Хемостатный способ культивирования микроорганизмов

Хемостатный способ культивирования

Хемостатное культивирование основано на том, что в простейшей форме рост бактерий можно предоставить как совокупность реакций, в которых скорость роста культуры определяется самой медленной реакцией метаболизма. Хотя в растущей культуре осуществляется метаболизм многих питательных веществ, скорость роста культуры в любой момент времени определяется скоростью метаболизма лишь одного питательного субстрата. Тот субстрат, или тот компонент питательной среды, метаболизм которого осуществляется медленнее всего и который таким образом определяет скорость роста бактериальной культуры, принято называть лимитирующим фактором.

Каким же образом скорость роста культуры зависит от концентрации лимитирующего субстрата? Эту зависимость установил Моно и выразил её следующей формулой:

µ =µ_мах*

µ — удельная скорость роста

µ_{мах – максимально возможная скорость роста в данной среде}

S – концентрация лимитирующего субстрата в среде

K_s – константа Моно или константа насыщения. Она численно равна концентрации лимитирующего субстрата, замедляющей вдвое µ_{мах (т.е. =} S при µ=µ_мах)

Совершенно очевидно, что концентрация лимитирующего фактора или субстрата в среде ограничивает и концентрацию вырастающей биомассы. В случае полного использования лимитирующего фактора рост и размножение бактериальных клеток прекращается. Концентрация биомассы в ферменте в стационарном состоянии культуры определяется по формуле:

Х =

y – экономический коэффициент, или доля потребленного субстрата, пошедшего на синтез биомассы

S₀ _{– концентрация} субстрата в поступающей среде

S – концентрация субстрата в ферментере

Концентрацию субстрата в ферментере в стационарном состоянии культуры определяют по формуле:

S =

K_s – константа Моно

D _{– коэффициент разбавления или скорость} разбавления

S – концентрация субстрата в ферментере

µ_{мах – максимально возможная скорость роста}

Скорость разбавления, или коэффициент разбавления (D) при хемостатном культивировании известен. Он равен:

F – скорость потока

V _{– объем культуры}

Величина обратная скорости разбавления характеризует время полной замены имеющейся в ферменте среды новой или, что одно и то же, время пребывания в ферментере каждого компонента питательной среды:

Таким образом, следует рассматривать количественные зависимости, существующие между:

концентрацией биомассы – Х,

концентрацией лимитирующего субстрата – S

скоростью роста — µ

Графически эта зависимость характеризуется хемостатной кривой, которая выглядит следующим образом:

На приведенной кривой видно, что при увеличении скорости разбавления снижается концентрация биомассы и увеличивается концентрация субстрата. Причем, если вести дельнейшее увеличение скорости разбавления, то концентрация (Х) стремится к 0, т.е. при некотором значении (D) биомасса полностью вымывается из фермента. Эту скорость разбавления назначают критической (D_кр.) или скоростью вымывания клеток. Теоретически D_кр= µ_мах

Но поскольку концентрация лимитирующего субстрата в аппарате (S) не может быть больше концентрации его в поступающей среде (S₀), то:

D_кр= µ_мах*

Производительность фермента по выходу (урожаю) биомассы рассчитывают следующим образом:

Зная основные константы K_s_, µ_мах и y можно легко рассчитать параметры культуры (Х) и для любого значения при µ=D

Итак, хемостатное культивирование – это вариант непрерывного проточного культивирования с заданным желаемым коэффициентом разбавления (D), к которому подстраивается скорость роста культур µ. Последняя может быть минимальной или близкой к максимальной. При этом задается также фактор (лимитирующий фактор, лимитирующий субстрат, или компонент питательной среды), который обуславливает ограничение концентрации биомассы. Концентрация биомассы определяется одним определенным компонентом питания.

Хемостатный метод культивирования незаменим в лабораторных исследованиях физиологии микроорганизмов и клеток тканей. В промышленности он применяется при наращивании микробной биомассы, если известно, какой именно фактор ограничивает рост.

Источник

БИОТЕХНОЛОГИЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ

Субботин В. В., доцент

Конопаткин А. А., профессор

Тема 3. БИОТЕХНОЛОГИЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ

2. Питательные среды и условия роста микробов.

3. Физиология роста и фазы развития микробной популяции в питательной среде.

3.1. Методы определения числа бактерий и бактериальной массы.

3.2. Рост бактерий в периодической культуре.

3.2.1 Параметры кривой роста микроорганизмов и получения целевого продукта.

3.2.2. Влияние концентрации питательных веществ на скорость роста.

3.2.3. Влияние синхронизации клеточного деления на микробную популяцию.

4. Непрерывное (проточное) культивирование микроорганизмов.

4.1. Технология полного вытеснения.

4.2. Технология полного смешения.

4.3. Биотехнологическая реализация способов непрерывного культивирования микроорганизмов.

4.3.1. Хемостатный способ культивирования.

4.3.2. Турбидостатный способ культивирования.

