Химический способ фиксации мазка

6.2. Микроскопия микроорганизмов в окрашенном виде

Тела микробных клеток в преобладающем большинстве слу­чаев прозрачны и для того, чтобы увидеть четкие контуры микробных клеток, применяют метод биологического окраши­вания.

Окрашенные тела микроорганизмов, отчетливо выделяясь на серебристо-белом фоне препарата, позволяют ориентиро­вочно оценивать состав микробного пейзажа, изучаемого объ­екта; при применении специальных методов окраски исследу­ют некоторые анатомические структуры клетки: наличие кап­сул, спор, жгутиков, ядерного вещества, мембраны и т. д.

В качестве основных красок в микробиологии используют производные каменноугольной смолы, главным образом искус­ственные органические красители, получаемые из анилина (С₆Н₅NН₂,), его производных и других ароматических аминов, ряда нафталина и антрацена.

В зависимости от химической природы эти красители под­разделяются на две группы: катионные, обладающие свойства­ми оснований, и анионные (кислые). Соответственно этому они окрашивают противоположно заряженные структуры кле­ток. Так, например, ядерная ДНК клеток, относящаяся к кис­лым субстратам, будет окрашиваться катионными красками: кристаллметилвиолетом или сафранином, а цитоплазма клет­ки, обладающая щелочной реакцией, – кислыми красителями: фуксином, пикриновой кислотой и другими анионными крас­ками.

В табл. 6.1 представлены наиболее употребляемые красители катионной и анионной групп.

Таблица 6.1. Наиболее употребляемые красители катионной и анионной групп

Нигрозин (индийские чернила)

Из сухих анилиновых красок готовят обычно насыщенные спиртовые растворы, которые, не изменяя своих свойств, могут храниться длительное время. Из насыщенных спиртовых рас­творов для окрашивания бактерий изготавливаются рабочие, разбавленные спиртовые растворы нужной концентрации.

Для окрашивания микроорганизмов пользуются преимуще­ственно основными красителями.

6.2.1. Приготовление мазков для окрашивания

Мазки готовят из культур микробов, клинического материа­ла (мокрота, гной, моча, кровь и др.), из биоптатов, органов трупов.

Техника приготовления мазков определяется характером ис­следуемого материала.

1. Приготовление мазков из микробных культур с жидкой питательной среды и из жидкого патологического материала (осадка центрифугированной мочи, ликвора и др.). Маленькую каплю исследуемой жидкости наносят бактериологической петлей на предметное стекло и круговыми движениями последней распределяют равномерным слоем в виде кружка диаметром с копеечную монету (рис. 6.2). Мазки должны содержать достаточно материала для полноценного исследования, но не должны быть чрезмерно толстыми, так как во время окрашивания они могут набухать и содержащиеся в них клетки
   невозможно будет дифференцировать.
2. 2. Приготовление мазков из крови. На предметное стекло, ближе к одному из его концов, наносят каплю крови. Второе – шлифованное – стекло, которое должно быть уже предметно­го, ставят на первое под углом 45° и подводят к капле крови до соприкосновения с ней. После того как кровь растечется по шлифованному краю, стеклом делают скользящее движение справа налево, равномерно распределяя кровь тонким слоем по всей поверхности стекла. Толщина мазка зависит от величины угла между стеклами: чем острее угол, тем тоньше мазок. Правильно приготовленный мазок имеет светло-розовую ок­раску и одинаковую толщину на всем протяжении.
3. Приготовление толстой капли. На середину предметного стекла пастеровской пипеткой наносят каплю крови или прикладывают стекло непосредственно к капле крови, выступающей из пальца. Нанесенную на стекло кровь размазывают бактериологической петлей так, чтобы диаметр образующегося мазка соответствовал величине копеечной монеты. Стекло оставляют в горизонтальном положении до подсыхания крови. Кровь в «толстой капле» распределяется неравномерно, обра­зуя неровный край.

