Способ получения алкалоидов спорыньи
1. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АЛКАЛОВДОВ СПОРЫНЬИ путем ферментации продуцента Claviceps purpurea в аэробных условиях на питательной среде. содержащей источники углерода и азота , генеральные соли, с последующим выделением целевого продукта, отличающийся тем, что, с целью направленного биосинтеза алкалоидов типа эргокорнина и повышения содержания /3-эргокриптина, в качестве продуцента используют штамм Claviceps purpurea MNG 00186, а ферментацию ведут при 20-26°С и рН 5,25 ,8. 2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что, с целью дополгнительного повьшения выхода целе вых . продуктов, ферментацию ведут в присутствии 0,2 г/100 мл валика I или 0,12 г/100 мл валИна и изолейО ) цина при соотношении последних 5:1.
РЕСПУБЛИК зж С 12 Р 1 Об А 61 К 35/66
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР
ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ (21) 3245499/28-13 (22) 06.02.81 (31) 282/80 (32) 08.02.80 (33) ВНР (46) 15.10.84. Бюл. N — 38 (72) Геза Вак, Янош Кишш, Жужа Лендьель, Лайош Надь, Ева Удварди Надь, Карой Залаи и Эржебет Жока (BHP) (71) Рихтер Гедеон Ведьесети Дьяр PT (ВНР) (53)д678.044.29 (088.8) (56) 1. Патент Бельгии N 824987, кл . С 12 D, 1977 (прототип) . (54) (57) t. СПОСОБ ПОЛУЧЕБИ АЛКАЛОИДОВ СПОРЫНЬИ путем ферментации продуцента Claviceps purpurea в аэробных условиях на питательной среде, „„SU„„iИВВЯ A содержащей источники углерода и азота, минеральные соли, с последующим выделением целевого продукта, отличающийся тем, что, с целью направленного биосинтеза алкалоидов типа эргокорнина и повышения содержания j3-эргокриптина, в качестве продуцента используют штамм
Claviceps purpurea MNG 00186, а ферментацию ведут при 20-26 С и рН 5,25,8.
2. Способ поп. 1, отличаюшийся тем, что, с целью допол.— нительного повышения выхода целе— вых продуктов, ферментацию ведут в присутствии 0,2 г/100 мп валина или 0,12 г/100 мп валина и изолейци на при с оот ношении п осл едних 5: 1 .
Изобретение относится к медицине в частности к способам получения алкалоидов спорыньи.
Известен способ получения алкалоидов спорыньи путем ферментации продуцента Claviceps purpurea в аэробных условиях на питательной среде, содержащей источники углерода и азота, минеральные соли, с последующим выделением целевого продукта 1 3.
Однако известный способ не обеспечивает получения повышенного содержания р -эргокриптина в алкалоид ной смеси.
Белью изобретения является направ- 15 ленный биосинтез алкалоидов типа эргокорнина и повышение содержания
Поставленная цель достигается тем, что согласно способу получения алка- 2О лоидов спорыньи путем ферментации продуцента Claviceps purpurea в аэробных условиях на питательной среде, содержащей источники углерода и азота, минеральные соли, с последующим выделением целевого продукта, в качестве продуцента используют штамм
С1aviceps purpurea MNG 00186, а ферментацию ведут при 20-26 С и рН
Ферментацию ведут в присутствии
О, 2 г/100 мл валина или G, 12 г/100 мл валина и изолейцина при соотношении последных 5:1 °
Для осуществления способа используют новый штамм Claviceps purpurea
LING 00186, который получен путем многократного повторения операции выделения и обогащения. Штамм хранится в национальной коллекции куль.
4О тур микроорганизмов MNG под номером
00186 и характеризуется следующими культурально-морфологическими и физиолого — биохимическими свойствами
На применяемой для отбора агаровой среде, содержащей крахмал и
Фриптофан, через 10 дней наблюдаются четко разграниченные колонии со складчатой поверхностью и оранжево5О розовой окраской диаметром 6-8 мм.
Через 20 дней диаметр колоний состав ляет 20-25 мм, колонии имеют в середине возвышение и радиальную складчатость, цвет — розово-лиловый. Ниж- 55 няя сторона колоний темно коричневая, питательная среда вокруг них окрашивается в лиловый цвет .
На солодовом агаре через 10 дней штамм образует светло-бежевые когонии диаметром 1-2 мм и правильной полусферической формы. Через 20 дней колонии имеют диаметр 2-4 мм, рост слабый, окраска изменяется до коричневой.