5. Контроль за постоянством абиотических факторов при непрерывном культивировании микроорганизмов в ферментерах и биореакторах.

5.1. Аэрация питательной среды.

5.2. Непрерывное культивирование в анаэробных условиях.

5.3. Контроль и регулирование температуры.

5.4. Контроль и регулирование pH.

5.5. Автоматическое пеногашение.

5.6. Стерилизация ферментеров и способы предотвращения микробной контаминации.

Организация биотехнологического процесса, будь то синтез микробных метаболитов или получение микробной биомассы, начинается с изучения физиологии культивируемого микроорганизма. Цель любой биотехнологии – на базе понимания биохимических и физиологических процессов в пределах генетически детерминированных свойств конкретного вакцинного штамма или патогенного производственного штамма возбудителя инфекционной болезни максимально обеспечить накопление в питательной среде конечного целевого продукта.

Микробиологические манипуляции с биологическим агентом и питательной средой осуществляются в соответствии с конкретным биотехнологическим процессом, разработанным для промышленного культивирования вакцинного (аттенуированного) или производственного (вирулентного) штамма микроорганизма. Основные технологические операции при этом можно систематизировать в виде некоторой иерархии уровней обеспечения параметров культивирования микроорганизма и управления процессом метаболизма созданной биотехнологической системы путем контролирующих операций.

Таким образом, биотехнологическое управление процессом метобализма в микробной популяции при широкомасштабном производстве ветеринарно-медецинских биопрепоратов на этапе получения биомассы должно быть направлено на обеспечение оптимальных условий для роста и размножения конкретного микроорганизма. При всем разнообразии микробиологических подходов (способов) и биотехнологических решений, эффективность биопроизводства на этапе промышленного получения биомассы или продуктов метаболизма микрообганизмов в современных условиях в основном зависит:

1) От оптимальности для рода микроорганизмов питательной среды и производственного контроля за ее изменениями;

2) От оптимальности параметров внешней среды абиотических факторов контроля за их изменением;

3) От правильности выбора вида (конструкции) биореактора и варианта культивирования микробов, обеспечивающих максимальность накопления биомассы в питательной среде.

Лишь на основе знания теории питания микроорганизмов, закономерностей их роста и накопления в питательной среде можно обеспечить микробиологический контроль за процессами метаболизм в микробной популяции (культуре) и таким образом обеспечить максимальную эффективность этого этапа работы в биотехнологическом процессе производства биопрепаратов.

2.Питательные среды и условия роста микробов.

Питательные вещества – это растворенные в воде соединения, из которых микроорганизмы строят свои клетки и получают энергию. Требования, предъявляемые различными микроорганизмами в отношении состава питательной среды и прочих условий весьма разнообразны.

В связи с этим было предложено очень много рекомендаций по составлению питательных сред для различных микроорганизмов. В принципе питательные среды должны отвечать следующим минимальным требованиям: в них должны присутствовать все элементы, из которых строится клетка, в такой форме, в которой микроорганизмы способны их усваивать.

Потребность в химических элементах. По количественному вкладу в построении клетки различают макро- и микроэлементы. К первым относятся 10 элементов, содержащихся во всех организмах /C,O,H,N,S,P,K,Ca,Mg,Fe /. Микроэлементы или следовые элементы – это Mn, Mb, Zn, Cu, Co, Ni, Wu, Bor, Cl, Селен, Kr, Wf и др. в которых нуждаются не все организмы. Они содержатся чаще в качестве примесей в солях макроэлементов. Большинство химических элементов вносят в питательную среду в виде солей /пример: состав простой синтетической среды/.

Источники углерода и энергии. Все патогенные микроорганизмы получают клеточный углерод главным образом из органических веществ. Последние, как правило, служат источником как энергии, так и углерода; частично они ассимилируются для построения клеток, частично окисляются для получения энергии.

Из природных органических соединений количественно преобладают полисахариды – целлюлоза и крахмал. Структурные элементы этих полимерных соединений – молекулы глюкозы – могут использоваться многими микроорганизмами. Микроорганизмы способны также использовать и все другие органические соединения, образующиеся естественным путем.

Добавочные вещества. Помимо элементов минерального питания и источников углерода и энергии многие организмы нуждаются еще в некоторых дополнительных веществах, называемых факторами роста. Эти вещества входят в основной состав клетки, но некоторые организмы не способны их синтезировать сами.

Такие факторы роста относятся к трем группам соединений – к аминокислотам, пуринам и пиримидинам, а также к витаминам. За исключением витаминов, первые три соединения – составные части белков и НК, поэтому клетка нуждается в достаточных количествах этих соединений. Витамины входят в состав коферментов или простотетических групп, и таким образом необходимы только в очень малых количествах.

Организмы, нуждающиеся в факторах роста, называют ауксотрофными и противопоставляют их прототрофным организмам, которым такие факторы не нужны.

