма);

— терминальное – на конце палочки (возбудитель столбняка).

Окраска микроорганизмов (крашение микробов) — комплекс методов и приёмов для исследования внешнего и внутреннего строения микроорганизмов, метод микробиологической техники, позволяющий различать виды микроорганизмов.

Метод широко используют в прикладной бактериологии для определения формы, размеров, строения, локализации, взаимного расположения микробов, структуры их органелл. Без окраски микробы, кроме некоторых грибов, в световой микроскоп практически не видны, вследствие их малой контрастности.

После обработки мембраны и/или органеллы микробов приобретают контрастирующую с фоном окраску.

Препараты микробов подвергают действию химических реагентов, обычно — красителей, или тетраоксида осмия. В результате физико-химического процесса взаимодействия красителя с химическими соединениями объектов, с целью искусственного придания ему определённой окраски, появляется возможность определить вид микроорганизма, или хотя бы тип его мембраны (см.

окраска по Граму).

Способы крашения разделяют на витальный, поствитальный и негативный, последний может быть витальным и поствитальным.

Витальный способ окраски

Для витального (прижизненного) крашения применяют 0,2-0,001 % водные растворы метиленового и толуоидинового синего, нейтральрот и конго красный, которые добавляют в придавленную или висячую капли культуры.

Этим способом выявляют спирохеты, простейшие, определяют подвижность бактерий, иммунное набухание капсулы, но использование его требует строгого соблюдения правил, исключающих лабораторное заражение.

Поствитальные способы окраски

Способы окраски фиксированных препаратов (поствитальные) разделяют на простые и сложные. При простых способах красящие растворы фуксина Пфейффера (экспозиция 1-2 мин), щелочного метиленового синего (3-5 мин) наносят на фиксированный препарат, так, чтобы он полностью покрыл мазок, краситель сливают, препарат промывают струйкой воды, встряхивают, высушивают и микроскопируют.

Простые способы позволяют судить о величине, форме, локализации, взаимном расположении отдельных клеток, но с их помощью нельзя установить структуру микробов и часто их дифференцированное отношение к красителям.

Из сложных способов окрашивания бактерий в основном используют дифференцированный способ Грама, выявление кислотоустойчивости по Цилю — Нельсену, определение волютиновых зёрен по Леффлеру или Нейссеру, дифференцирующий способ Романовского — Гимзы, негативно-позитивный способ определения капсулы по Гинсу — Бурри, выявление спор по Пешкову или Цилю — Нельсону и др.

Для окраски простейших применяют способ Романовского — Гимзы и окраску гематоксилин-эозином.
Грибы исследуют неокрашенными или способами Грама, Циля — Нельсона, Леффлера, Романовского — Гимзы, а также раствором Люголя, лактофуксином и др.

П. и др. Справочник по ботанической микротехнике. Основы и методы. — М.: Изд-во МГУ, 2004. — 312 с. — 2000 экз. — ISBN 5-211-06103-9. — УДК 58:57.08

Методы окраски. Окраску мазка производят простыми или сложными методами. Простые заключаются в окраске препарата одним красителем; сложные методы (по Граму, Цилю — Нильсену и др.) включают последовательное использование нескольких красителей и имеют дифференциально-диагностическое значение.

Отношение микроорганизмов к красителям расценивают как тинкториальные свойства. Существуют специальные методы окраски, которые используют для выявления жгутиков, клеточной стенки, нуклеоида и разных цитоплазматических включений.

При простых методах мазок окрашивают каким-либо одним красителем, используя красители анилинового ряда (основные или кислые).

Если красящий ион (хромофор) — катион, то краситель обладает основными свойствами, если хромофор — анион, то краситель имеет кислые свойства. Кислые красители — эритрозин, кислый фуксин, эозин. Основные красители — генциановый фиолетовый, кристаллический фиолетовый, метиленовый синий, основной фуксин. Преимущественно для окраски микроорганизмов используют основные красители, которые более интенсивно связываются кислыми компонентами клетки. Из сухих красителей, продающихся в виде порошков, готовят насыщенные спиртовые растворы, а из них — водно-спиртовые, которые и служат для окрашивания микробных клеток.