1. Приготовление мазка из вязкого материала (мокрота, гной). При изготовлении мазков из мокроты для микроскопии следует выбирать участки, содержащие гнойные комочки, в Которых с наибольшей вероятностью содержится этиологичес­кий агент. Мокроту или гной, нанесенные на предметное стекло ближе к узкому краю, накрывают другим предметным стеклом. Стекла слегка придавливают друг к другу. После этого свободные концы стекол захватывают I и II пальцами обеих рук и разводят в противоположные стороны; при движении оба стекла должны плотно прилегать друг к другу (рис. 6.3). Полу­чаются мазки с равномерно распределенным материалом, за­нимающим большую часть предметного стекла.
2. Приготовление мазка из культур с плотных питательных сред. На середину чистого хорошо обезжиренного стекла нано­сят каплю водопроводной воды, в нее вносят бактериологичес­кой петлей небольшое количество исследуемой микробной культуры так, чтобы капля жидкости стала слегка мутноватой. После этого излишек микробного материала на петле сжигают в пламени горелки и приступают к приготовлению мазка по описанному выше способу (1).
3. Приготовление мазков из органов и тканей. Поверхность органа с целью обеззараживания прижигают накаленными браншами пинцета, делают по этому месту надрез и из глубины остроконечными ножницами вырезают небольшой кусочек ткани, который помещают между двумя предметными стекла­ми. Далее поступают так же, как при приготовлении мазка из гноя и мокроты. Если ткань органа плотная, то из глубины разреза делают скальпелем соскоб. Полученный при соскабли­вании материал распределяют тонким слоем по поверхности стекла скальпелем или бактериологической петлей.

Для изучения взаимного расположения элементов ткани и находящихся в ней микроорганизмов делают мазки-отпечатки. Для этого вырезанный из середины органа небольшой кусочек ткани захватывают пинцетом и прикладывают поверхностью среза к предметному стеклу последовательно в нескольких участках, получая, таким образом, ряд мазков-отпечатков.

1. Приготовление мазков из слизистого отделяемого носоглот­ки, полости рта, носа и влагалища. Мазки с тампонов готовят посредством прокатывания тампона по предметному стеклу. Этот метод аппликации помогает сохранить морфологию и расположение клеток хозяина на участке, с которого получен материал.

6.2.2. Высушивание и фиксирование мазков

Приготовленный на предметном стекле мазок высушивают на воздухе и после полного высыхания фиксируют. При фик­сировании мазок закрепляется на поверхности предметного стекла, и поэтому при последующей окраске препарата мик­робные клетки не смываются. Кроме того, убитые микробные клетки окрашиваются лучше, чем живые.

Различают физический способ фиксации, в основу которого положено воздействие высокой температуры на микробную клетку, и химические способы, предусматривающие примене­ние химических средств, вызывающих коагуляцию белков ци­топлазмы.

Физический способ фиксации. Предметное стекло с препара­том берут пинцетом или I и II пальцами правой руки за реб­ра мазком кверху и плавным движением проводят 2–3 ра­за над верхней частью пламени горелки. Весь процесс фикса­ции должен занимать не более 2 с. Надежность фиксации проверяют следующим простым приемом: свободную от мазка поверхность предметного стекла прикладывают к тыльной поверхности левой кисти. При правильном фиксировании мазка стекло должно быть горячим, но не вызывать ощущения ожога.

Химический способ фиксации. Для фиксации мазков приме­няют также химические вещества и соединения (табл. 6.2).

Таблица 6.2. Химические вещества и соединения, применяемые для фиксации мазков

Источник

Способы фиксации мазков из микробов и смешанного материала

Фиксация необходима для инактивации бактерий и прикрепления (фиксации) их к стеклу, предотвращения аутолизиса клеток и улучшения восприятия красителя.

а) Самым распространённым методом фиксации бактерий считается обработка жаром, что осуществляется путём трёхкратного проведения препарата мазком кверху через пламя спиртовки или газовой горелки. Препарат находится в пламени спиртовки З секунды. После чего препараты из бактерий окрашиваются разными способами. Метод применим при работе с чистой культурой микробов.

б) Фиксация химическими веществамииспользуется для выявления и дифференциации структурных элементов: жгутиков, протоплазмы, нуклеоида, оболочки, при работе со смешанным материалом (кровь, отпечатки органов, соскобы со слизистых, гной, мокрота). В качестве фиксаторов используют:

— метиловый спирт (фиксируют 5 минут),

— этиловый спирт (фиксируют 20 минут),

— смесь Никифорова: равные объёмы спирта и эфира (фиксируют 20 минут),

— спирт — формол: смесь 5мл неразведённого формалина мл и 96 % этилового спирта (фиксируют 15 минут),

— жидкость Боуэна: неразбавленный формалин 10 мл, ледяная уксусная кислота 2 мл, насыщенный водный раствор пикриновой кислоты 30 мл (фиксируют 30 минут),

— жидкость Карнуа — ледяная уксусная кислота 10 мл, хлороформ 30 мл и 96 % спирт (фиксируют 15 минут).

Ориентировочная окраска бактерий простыми методами.

Окраска выявляет морфологию и частично структуру клетки.