На Sf-агаре колонии штамма через
10 дней четко разграничены, в направлении к середине изборождены складками, в середине имеют остроконечное возвышение,,циаметр колоний
8-12 мм. Вершина имеет высоту 3-5 м ..
Окраска колоний бежевая до светлокоричневой. Через 20 дней поверхность колоний твердее и по направлению к краям изборождена разветвляющимися складками, вершина становится кратерообразной, Колонии имеют св=-1— ло-коричневую окраску с оттенком какао, диаметр различный (25-40 мм), высота 6-8 мм, Колонии с трудом отделяются от поверхности агара, не образуют спор.
Микроскопическая характеристика амма в жидкой к ул ьт ур е .
После 40 ч культивирования в питательной спеце СК имеются колонии из немногих клеток %ли большей частью отдельные клетки. Величина клеток 48 х 8-20р.. клетки п„ линдрические, округленнь1е или неправильной формы.
Деление на конце клеток и путем бокового ветвления. Ряды клеток короткие, состоят из нескольких клеток.
Под фазовоконтрастным микроскопом клетки оказываются сильно гранулированными, более старые клетки содержат вакуоли. Спорообразования нет.
В St-питательной среде после 40 ч культивирования наблюдается идентичная картина, при этом на питательной среде имеется более частое образование колоний или рядов клеток. Отдельные клетки более крупные, более старые клетки не имеют вакуолей. физиолого-биохимические свойства.
Разрушает с помощью фермента p— фруктофуранозидазь. сахарозу с получением промежуточных олигосахаридов, хорошо использует лимонную кислоту, образует пигмент антрахинновогG характера, состоящий в первую очередь из оксиантрахинонов.
При культ.;гвировании на питательной среде, содержащей сахар и аммониевую соль органической кислоты, штамм продуцирует алкалоиды, 25-307. образующейся смеси алкалоидов пред—
1,0 ставляет собой pg -эргокриптин, основное количество (55-60X) — эргокорнин, оставшаяся часть — -эргокриптин.
Кроме характерных пептидньгх алкалоидов. штамм образует только эргометрин.
Пример 1 . Выращенную на
St-агар-питательной среде культуру
Ciaviceps purpurea NNG-00186 инокулируют на 100 мл питательной среды
GK находящейся в колбе Эрленмейера 1О (500 мл) и инкубируют при 24 С на встряхивающем аппарате (300 встряхиваний в 1 мин) в течение 4 дней. Полученную культуру по 10 мл повторно инокулируют в восьми других колбах, содержащих по 100 мл St rèòaòåëúíoé среды. Эти культуры ферментируют при о
24 С на встряхивающем аппарате в течение 7 дней. В 4 колбы не прибавляют исходное вещество, к содержимому других 4 колб в начале ферментации прибавляют по 2 r валина в качестве исходного вещества. На 7 день ферментацию прекращают. Культуральные жидкости без исходного вещества объединяют, определяют содержание алкалоидов в них. Содержание эргскорнина состав ;,res 80 g/ìë9 с -эргокриптина — 15 /мл и р -эргокриптина
Приготовленные вместе с исходным веществом культуральные жидкости также объединяют и определяют содержание алкалоидов. Эти жидкости содержат.
)(/мл эргокорнин 250, с -эргокриптин
25 и /э -эргокриптин 30.
Применяемые питательные среды.
Лимонная кислота, r
Кислый фбрсфорнокис— лый калий (первичный), г
Сульфат магния, г
Гидроокись аммония . Вода, мл
В колбы наливают до 84 или 840 мл питательной среды и в стерильных условиях смешивают соответственно с 16 и
i60 мл 507-ной лимонной кислоты. 50
Сахароза, r 100, 0
Янтарная кислота,г 10,0
Кислый фосфорнокислый калий (п ер вич ный), r 55
Нитрат аммония, г
ХлopHe rü 1 калии, 9 4
Гидроокись аммония До рН 5, 2-5,3
Вода, мл До 1000
Питательную среду стерилиэуют порциями по 100 мл в колбах Эрленмейера или в количестве 100 л в полупроизвод» ственном ферменторе. St àãàð-питательная среда (Blake) отличается от жидкой питательной среды St тем9 что к ней прибавляют 25 г/л порошка агара.