Сера и азот. Оба элемента содержатся в клетке главным образом в восстановленной форме / сульфгидрильные группы, аминогруппы/. Большинство микроорганизмов способно поглощать эти элементы в их окисленной форме, в виде сульфата и нитрата, которые они могут восстанавливать. Наиболее обычный источник азота для микроорганизмов – соли аммония и аминокислоты.

Кислород. Многим микроорганизмам, помимо кислорода воды, СО₂ и органических веществ, необходим молекулярный кислород /О₂/. Главная функция О₂ состоит в том, что он служит конечным акцептором электронов при аэробном дыхании, восстанавливаясь при этом до воды.

По отношению к молекулярному кислороду можно выделить три группы микроорганизмов:

а) Облигатные аэробы – способны получать энергию только путем дыхания и поэтому нуждаются в О₂ ;

б) Облигатные анаэробы – могут расти только в среде, лишенной О₂;

в) Факультативные анаэробы растут как в присутствии, так и в отсуствии О₂; среди них следует различать два типа:

— аэротолерантные молочнокислые бактерии могут расти в присуствии атмосферного О₂ , но не способные его использовать – они получают энергию с помощью брожения;

— другие факультативно-анаэробные бактерии (Enterobacteriaceae) и многие дрожжи могут переключаться с дыхания (в присутствии О₂) на брожение (в отстуствии О₂).

Многие аэробные бактерии – микроаэрофилы, хотя они и нуждаются в кислороде для получения энергии, однако не переносят того парциального давления О₂, которое существует в воздухе (0.20 бар) – им нужно от 0.01 до 0.03 бар.

Таким образом, обозначив потребность микроорганизмов в питательных веществах, было установлено, что очень многие нетребовательные микроорганизмы, например, большинство эшерихий, псевдомонад, хорошо растут на простых синтетических средах (глюкоза + соли). Но многим микроорганизмам, в особенности патогенным, сверх того нужны еще какие-то из перечисленных выше микроэлементов, витаминов или других добавок. Если питательный раствор составлен из определенных химических соединений, то говорят о синтетической среде.

Исследователи стремятся определить для каждого микроорганизма оптимальные потребности в питательных веществах и составить минимальную среду, содержащую лишь те инградиенты, которые необходимы для роста. Более требовательные виды нуждаются в большом числе добавочных веществ ( >40 компонентов).

Сложные среды. У многих, особенно требовательных микроорганизмов, потребности в питательных веществах изучены пока недостаточно. Их культивируют на средах, содержащих дрожжевой экстракт, дрожжевой автолизат, пептон или мясной бульон. Для уменьшения стоимости к питательным растворам часто добавляют вместо чистых соединений весьма сложные смеси, нередко их получают из субпродуктов, вторичного сырья и пр. Такого рода питательные среды называют сложными.

Такого рода питательные среды называют сложными.

Твердые среды. Для приготовления твердых сред к жидким питательным растворам добавляют особые вещества, которые придают им желеобразную консистенцию. Желатину применяют для этой цели лишь в отдельных случаях из-за слишком низкой точки плавления (26-30*) и, кроме того, разжижается многими микроорганизмами. Почти идеальным средством для получения твердых сред служит агар (полисахарид из морских водорослей) в концентрации 15-20 г/л. Плавится агар только при 100*, но при охлаждении остается жидким вплоть до 45*. Разлагать его способны лишь немногие микроорганизмы. В тех случаях, когда требуются твердые среды, не содержащие органических компонентов, применяют силикагель.

Изготовление универсальной среды с одинаковой питательной ценностью для всех патогенных микробов практически неосуществимо, так как индивидуальные потребности отдельных видов крайне разнообразны. Учитывая эти особенности, питательные среды обычно делят на три группы:

1) Простые, или обычные среды, пригодные для культивирования большинства патогенных микробов;

2) Специальные среды, употребляемые для выделения и выращивания тех патогенных микробов, которые на обычных средах развиваются неудовлетворительно или совсем не растут.

3) Дифференциально-диагностические среды, применяемые для определения видовой принадлежности выделенной чистоты культуры исследуемого микроба.

В биологической промышленности культивирование микроорганизма осуществляют на специальных средах, основой приготовления которых нередко служат простые питательные среды. Более того, их применяют и самостоятельно для этой цели. Существуют руководства с описанием приготовления простых питательных сред, применяемых для изготовления биоприпаратов. Здесь заслуживает внимания лишь перечисление их названий: 1. Мясная вода; 2 Мясопептонный бульон (МПБ); 3. Мясопептонный печеночный бульон (МППБ); 4. Мясопептонный агар (МПА); 5. Полужидкий агар; 6. Питательная желатина; 7. Основной мясокислотный гидролизат; 8. Гидролизатная среда для культивирования сибиреязвенных микробов; 9. Печеночный бульон на мясном гидролизате для культивирования бацилл эмкара; 10. Печеночный агар на кислотном гидролизате из сгустков крови для культивирования бруцелл. 11. Среды для культивирования микобактерий; 1.2 Основной перевар по Хоттингеру; 13. Питательная среда из свиней; 14. Среды из перевара по Хоттингеру для культивирования сальмонелл; 14. Среды из перевара по Хоттингеру для культивирования микобактерий; 15. Ферментативный перевар мяса по Герману; 16. Пептон Мартена; 17. Среда Китт-Тароцци; 18. Казеиновый гидролизат; 19. Казеиново-мясная среда. В современном биопроизводстве имеется множество модификаций приготовления перечисленных питательных сред, обеспечивающих более интенсивный рост и накопление микробов в процессе промышленного культивирования.