Микроорганизмы окрашивают, наливая краситель на поверхность мазка на определенное время. Окраску основным фуксином ведут в течение 2 мин, метиленовым синим — 5—7 мин. Затем мазок промывают водой до тех пор, пока стекающие струи воды не станут бесцветными, высушивают осторожным промоканием фильтровальной бумагой и микроскопируют в иммерсионной системе.

Если мазок правильно окрашен и промыт, то поле зрения совершенно прозрачно, а клетки интенсивно окрашены.

Сложные методы окраски применяют для изучения структуры клетки и дифференциации микроорганизмов. Окрашенные мазки микроскопируют в иммерсионной системе. Последовательно нанести на препарат определенные красители, различающиеся по химическому составу и цвету, протравы, спирты, кислоту и др.

Существуют несколько основных окрасок: по Граму, по Цилю-Нельсону, по Ауески, Нейссера, Бури-Гинса.

Механизм и этапы окраски по Граму

На фиксированный мазок нанести карболово-спиртовой раствор генцианового фиолетового через полоску фильтровальной бумаги. Через 1-2 мин снять ее, а краситель слить.

2. Нанести раствор люголя на 1-2 мин (йод)

Обесцветить этиловым спиртом в течении 30-60 с до прекращения отхождения фиолетовых струек красителя.

4. Промыть водой

5. Докрасить водным р-ом фуксина в течении 1-2 мин, промыть водой, высушить и микроскопировать.

* Грамположительные бактерии окрашиваются в темно-фиолетовый цвет, грамотрицательные — в красный.

Механизм и этапы окраски по Цилю-Нельсону

На фиксированный мазок нанести карболовый р-р фуксина через полоску фильтровальной бумаги и подогреть до появления паров в течении 3-5 мин

2. Снять бумагу, провыть мазок водой

3. Нанести 5% р-р серной кислоты или 3% р-р смеси спирта с хлороводородной кислотой на 1-2 мин для обесцвечивания.

4. Промыть водой

5. Докрасить мазок водным р-ом метиленового синего в течении 3-5 мин

Промыть водой, высушить и микроскопировать

* Некислоустойчивые – обесцвечиваются и окр. метиленовым синим в голубой цвет, а кислоустойчивые остаются окрашенными фуксином в красный.

Возбудитель чумы

Возбудитель – Yersinia pestis.

грамотрицательные палочки, овоидной формы, окрашиваются биполярно.

Подвижны, имеют капсулу, спор не образуют Факультативные анаэробы. Хорошо культивируются на простых питательных средах. Ферментируют большинство углеводов без образования газа. Два типа колоний — молодые и зрелые. Молодые с неровными краями. Зрелые колонии крупные, с бурым зернистым центром и неровными краями.

Биохимические свойства: фенментативная активнсть высокая: ферментация до кислоты ксилозу, синтез плазмокоагулазы, фибринолизина, гемолизина, лецитиназу, сероводород.

чувствителен к антибиотикам нестоек к окружающей среде при высокой температуре.

Клинические особенности: Инкубационный период – несколько часов до 8 сут. Различают локальные – кожно-бубонная, бубонная; внешне-диссеминированные – первично-легочная, вторично-легочная и кишечная; генерализованная – первично-септическая, вторично-септическая формы чумы. Региональная лимфоаденопатия, энтероколиты, реактивные артриты, спондилит, лихорадка.

Эпидемиология: Чума — классический природноочаговый зооноз диких животных.

Основные носители в природе — сурки, суслики, в городских условиях — крысы. В передаче возбудителя — блохи животных, способные заражать человека.

Иммунитет: клеточно-гуморальный, ограничен по длительности

Из исследуемого материала готовят мазки, окрашивают по Граму и водным раствором метиленового синего. Бактерии чумы представляют собой грамотрицательные палочки овоидной формы Бактериологическое исследование. Исследуемый материал засевают на чашки с питательным агаром. На бульоне бактерии образуют пленку; ферментируют многие сахара до кислоты, индола не образуют, желатин не разжижают.

Биопроба. Проводится для выделения чистой культуры из материала, загрязненного посторонней микрофлорой.

Экспресс-методы лабораторной диагностики:

1.Иммунофлюоресцентный метод позволяет обнаружить присутствие возбудителя как в патологическом материале, так и в объектах окружающей среды (вода, воздух), а также в пищевых продуктах и эктопаразитах.