После добавки ar apa питательную среду кипятят, порциями по 150 мл наливают в бутылочки и стерилизуют.
ff p и м e p 2. Типичные выращенные на St-агар-питательной среде двадцатидневного возраста колонии
Claviceps purpurea ИИС 00186 отделяют от поверхности агара, гомогенизируют в 20 мл стерильного физиологичес кого раствора поваренной соли и 10мл суспензии прибавляют к f00 мл предварительно простерилизованной находящейся в колбе Зрленмейера (500 мл)
St-питательной среды. Культуру культивируют в течение б дней при 24 С на встряхивающем аппарате и затем
pовторно инокулируют на 100 мл находящейся в колбе Эрленмейера (500 мл) питательной среды ТС-54. После 3 дней ферментации на встряхивающем аппарате 10 мл культуры повторно инокулируют на f00 мл находящейся в колбе
Зрленмейера (500 мл) простерилизовачной St-питательной среды. Эту культуру при укзанных условиях культивируют на встряхивающем аппарате в течение 7 дней, После этого она содержит следующие количества алкалои- : у/woI эргокорнин 150, криптин 40,и р-эргокриптин 90. !
Пример 3. Двадцатипятидневную культуру Claviceps purpurea NNG
00186 íà St-агар — питательной среде удаляют, соскребая, с поверхности агара и гомогенизируют в 100 мл физиологического раствора поваренной соли.
Полученной суспензией инокулируют.
1 л питательной среды GK предварительно простерилиэованной в колбе
Эрленмейера объемом 3 л . Культуру встряхивают при 24 С в течение 44
Затем культуру помещают в. фермеитор объемом 15 л, в котором находится 1 О л пи тат ел ь ной ср еды ТС -54 . Фер— ментируют при 24 С подаче 0,25л/л мин воздуха и 240 об/мин. Через 3 дня культуру переносят в кислотостойкий лабораторный ферментор (150 л).
f котором находится 100 л St-питательной ) ОО r валина и 20 г изолейцисреды. Эту культуру культивируют на. при 22 С 150 об/мин и 0,35 л/л мин После ферментации в течение шести подводимого воздуха в течение 6 дней. дней культуральная жидкость содержит
На 2 —, 3- и 5-й день к культу- 5 у/мп: зргокорнин 320, c(, -эргокриптин ральной жидкости прибавляют по 60 и Р -эргокриптин 160.
Редактор Л.Веселовская Техред Л.Коцюбняк Корректор С.Черни
Заказ 7480/46 Тираж 521 Подписное
ВНИИПИ Государственного комитета СССР по деламизобретений и открытий
113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5
Филиал ППП»Патент», г. Ужгород, ул. Проектная, 4
Источник
Способ получения алкалоидов спорыньи Советский патент 1984 года по МПК C12P1/06 A61K35/66
Описание патента на изобретение SU1119609A3
Изобретение относится к медицине в частности к способам получения алкалоидов спорыньи.
Известен способ получения алкалоидов спорыньи путем ферментации продуцента Claviceps purpurea в аэро ных условиях на питательной среде, содержащей источники углерода и азота, минеральные соли, с последующим выделением целевого продукта L1
Однако известный способ не обеспечивает получения повышенного содержания з-эргокриптина в алкалоидной смеси.
Целью изобретения является направленный биосинтез алкалоидов типа эргокорнина и повыше 1ше содержания (Ь -эргокриптина.
Поставленная цель достигается тем что согласно способу алкалоидов спорыньи путем ферментагщи продуцента Claviceps purpurea в аэробных условиях на питательной среде, содержащей источники углерода и азота, минеральные соли, с последующим вьц;елением целевого продукта, в качестве продуцента используют штамм Claviceps purpurea MNG 00186, а ферментацию ведут при 20-26С и рН 5,2-5,8,
Ферментацию ведут в присутствии 0,2 г/100 МП валина или 0,12 г/100 м валина и изолейцина при соотношении последных 5:1,
Для осуществления способа используют новый штамм Claviceps purpurea MNG 00186, который получен путем многократного повторения операции выделения и обогащения. Штамм хранится в национальной коллекции культур микроорганизмов MNG под номером 00186 и характеризуется следующими культурально-морфйлогическими и физиолого-биохимическими свойствами
На применяемой для отбора агаровой среде, содержащей крахмал и Фриптофан, череЪ 10 дней наблкщаются четко разграниченные колонии со складчатой поверхностью и оранжеворозовой окраской диаметром 6-8 мм. Через 20 дней диаметр колоний состав ляет 20-25 мм, колонии имеют в середине возвышение и радиальную складчатость, цвет — розово-лиловый. Нижняя сторона колоний темно-1соричневая питательная среда вокруг них окрашивается в лиловый цвет.