3.Физиология роста и фазы развития микробной популяции в питательной среде.

Под ростом понимают необратимое увеличение количества живого вещества, обычно связанное с увеличением с делением клеток. У многоклеточных организмов увеличиваются размеры тела, у одноклеточных растет число клеток. Однако и у одноклеточных следует отличать увеличение числа клеток от увеличения клеточной массы.

При определении числа или массы бактерий пользуются обычно гомогенной суспензией клеток в какой-либо жидкой среде и определяют концентрацию бактерий (число клеток на 1мл) или плотность бактерий (в мг/мл).

На основе данных об увеличении этих показателей в растущей бактериальной культуре можно вычислить константу скорости деления клеток (ее выражают числом удвоений концентрации бактерий за 1 час) и обратную ей величину – время генерации (интервал времени, за который число клеток удваивается).

3.1 Методы определения числа бактерий и бактериальной массы.

Во время роста периодической (статической, без смены среды) бактериальной культуры может не быть строгой пропорциональности между увеличением числа клеток и увеличением бакмассы. Поэтому показатели эти необходимо различать.

Определение числа бактерий. В популяции бактерий не все клетки жизнеспособны. Живыми считаются те клетки, которые могут образовывать колонии на/или в/ агаризированной среде, либо суспензию в питательном растворе. Эти жизнесособные клетки выявляют специальными методами, предназначенными для определения числа живых клеток. В общее же число клеток, входят также мертвые или поврежденные клетки.

Общее число клеток. Самыми распространенными методами определения общего числа клеток являются: подсчет под микроскопом в тонком слое «счетной камеры», применение электронного счетчика («счетчик Каултера»), нефелометрия (спектрофотометрия) и использование оптических стандартов мутности.

Число живых клеток. Обычно подсчитывают число колоний, образуемых жизнеспособными клетками в благоприятных для роста условиях. Существует несколько вариантов метода посева микробов в агар и подсчета числа колоний: а) посев в расплавленный агар на чашки Петри; б) посев на поверхность агара; в) посев в тонком слое агара; г) посев в многослойный агар.

Для этой цели можно использовать и метод мембранных фильтров. Профильтровав определенный объем разбавленной культуры через стерильный мембранный фильтр, затем его перегонят на агар или фильтровальную бумагу, пропитанную питательной средой, инкубируют их и подсчитывают число взросших колоний.

Определение бактериальной массы. Для оценки урожая обычно взвешивают сырые или сухие отцентрифугированные клетки. При определении интенсивности обмена или ферментативной активности исходят из содержания в клетках белка или азота. Часто выбор метода диктуется такими соображениями как простота или быстрота работы. В повседневной практике предпочтение отдается не прямым, а косвенным методам.

Прямые методы. Основаны на определении сырой или сухой биомассы, общего азота (метод микро-Кьельдаля и микродиффузионный). Общего содержания углерода, бактериального белка. Хорошие результаты дают модификации биуретового метода и другие колориметрические методы. Микрометоды основаны на измерении количества характерных компонентов белка: тирозина, триптофана (по Лоури или Фолину).

Косвенные методы определения бактериальной массы основаны либо на измерении мутности клеточной суспензии (измерение экстинции, турбидиметрия, нефелометрия), либо на определении показателей интенсивности метаболизма, непосредственно связанное с ростом (поглощение О₂, образование СО₂, или кислот), которые могут служить адекватной мерой бактериальной массы. К такого рода определениям прибегают в тех случаях, когда другие методы оказываются непригодными, например, при очень малой плотности клеточной суспензии. Для измерения можно применять титрометрические, электрохимические и другие методы. Выбор метода определения числа бактерий и бактериальной массы нередко зависит от того, с какой целью это определение производится и насколько точную характеристику роста микробной популяции необходимо получить.

3.2 Рост бактерий в приодической культуре.

В этой части лекции рассмотрим фазы развития микробной популяции в питательных средах в условиях периодической системы их культивирования.

Периодической системой культивирования называют систему, в которой после внесения бактерий (засева) в питательную среду не производится ни добавления, ни удаления каких-либо компонентов, кроме газовой фазы. Отсюда следует, что периодическая система может поддерживать размножение клеток в течение ограниченного времени, на протяжении которого состав питательной среды изменяется от благоприятного (оптимального) для их роста до неблагоприятного, вплоть до полного прекращения процесса размножения.