Для простой окраски используют один из красителей:

а) разведённый (1:10) карболовый фуксин, окрашивают 10-30 сек. (метод Леффлера), промывают водой, высушивают на воздухе;

б) водньий раствор метиленовой синьки Леффлера окрашивают 3-10 минут, промывают водой, высушивают на воздухе.

Микроскопия препарата с иммерсионным объективом

Иммерсионный объектив даёт увеличение х90 при условии отсутствия рассеивания потока лучей в связи с неоднородностью среды при их прохождении.

В этой связи, во избежание такого дефекта применяется иммерсионное кедровое масло или его заменитель — вазелиновое масло. Процесс микроскопии с иммерсионным объективом х90 ведут с окулярами х7, х10, но чаще с первым из них. Техника микроскопии состоит из нескольких этапов:

1. На готовый окрашенный мазок наносят каплю масла.

2. Под контролем глаза сбоку осторожно опускают тубус, погружая объектив в каплю масла. При неосторожном выполнении можно раздавить либо линзу объектива, либо предметное стекло.

3. После прикосновения объектива к маслу дальнейшее опускание тубуса ведётся с помощью микровинта микроскопа до появления микрообъектов в окуляре.

4. Просмотр препарата ведут только за счёт манипуляций с микровинтом и движения стекла.

5. После окончания микроскопии тубус поднимают, объектив выходит из капли масла.

6. Масло с объектива удаляют чистой ваткой или марлей и протирают жирорастворителем — либо ксилолом, либо спиртом, либо хлороформом. Оставлять масло на линзе объектива нельзя.

7. Револьверную часть на тубусе устанавливают на объектив х8, конденсор и тубус опускают, переводя в нерабочее состояние, и закрывают микроскоп колпаком.

Источник

Приготовление мазков и их фиксация

Приготовление окрашенного препарата состоит из следующих этапов:

1) приготовление мазков;

2) высушивание мазка;

3) фиксация мазка;

Для приготовления препарата, на обезжиренное предметное стекло, наносят каплю воды или физиологического раствора, в которую петлей вносят исследуемый материал и распределяют тонким равномерным слоем по стеклу на площади приблизительно 1 см 2 . Если исследуемый материал находится в жидкой среде, то его непосредственно наносят петлей на предметное стекло и готовят мазок. Мазки высушивают на воздухе или в струе теплого воздуха над пламенем спиртовки, не давая капле закипать.

Для фиксации мазка предметное стекло (мазком вверх) медленно проводят 3-4 раза через пламя спиртовки. Микроорганизмы при фиксации погибают, плотно прикрепляются к поверхности стекла и не смываются при дальнейшей обработке. Более длительное нагревание может вызвать деформацию клеточных структур.

При фиксации с помощью химических веществ используют хромовые соединения, формалин, осмиевую кислоту, ацетон. Один из распространенных приемов фиксации — обработка препарата метиловым или этиловым спиртом, или смесью Никифорова (равные объемы этилового спирта и эфира). При этом препарат погружают на 5-20 мин. в фиксирующую жидкость.

Методы окраски мазков и красители, используемые в микробиологии.

Существуют простые и сложные методы окраски. При простой окраске используют какой-либо один из красителей, например, фуксин водный (1-2 мин.), метиленовый синий (3-5 мин.). При окрашивании мазка препарат помещают на препаратодержатель. На мазок наносят несколько капель красителя. После истечения времени окрашивания препарат промывают водой, фильтровальной бумагой удаляют излишки воды, высушивают на воздухе и микроскопируют.

При сложной окраске последовательно наносятся на препарат определенные красители, различающиеся по химическому составу и цвету. Это позволяет выявить определенные структуры клеток и дифференцировать одни виды микроорганизмов от других. Таковы методы окраски по Грамму, по Цилю-Нильсену, окраска спор по методу Ожешки.

Красители, у которых при диссоциации выделяются водородные ионы, придающие красителю кислый характер, называются кислыми. Они окрашивают (в виде аниона) вещества основной природы. Красители, у которых при диссоциации выделяются гидроксильные ионы, — основными.

В микробиологической практике кислые и основные красители используются в виде солей, так как они способны вступать в реакцию с кислотами и основаниями. Основные красители чаще применяются в виде солей соляной, реже уксусной и серной кислот; кислые красители – в виде натриевых или калийных солей.

Источник

Приготовление мазков

Для изучения микроорганизмов в окрашенном виде на предметном стекле делают мазок, высушивают, фиксируют его и после этого окрашивают.

Исследуемый материал распределя­ют тонким слоем по поверхности хорошо обез­жиренного предметного стекла.