На солодовом агаре через 10 дней штамм образует светло-бежевые колонии диаметром 1-2 мм и правильной полусферической формы. Через 20 дней КОЛОНИИ имеют диаметр 2-4 мм, рост слабый, окраска изменяется до коричневой ,
На Sf-arape колонии штамма через 10 дней четко разграничены, в направлении к середине изборождены складками, в середине имеют остроконечное возвышение, диаметр колоний 8-12 мм. Вершина имеет высоту 3-5 , Окраска колоний бежевая до светлокоричневой. Через 20 дней поверхность колоний твердеет и по направлению к краям изборождена разве вляюШJ миcя складка1чи5 вершина становится кратерообразной. Колонии имеют CBSTло-коричневую окраску с оттенком какао, диаметр различный (25-40мм), высота 6-8 мм. Колонии с трудом отделяются от поверхности агарНэ не образуют спор.
Микроскопическая характеристика , Птамма в жидкой культуре. —
После 40 ч культивирования в питательной соеде GK имеются колонии из немногих клеток или большей частью отдельные клетки. Величина клеток 48 X 8-20/ч-J клетки и;-шиндрические5 округленные или неправртльной формы. Деление на конце клеток и путем бокового ветвления. Ряды клеток короткие, состоят из нескольких клеток. Под фазоБоконтрастным микроскопом клетки оказываются сильно гранулиро- ванными, более старые клетки содержат вакуоли. Спорообразования нет.
В St-питательной среде после 40 ч культивирования наблюдается идентичная картина, при этом на питательной среде имеется более частое образование колоний или рядов клеток.Отдельные клетки более крупные, более старые клетки не имеют вакуолей.
Разрушает с помощью фермента /Э фруктофуранозидазы сахарозу с получением промежуточных олигосахаридов, орошо использует лимонную кислоту, образует пигмент антрахиннового характера, состоящий в первую очередь из оксиантрахинонов.
При культйвироаании на питательной среде, содержащей сахар и аммониевую соль органической кислоты, пггамм продуцирует алкалоиды, 25-30% образукнцейся смеси алкалоидов представляет собой fj -эргокриптин, осно ное количество (55-60%) — эргокорнин оставшаяся часть — -эргокриптин. Кроме характерных пептидных алкалоидов, штамм образует только эргометрин Пример 1 , Выращенную на St-агар-питательной среде культуру Claviceps purpurea MNG-00186 икокулируют на 100 МП питательной среды GK, находящейся в колбе Эрленмейера (ЗОО мл) и инкубируют при на встряхивающем аппарате (300 встряу:кваний в 1 мин) в течение 4 дней. Полученную культуру по 10 МП повторна инокулируют в восьми других колбах, содержаищх по 100 мл St-питательной среды/ Эти культуры ферментируют при 24°С на встряхивающем аппарате в те чение 7 дней. В 4 колбы не прибавляют исходное вещество, к содержимому других- 4 колб в начале ферментации прибавляют по,2 г валина в ка честве исходного вещества. На 7 ден ферментацию прекращают. Культуральные жидкости без исходного вещества объединяют определяют содержание алкалоидов в FCHX. Содержание эргокорнина cocTaejiifer 80 -у/мп,; о6-эрго криптина — и э-эргокриптина ЗО/мп. Приготовленные вместе с исходным веществом культуральные жидкости так же объединяют и опредеаяют содержани алкалоидов. Эти жидкости содержат. /мл sproKopm-iH 250,, ei-эргокриптин 25 и уэ-эргокриптин 30, Применяемые питательные среды. Питательная среда: Трипказин,. г7,; О Лимонная кислота, г4,0 Кислый форсфорнокислый калий (первичный), г Сульфат магния, г Гидроокись аммония ДорН 5,7-5 До 840 Вода, мл В колбы наливают по 84 или 840 м питательной среды и в-стерильньк ус виях смешивают соответственно с 16 160 МП 50%-ной лимонной кислоты. St-питательная среда: Сахароза, г100,0 Янтарная кислота,г10,0 Кислый фосфорнокислый калий (первичный) 5г0,25 Сульфат магния,г0,25 Нитрат аммония, г Хлористьй< калий, г Гидооокись аммония ДорН 5, 2-5,3 Вода, Mil, До 1000 Питательную среду стерилизуют пор-циями по 100 мл в колбах Эрленмейера или в количестве 100 л в полупроизврД ственном ферменторе. St-агар-питательная среда (Blake) отличается от жидкой питательной среды St TeMj. что к