Рост в такой «закрытой системе» подчиняется определенным закономерностям. Общую закономерность роста и размножения бактериальной популяции принято показывать графически в виде кривой, отражающей зависимость логарифма числа живых клеток от времени культивирования.

Типичная кривая (рис. 1) имеет S-обзразную форму и позваляет различать несколько фаз роста, сменяющих друг друга в определенной последовательности: начальную (или лаг-)фазу, экспоненциальную (или логарифметическую, лог-)фазу, стационарную и фазу отмирания.

Начальная фаза. Эта фаза охватывает промежуток времени между инокуляцией (момент посева) и достижением максимальной скорости деления микробов. Продолжительность этой фазы зависит главным образом от предшествующих условий культивирования и возраста инокулята,а так же от степени пригодности питательной среды для роста данного микроба. Если инокулят взят из старой культуры, то клеткам приходится сначала адаптироваться к новым условиям путем синтеза РНК, образования рибосом и синтеза ферментов. Если источники энергии и углерода в новой среде отличаются от таковых предшествующей культуры, приспособление к новым условиям может быть связано с синтезом новых ферментов, которые ранее не были нужны и поэтому не синтезировались. Образование новых ферментов индуцируется новым субстратом.

Хорошим примером влияния субстрата на синтез ферментов служит так называемая диауксия – явление двуфазного роста или двойного цикла роста наблюдаемое при культивировании Е.coli на средах, содержащих смесь питательных веществ, в частности глюкозы и сорбита (рис.2).

I. Утилизация глюкозы

II. Синтез фермента, расщепляющего сорбит

III. Утилизация сорбита

При более глубоком исследовании физиологического состояния микроорганизма в лаг-фазе представляется возможным и целесообразным выделить две стадии:

а) Стадия покоя – время от момента посева микробов до начала их роста. Число клеток при этом не увеличивается, а в некоторых случаях – даже уменьшается. Продолжительность её – 1-2 часа;

б) Стадия задержки размножения длительностью около 2 час. Клетки в течение этой стадии интенсивно растут, но слабо размножаются. Количественные изменения состава бактериальной клетки во время лаг-фазы сильнее всего затрагивают РНК, содержание которой повышается в 8-12 раз, что указывает на участие РНК в синтезе ферментных белков.

Экспоненциальная фаза, или фаза логарифмического роста характеризируется постоянной максимальной скоростью деления клеток. Период генерализации (лат. Generatio – рождение, воспроизведение) – это время между двумя последовательными делениями бактерий – в этой стадии будет постоянным для данного вида, а количество бактерий будет увеличиваться в геометрической прогрессии. Следовательно, после “n” генерации количество клеток в культуре будет равно “2n”. Длительность лог-фазы – обычно 5-6 часов.

Величина клеток и количество содержания в них белка у многих бактерий в лог-фазе то же остаются постоянными и в целом микробная популяция состоит из «стандартных клеток». Если увеличение биомассы бактерий, включая белки, РНК, липиды и другие макромолекулы, происходит пропорционально увеличение численности бактериальных клеток, то такое состояние определяют понятием «сбалансированный рост». Поэтому за ростом культуры в стадии «сбалансированного роста» лог-фазы можно следить, пользуясь каким-нибудь одним из этих показателей.

За стадией сбалансированного роста уже в лог-фазе наступает стадия отрицательного ускорения, при которой скорость размножения бактерий перестает быть максимальной. В результате число делящихся особей – уменьшается, а число погибших – увеличивается. Ее длительность около 2-х часов. Причина замедления размножения: истощение питательной среды, накопление продуктов метаболизма, увеличение плотности клеточной суспензии и мн.др.

В связи с тем, что в экспоненциальной фазе скорость деления клеток относительно постоянна, эта фаза наиболее удобна для определения скорости деления (и скорости роста).

Стационарная фаза максимума. В ней число новых живых бактерий почти равно числу отмерших (равновесие). Переход от лог-фазы к стационарной происходит постепенно. Причины замедления роста нами обозначены при описании стадии отрицательного ускорения (нехватка питательной среды, большая плотность бактериальной популяции, низкое порциальное давление О₂, накопление токсических продуктов обмена). Все эти факторы вызывают переход к стационарной фазе.

Но и в стационарной фазе могут еще происходить такие процессы, как использование запасных веществ, распад части рибосом и синтез ферментов. Наблюдаемая картина зависит от того, какой именно фактор лимитирует рост. Быстро гибнут лишь очень чувствительные клетки, другие – еще долго сохраняют жизнеспособность – до тех пор, пока еще есть возможность получать необходимую для этого энергию в процессе окисления каких-либо запасных веществ или клеточных белков. Количество биомассы, достигнутое в стационарной фазе, называют выходом или урожаем. Урожай зависит от природы и количества используемых питательных веществ, а так же от условий культивировании.

Фаза отмирания. В этой фазе можно выделить три стадии?