2.РПГА — для обнаружения антигенов бактерий в материале с помощью стандартной противочумной сыворотки, антитела которой нагружены на эритроциты.

Лечение: антибиотики Профилактика: специфическая профилактика — живая ослабленная чумная вакцина EV.

Чумной бактериофаг – при идентификации Y.pestis.

Чумная сухая вакцина – высушенная живая культура Y.pestis вакцинного штамма EV, используется для профилактики чумы.

Методы окраски препаратов. Окраска по методу Синева и метиленовым синим

В лаборатории применяются анилиновые краски, приготавливаемые из анилина и других производных каменноугольного дегтя.
Для окраски препаратов применяются основные и кислые краски. Основные краски хорошо воспринимаются микробами и ядерным хроматином. Кислые краски хорошо окрашивают протоплазму и слабее микроорганизмы.

Кислыми красителями называются свободные окрашенные кислоты или соли этих кислот, обычно соли натрия. Основные красители — это соли красящих оснований, чаще всего хлоргидраты.

Насыщенные спиртовые растворы красок, из которых готовят рабочие краски, хранят в стеклянных банках с притертой пробкой.

Изготовление растворов заключается в следующем.

В флакон с притертой пробкой насыпают 10 г сухой краски, наливают 100 мл 96° спирта ректификата и при ежедневном взбалтывании оставляют раствор на несколько дней, после чего эта краска может быть употреблена для спирто-водных растворов, необходимых для окраски препаратов.

Наиболее часто употребляющиеся растворы красок:

Карболовый фуксин Циля

10 мл насыщенного спиртового раствора фуксина, 90 мл 5% карболовой кислоты.

Разведенный фуксин (фуксин Пфейффера)

10 мл карболового фуксина Циля, 90 мл дистиллированной воды.
Этот раствор при хранении портится, поэтому его готовят по мере надобности и хранят не более суток.

Щелочная метиленовая синька (синька Леффлера)

30 мл насыщенного спиртового раствора метиленовой синьки, 1 мл 1 % раствора едкого калия.

Карболовый раствор кристалл-виолета

Краски — 1 г
Спирта ректификата 96°— 10 мл Кристаллической карболовой кислоты — 2 г Дистиллированной воды — 100 мл

Краску растирают с карболовой кислотой, добавляя спирт, а потом дистиллированную воду, через сутки фильтруют.

Примечание. Вместо кристалл-виолета можно пользоваться насыщенными растворами метил-виолета либо генцианвиолета. Последний при окрашивании выпадет в осадок, в практике он менее применим.

Окраска по методу Синева

Для окраски применяются кусочки фильтровальной бумаги, пропитанные спиртовым раствором краски. Листы фильтровальной бумаги, разложенные на стекле, обливают 1—2% раствором (в 96° спирте) краски и затем окрашенную высушенную бумагу разрезают на кусочки размером 2X4 см и сохраняют в стеклянных темных банках с притертой пробкой. Приготовленные таким способом бумажки не теряют окрашивающих свойств весьма продолжительное время.
Приготовленные препараты красятся в зависимости от исследуемого материала простым либо сложным методом.

К простому методу относится: окраска разведенным фуксином (фуксином Пфейффера), окраска щелочной метиленовой синькой.
Окраска разведенным фуксином. На приготовленный на предметном стекле фиксированный на пламени и остывший исследуемый препарат наливают на 1—2 минуты разведенный фуксин. Затем препарат промывают водой и высушивают на воздухе.

Окрашивание метиленовой синькой. На приготовленный, высушенный и фиксированный мазок наливают пипеткой метиленовую синьку на 2—3 минуты, после чего препарат смывают водой и высушивают.

Ядра при этом окрашивании более интенсивно воспринимают окраску и резко выделяются над протоплазмой, которая окрашивается слабее.

К сложным методам окраски относятся окрашивания одного и того же препарата растворами нескольких красок в определенном порядке для дифференциации микробов вследствие их сродства к определенным краскам.

В число сложных методов входят: окраска кислотоустойчивых микробов по Циль-Нильсену, окраска по Граму, окраска па Романовскому-Гимза и другие.

Окраска метиленовым синим

Техника. Чистое предметное стекло смачивают кипящим насыщенным водным раствором метиленового синего.

Когда краска на стекле высохнет, его протирают сухой тряпочкой до нежно-голубой окраски. На подготовленное таким образом стекло наносят каплю исследуемой культуры, покрывают покров­ным стеклом и микроскопируют.