ней прибавляют 25-г/л порошка агара. После добавки агара питательную среду кипятят, порциями по 150 мл наливают в бутылочки и стерилизуют. Пример 2. Типичные выращенные на St-агар-питательной среде двадцатидневного возраста колонии Claviceps purpurea ШС 00186 отделяют от поверхности агара, гомогенизируют в 20 мл стерильного физиологичес кого раствора поваренной соли и 10 мп суспензии прибавляют к 100 мл предварительно простерилизованной находящейся в колбе Эрленмейера (500 мл) St-питательной среды. Культуру культивируют в течение 6 дней при 24 С на встряхивающем аппарате и затем повторно инокулируют на 100 мл находящейся в колбе Эрленмейера (500 мл) питательной среды ТС-54, После 3 дней ферментатдаи на встряхивающем аппарате 10 МП культуры повторно инокулируют на 100 МП находящейся в колбе Эрлеимейера (500 мл) простерилизованной St-питательной среды. Эту культуру .при укзанньгх условиях культивируют на встряхивающем аппарате в течение 7 днейь После этого она содержит следующие количества алкалои-дов, у/мл: эргокор шн 150, oi,-3proкриптин 40,и /i-эргокриптин 90. Пример 3. Двадцатипятидневную культуру Claviceps purpurea MNG 00186 на St-агар-питательной среде удаляют, соскреЬая, с поверхности агара и гомогенизируют в 100 мл физиологического раствора поваренной соли. Полученной суспензией инокулируют. I л питательной среды GK предварительно простерилизованной в колбе Эрленмейера объемом 3 л. Культуру встряхивают при в течение 44 Затем культуру помещают в. ферментор объемом 15 л, в котором находится 10 л питательной среды ТС-54. Ферментируют при 24°С подаче 0,25 л/л мин воздуха и 240 об/мин. Через 3 дня культуру переносят в кислотостойкий лабораторньш ферментор (150 л), а
котор ом находится 100 л.81:-питательнойЮО г вааина и 20 г изолейцисреды. Эту культуру культивируют„a.
при 22°С 150 об/мин и 0,35 л/л минПосле ферментации в течение шести
подводимого воздуха в -(еченке 6 дней.дней культуральная жидкость содержит
На / -, 3- и 5-й день к культу-5 -у/мп: эргокорнин 320, оС-эргокриптин
рапьной жидкости прибавляют по60 и /3-эргокриптин 160,
Похожие патенты SU1119609A3
| название | год | авторы | номер документа |
|---|---|---|---|
| Способ получения алкалоидов спорыньи | 1973 |
| SU562205A3 |
| Способ получения эргоалкалоидов (его варианты) | 1981 |
| SU1222198A3 |
| Способ получения препарата для кормления жвачных животных | 1985 |
| SU1625317A3 |
| Способ утилизации навозной жижи свиней на корм | 1979 |
| SU1058484A3 |
| Способ конструирования плазмидного вектора рНС314 или рНС312, или рНС624 | 1984 |
| SU1443806A3 |
| Способ получения алкалоидов спорыньи | 1976 |
| SU845827A1 |
| Способ получения анорексогенного средства из сыворотки крови,обладающего эндогенным эффектом насыщения для регулирования потребления пищи через центральную нервную систему | 1979 |
| SU1316550A3 |
| Способ получения 2-бром- @ -эргокриптина или его кислотно-аддитивных солей | 1987 |
| SU1528320A3 |
| Способ получения производных эргол-8-ена или эрголина или их солей | 1982 |
| SU1072806A3 |
| Способ получения сисомицина и штамм @ @ @ 1/109-продуцент сисомицина | 1980 |
| SU1200854A3 |
Реферат патента 1984 года Способ получения алкалоидов спорыньи
1. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АЛКАЛОВДОВ СПОРЫНЬИ путем ферментации продуцента Claviceps purpurea в аэробных условиях на питательной среде. содержащей источники углерода и азота, генеральные соли, с последующим выделением целевого продукта, отличающийся тем, что, с целью направленного биосинтеза алкалоидов типа эргокорнина и повышения содержания /3-эргокриптина, в качестве продуцента используют штамм Claviceps purpurea MNG 00186, а ферментацию ведут при 20-26°С и рН 5,25,8. 2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что, с целью дополгнительного повьшения выхода целе вых. продуктов, ферментацию ведут в присутствии 0,2 г/100 мл валика I или 0,12 г/100 мл валИна и изолейО) цина при соотношении последних 5:1.
Источник