а) стадия ускорения, гибели, характеризующаяся превышением числа отмирающих клеток над количеством вновь образующихся (около 3 часов);

б) стадия логарифметической гибели – отмирание клеток происходит с постоянной скоростью ( 5 часов);

в) стадия уменьшения скорости отмирании, во время которой оставшиеся в живых клетки переходят в стадию покоя.

3.2.1 Параметры кривой роста микроорганизмов и получение целевого продукта

Определение фаз и стадий развития микробной популяции в питательной среде в условиях периодичной культуры имеет не только теоретическое но и большое практическое значение. Так, определяя режимы хранения микробов, рекомендуется использовать культуры в конце фазы логарифмического роста, поскольку они обладают наибольшей жизнеспособностью. Для изготовления вакцин, диагностикумов и любых антигенов используют микробные культуры на определенной фазе кривой роста.

Изучение процесса развития микробной популяции в периодической системе культивирования фактически является началом научно-практической работы по микробиологическому синтезу тех или иных продуктов. С этой целью определяется динамика накопления биомассы, или целевого продукта метаболизма, а так же потребление исходного основного сырья (субстрата). Для этого периодически берут пробы из развивающейся культуры с частотой, обеспечивающей возможность установления основных фаз развития микробной популяции. Заканчивают исследования после прекращения роста микробной культуры и максимального накопления целевого продукта.

Если при сравнении параметров кривых роста число микроорганизмов (или их биомассы) и накоплением целевого продукта имеется прямая связ, то это свидетельствует о результате биосинтеза его в экспоненционную фазу. Такой продукт микробного метаболизма называют первичным. При отсутствии такой корреляции целевой продукт обычно синтезируется в стационарной фазе и фазе отмирания, т.е. рост микробов заторможен и выросшая биомасса может еще перерабатывать оставшийся неиспользованный субстрат. Этот продукт относят ко второй фазе, а сам процесс синтеза его нередко имеет катаболитический характер и связан с возникновением экстремальных условий для микробной популяции. Но иногда целевой продукт второй фазы начинает синтезироваться еще в лог-фазе, так что подразделение процессов на одно- и двухфазные не носит абсолютного характера.

Наличие вторичных продуктов (метаболитов) в отличие от первичных в большинстве своем для жизни микроба-продуцента необязательно. Типичными продуктами второй фазы роста культур являются антибиотики. Вторичными могут быть и продукты энергетического метаболизма. Например, у некоторых бродильных микроорганизмов продуктами первичного метаболизма углеводов часто являются органические кислоты, но при ингибировании роста, создающимися условиями среды, вместо них образуются нейтральные вещества – спирты, кетоны, являщиеся часто целевыми продуктами. Такая двухразность брожения была открыта В.Н.Шапошниковым и распространена затем на другие процессы микробного биосинтеза.

Во вторую фазу может осуществляться и сверхсинтез продуктов первой фазы (например, витаминов).

При культивировании микроорганизмов, с какой бы целью оно не проводилось, важным является определение таких характеристик, как эффективность или скорость роста, и экономический коэффициент культивирования, или выход биомассы.

Скорость роста характеризуется чаще всего удельной скоростью роста, обозначаемой М. Удельная скорость роста (µ) – отношение числа или веса (в граммах) образовавшихся за единицу времени клеток к общему числу или весу (в граммах) клеток. Обычно µ выражают в доле прироста за 1 час. Таким образом,

где dx – прирост биомассы за единицу времени = Х₂-Х₁

dt – промежуток времени, за который определяется dx;

х – общее число клеток на момент времени T₂.

Удельная скорость роста микроорганизмов, когда это необходимо рассчитывается для любой фазы развития периодической культуры, но чаще всего она определяется для фазы логарифмического роста, в которой кривая роста имеет линейный характер.

Максимально возможную скорость роста культуры в данных условиях обозначают µ _ш. Очевидно, что µ, определенная в фазу логарифмического роста стремится к µ _м.

Иногда бывает необходимым определять валовую (общую) скорость роста V, которая характеризует абсолютный прирост биомассы за единицу времени:

Как µ так и V характеризуют данную культуру в данных условиях культивирования и не являются количественной характеристикой штамма.

Скорость роста может характеризоваться также временем удвоения количества биомассы или числа клеток – g (или временем генерации):

где ln – натуральный логарифм.

Экономический коэффициент культивирования или выхода биомассы обозначают «Y» и определяют как отношение веса (в граммах) или числа образованных клеток к весу (в граммах) или концентрации потребленного питательного субстрата.

где – увеличение количества биомассы, соответствующее потреблению субстрата в количестве .

У периодических культур определяется средняя величина за период роста. Вычтя из количества выросшей биомассы «Х» количество посевного материала «Х₀» и поделив количество потребленного питательного вещества, получим:

где S₀ – концентрация питательного вещества в исходной среде;

S – остаточная концентрация питательного вещества.