Микроскопическая картина. Микробы постепенно окрашива­ются в бледно-голубоватый цвет.

Окраска нейтральным красным

Приготовление красителя: насыщенный на хо­лоду водный раствор нейтральрота разводят физиологическим раствором хлористого натрия 1:100.

Каплю исследуемого материала смешивают на предметном стекле с каплей разведенного нейтральрота. Препарат покрывают по­кровным стеклом и микроскопируют с иммерсией.

Микроскопическая картина. Микробы постепенно окрашива­ются в розоватый цвет.

Негативный способ окраски живых бактерий

Для окраски используют тушь, негрозин, конго крас­ный.

Тушь чертежную разводят дистиллированной водой в соот­ношении 1:10. Конго красный используют в виде 3% водного раствора.

Метод Бурри

Техника. Каплю исследуемой культуры смешивают на пред­метном стекле с каплей туши, затем с помощью другого стекла, поставленного к первому под углом в 45, делают тон­кий мазок по принципу приготовления мазков из крови.

Мазок высушивают на воздухе и микроскопируют нефиксированным.

При использовании раствора конго рот после высушива­ния мазок обрабатывают 1% раствором соляной кислоты в аб­солютном алкоголе, затем высушивают и микроскопируют.

Микроскопическая картина: на окрашенном фоне ясно видны неокрашенные светлые микробные клетки.

ОКРАСКА ФИКСИРОВАННЫХ ПРЕПАРАТОВ МИКРООРГАНИЗМОВ

В микробиологической работе наиболее употребительны способы окраски фиксированных микроскопических препаратов, кото­рые в основном можно разделить на две группы: ориентировоч­ные, или простые, и дифференциальные, выявляющие химические и структурные особенности того или иного вида микроорганизма.

Простые методы окраски микробов

Простые методы окраски препаратов предполагают использование одного анилинового красителя и позволяют изучить такие морфологические признаки микроорганизма, как форму, размеры, расположение в мазке. Для этих целей используется ряд красителей: метилено­вый синий, фуксин и др.

Окраска спиртово-водным раствором метиленового синего

Приготовление раствора: красителя 1 г, 95% спирта 10 мл, дистиллированной воды 100 мл.

Техника. Нанести на фиксированный мазок на 3-5 минут.

Все клетки окрашиваются в синий цвет.

Окраска водным раствором метиленового синего

Приготовление раствора: красителя 1 г, дистиллированной воды 1000 мл.

Техника. Нанести на фиксированный мазок на 5-10 минут.

Микроскопическая картина. Окраска дает нежные отчетливые препа­раты клеток, окрашенных в синий цвет.

Окраска щелочным метиленовым синим (синим Леф­флера)

Приготовление щелочного раствора метиленового синего: дистиллированной воды 100 мл, 10% раствора едкого калия 2 капли, насыщенного (7%) раствора метиленового синего 30 мл или 2) метиленового синего 3 г, 95% спирта 20 мл, 1 % раствора едкого калия 1 мл, дистилли­рованной воды 100 мл.

Это стойкий и хорошо красящий раствор.

Техника. Нанести на фиксированный мазок на 3-10 минут.

Микроскопическая картина. Дает окраску в синий цвет различной интенсивности для разных видов микроорганизмов и тканевых элементов (рис.13).

Окраска разведенным карболовым фук­сином

Техника. На зафиксированный мазок наносят фуксин Циля, разведенный непосредственно перед окраской, дистилли­рованной водой в соотношении 1:10. Выдерживают 1-2 минуты, после чего смывают водопроводной водой, высушивают и микро­скопируют.

Микроскопическая картина. Все клетки равномерно окра­шиваются в розово-красный цвет.
Приготовление и окраска препаратов для люминесцентной микроскопии

Препараты для люминесцентной микроскопии готовят так же, как для световой.

Это относится и к их фик­сации. Окраска препаратов отличается тем, что для люми­несцентной микроскопии применяют специальные красители – флуорохромы. Их отличительная особенность – способность све­титься под воздействием ультрафиолетовых и сине-фиолетовых лучей. Среди флуорохромов встречаются самые разнообразные органические вещества. Для окраски микроскопических препаратов применяют очень слабо концентрированные.

Источник