Мазки готовят из культур микробов, патологического ма­териала (мокрота, гной, моча, кровь и др.) и из органов трупов.

Техника приготовления мазков определяется характером исследуемого материала.

Приготовление мазков из микробных культур с жидкой питательной средой и из жид­кого патологического материала (моча, ликвор и др.). Маленькую каплю исследуемой жидкости на­носят бактериальной петлей на предметное стекло и круго­выми движениями петли распределяют равномерным слоем в виде кружка диаметром в копеечную монету.

Приготовление мазков из крови. На пред­метное стекло, ближе к одному из его концов, наносят кап­лю крови. Второе — шлифованное — стекло, которое должно быть уже предметного, ставят на первое под углом 45° и подводят к капле крови до соприкосновения с ней. После того как кровь растечется по шлифованному краю, стеклом делают скользящее движение справа налево, равномерно рас­пределяя кровь тонким слоем по всей поверхности стекла. Толщина мазка зависит от величины угла между стеклами: чем острее угол, тем тоньше мазок. Правильно приготовленный мазок имеет светло-розовую окраску и оди­наковую толщину на всем протяжении.

Приготовление толстой капли. На середину предметного стекла пастеровской пипеткой наносят каплю крови или прикладывают стекло непосредственно к выступающей капле крови. Нанесенную на стекло кровь размазывают бактериальной петлей так, чтобы диаметр об­разующегося мазка соответствовал величине копеечной мо­неты. Стекло оставляют в горизонтальном положении до высыхания крови. Кровь в «толстой капле» распределяется неравномерно, образуя неровный край.

Приготовление мазка из вязкого мате­риала (мокрота, гной). Мокроту или гной, нанесенные на предметное стекло ближе к узкому краю, накрывают другим предметным стеклом. Стекла слегка придавливают друг другу.

После этого свободные концы стекол захватывают 1 и 2 пальцами обеих рук и разводят в противоположные стороны так, чтобы при движении оба стекла плотно прилегали друг к другу. Получаются мазки с равномерно распределенным материалом, занимающим большую площадь.

Приготовление мазка из культур с плотных питательных сред. На середину чистого, хорошо обезжиренного предметного стекла наносят каплю воды, в нее вносят бактериальную петлю с небольшим количеством исследуемой микробной культуры, так, чтобы капля жидко­сти стала слегка мутноватой. После этого излишек микроб­ного материала на петле сжигают в пламени и при­ступают к приготовлению мазка по вышеописанному способу.

Приготовление мазков из органов и тканей. Поверхность органа с целью обеззараживания прижигают накаленными браншами пинцета, делают по этому ме­сту надрез и из глубины остроконечными ножницами вырезают небольшой кусочек ткани, который помещают между двумя предметными стеклами. Далее поступают так же, как при приготовлении мазка из гноя и мокроты. Если ткань органа плотная, то из глубины разреза делают скальпелем соскоб. Полученный при соскабливании материал распределя­ют тонким слоем по поверхности стекла скальпелем или бактериальной петлей.

Для изучения взаимного расположения элементов ткани и находящихся в ней микроорганизмов делают мазки-отпе­чатки. Для этого вырезанный из середины органа небольшой кусочек ткани захватывают пинцетом и прикладывают по­следовательно несколько раз по­верхностью среза к предметному стеклу, получая, таким образом, ряд мазков-отпе­чатков.

Высушивание и фиксация мазков. Приготовленный на предметном стекле мазок высушивают на воздухе и после полного высыхания фиксируют. При фиксировании мазок закрепляется на поверхности предметного стекла, и поэтому при последующей окраске препарата микробные клетки не смываются. Кроме того, убитые микробные клетки окрашиваются лучше, чем живые.

Различают физический способ фиксации, в основу которого положено воздействие высокой температуры на микробную клетку, и химические способы, предусматривающие применение средств, вызывающих коагуляцию белков. Нельзя фиксировать над пламенем мазки, содержащие возбудителей I – II групп патогенности.

Физический способ фиксации. Предметное стекло с препаратом берут пинцетом или I и II пальцами правой руки за ребра мазком кверху и плавным движением проводят 2—3 раза над верхней частью пламени горелки. Весь процесс фиксации должен занимать не более 2 с. Надежность фиксации проверяют следующим простым приемом: свободную от мазка поверхность предметного стекла прикла­дывают к тыльной поверхности левой кисти. При правиль­ном фиксировании мазка стекло должно быть горячим, но не вызывать ощущения ожога.

Химический способ фиксации. Для фиксации мазков применяют также химические вещества и соединения, приведенные в таблице 4.

Источник