Экономический коэффициент может определяться за резные сроки культивирования. Обычно конкретный штамм характеризуют по

в период фазы логарифмического роста. При замедлении скорости роста в лог – фазу вследствие недостатка какого – либо компонента питательной среды (лимитирования) или из-за накопления неблагоприятных для роста метаболитов в среде (ингибирования) экономический коэффициент снижается. Экономический коэффициент может рассчитываться в отношении потребления любого субстрата, прежде всего углеродного, а также и в отношении кислорода и вообще любого компонента питания.

3.2.2. Влияние концентрации питательных веществ на скорость роста.

Рассмотренная нами кривая роста микробной популяции при периодической системе культивирования наиболее близка к реальному процессу асинхронного, или неоднородного деления клеток данной культуры. При этом, одновременно с ростом биомассы одних клеток, происходит увеличение числа клеток в популяции за счет деления других и постоянная утилизация субстратов питательной среды. Такой рост возможен лишь в том случае, если питательная среда сбалансирована по всем компонентам, необходимым бактериальной клетке для роста и размножения. Следовательно, нелимитированность питательной среды по какому-либо питательному компоненту – одно из основных обязательных условий максимального роста микробной популяции.

Если же питательная среда лимитирована по какому-либо питательному компоненту, то скорость роста замедляется вплоть до полной остановки роста после полной утилизации этого компонента. Иногда в комплексной питательной среде бактериальные клетки используют имеющиеся субстраты последовательно. Это происходит тогда, когда присутствие одного субстрата в среде приводит к подавлению синтеза фермента, участвующего в метаболизме других питательных веществ. В этих условиях «подавляемые» ферменты начинают синтезироваться и осуществлять метаболизм лишь тогда, когда ингибирующий (подавляющий) их субстрат будет израсходован бактериальными клетками. Такая регуляция физиологии бактерий концентрацией питательных веществ в субстрате приводит к изменениям в скорости роста, а следовательно, и в кривой роста, на которой появляется одна или несколько переходных (т.е. временных) стационарных фаз. Классическим примером такого роста может служить рост E.coli в присутствии глюкозы и лактозы. Сначала происходит рост культуры за счет использования глюкозы. После расхода этого субстрата кривая роста резко меняет свой наклон. Во время этой лог-фазы происходит включение новой ферментной системы, участвующей в метаболизме лактозы, и накоплении биомассы продолжается за счет потребления этого сахара.

2.Образование новой ферментной системы

Концентрацией питательных веществ в среде можно влиять на только на скорость роста, но и на процессы биосинтеза тех или иных продуктов метаболизма. Такое изменение биосинтеза, как теперь известно, связанно с определенными фазами развития культуры (первичные и вторичные метаболиты). Если речь идет о первичных метаболитах, т.е. о веществах синтез которых связан сростом и размножением микробных клеток, то различными способами удлиняют фазу логарифмического роста, прибегая к полупрочному или проточному культивированию (вместо периодического). Если целевым продуктом являются вторичные метаболиты (вещества синтезируемые при замедлении размножения микробов), то меняя параметры культивирования, концентрацию тех или иных питательных веществ добиваются неоптимальных условий для роста, но оптимальных для биосинтеза определенного продукта. Для этого некоторые компоненты питательной среды должны быть в недостатке, чтобы основное сходное сырье перерабатывалось биомассой в целевой продукт.

До недавнего времени лимитирующие рост факторы выявляли только путем эмпирического поиска и обнаруживались методом проб и ошибок. Так, установлено, что многие антибиотики, образуемые актиномицетами, синтезируются при лимитации роста продуцентов недостатком роста фосфора, для биосинтеза пенициллина – требуется лимитация роста культур глюкозой, а для грамицидина С – молекулярным кислородом.

В последнее время для поиска лимитирующих компонентов питательной среды используют наборы синтетических сред с различными лимитирующими веществами, а также прибегают к математическому моделированию и планированию экспериментов.

3.2.3. Влияние синхронизации клеточного деления на микробную популяцию.

Кривые роста, предоставленные в виде зависимости числа клеток от времени культивирования иногда показывают необычно быстрое увеличение числа клеток сразу после лаг-фазы, вслед за чем скорость накопления клеток понижается. Такое необычное значительное ускорение роста связанно с частичной или полной синхронизацией деления клеток в культуре.

Синхронный рост может быть обусловлен приспособлением культуры к новому питательному субстрату, после чего происходит одновременное деление клеток, в результате одновременного прорастания спор в вегетативные клетки. Затем синхронность культуры быстро нарушается и через 2-3 генерации преобладает обычный асинхронный рост.

В настоящее время разработаны специальные методы, с помощью которых можно синхронизировать деление клеток в растущей популяции, так что рост популяции соответствует росту отдельных клеток. К синхронизации роста в периодическом режиме культивирования чаще всего прибегают с целью изучения метаболических процессов, связанных с определенными этапами цикла развития индивидуальных клеток. Синхронизация культуры наступает в том случае, когда все клетки начинают делиться с почти одинаковой скоростью При этом зависимость логарифма числа клеток от длительности культивирования приобретает ступенчатый характер в отличии от линейного при обычном асинхронном росте в периодическом режиме культивирования.

Несмотря на то, что развитие синхронной культуры происходит довольно равномерно, сохранить синхронность в течении длительного времени трудно, поскольку требуется точный контроль.

Синхронизация культуры может быть достигнута путем изменения лимитирующих факторов среды. К числу технических приемов вызывающих синхронизацию деления клеток, относятся подавление, ускорение или задержка их метаболических функций циклическим способом. При этом популяция постепенно синхронизирует свой ответ на периодические колебания метаболической активности, а затем и показатели роста. Однако, этот метод требует значительного вмешательства в нормальный процесс метаболизма, поэтому его использование ограниченно. Единственным исключением является прорастание бактериальных спор как показатель начинающейся синхронизации. Для этого резкими изменениями состава среды стимулируют прорастание спор и тем самым моделируют процессы, близкие к естественным. Однако достичь 100%-го образования спор или их прорастания практически невозможно, да и далеко не все культуры, синхронизировать которые необходимо, являются спорообразующими. Поэтому для получения однородной по своему физиологическому состоянию популяции требуется применение некоторых физических способов предварительной селекции.

Общепринятый метод синхронизации культур основан на физическом выделении гомогенной в физиологическом отношении фракции клеток из гетерогенной популяции. Такой подход называют синхронизацией путем селекции, что позволяет избежать проблем, связанных с нарушением метаболизма.

Любая гетерогенная популяция бактериальных клеток содержит в своем составе клетки готовые к делению, клетки только что разделившиеся и клетки находящиеся в стадии роста (наращивания цитоплазматической массы). Готовые к делению и только что разделившиеся клетки имеют самую высокую плотность, несмотря на различия их в размерах, а клетки, находящиеся в стадии роста, имеют наименьшую плотность, что и позволяет разделить их на различные фракции методом центрифугирования в градиенте плотности. Для более точного фракционирования клеток, по мимо градиенты плотности, избирают скорость и время центрифугирования, в зависимости от видовых особенностей культуры. Фракция с наибольшей плотностью (осадок) обычно содержит и молодые (дочерние) и зрелые (готовые к делению) клетки, а фракция с наименьшей плотностью (надосадочная жидкость)состоит из однородной гомогенной популяции клеток, находящихся в одинаковой стадии роста. Именно эта фракция используется в качестве посевного материала для осуществления синхронного роста.

Отобрав из центрифужной пробирки самую легкую фракцию клеток, её переносят в емкость подогретой ростовой средой. Тщательно измеряют оптическую плотность засеянной среды, чтобы затем определять её ступенчатое увеличение, свидетельствующее о синхронном росте культуры.

Синхронность культуры поддерживается в течение 2-4 циклов деления клеток. Если необходим более длительный период, то синхронность приходится устанавливать заново с помощью тех же технических приемов.

4. Непрерывное (проточное) культивирование микроорганизмов.

Метод проточного непрямого культивирования пришел в микробиологию из химической технологии. Непрерывные процессы имеют значительные преимущества перед периодическими: возможность специализации аппаратуры для каждой стадии непрерывного процесса, стабилизации его во времени, улучшение качества продукции, легкость регулировки и, главное, возможность автоматизации. Этими преимуществами объясняется тенденция в биотехнологии к переходу от периодических процессов к непрерывным.

Принцип непрерывного (проточного) культивирования микробов состоит в том, что в сосуд, где размножаются микроорганизмы, непрерывно подается свежая питательная среда и одновременно втекает такой же объем культуры. По такому принципу организуются две разновидности технического процесса непрерывного культивирования: процесс (технология) полного вытеснения и технология полного смещения.

4.1.Технология полного вытеснения.

При технологии полного вытеснения сосуд для выращивания микроорганизмов (трубчатый ферментер) представляет собой трубку, расположенную горизонтально или вертикально, в которую втекают среда и посевной материал и вытекает культура. Перемешивание не производится.

S₀ – концентрация субстрата в поступающей питательной среде

S – концентрация субстрата в вытекающей питательной среде

Х₀ – концентрация биомассы в поступающем посевном материале

Х – концентрация вытекающей биомассы

Таким способом сравнительно легко и несложно культивировать микроорганизмы, не требующие аэрации. С одной стороны ферментера подаются среда и посевной материал, где микробная популяция находится в начале своего развития. По ходу трубки культура «стареет», субстрат исчерпывается, накапливаются продукты метаболизма и вытекающая культура приходит в состояние аналогичное стационарной фазе роста периодической культуры. В результате такого процесса в ферментере воспроизводится полная кривая роста, но не во времени, а в пространстве. В настоящее время появились ферментативные аппараты, обеспечивающие процессы с режимом, приближающимся к полному вытеснению и при аэробном культивировании.

Процесс полного вытеснения применяется в промышленности в тех случаях, когда желательно избежать потери времени на опорожнение, стерилизацию и заполнение емкости. Его применяют в пищевой промышленности, когда используются сложные среды и стоит задача наиболее экономично провести процесс аналогичный тому, который ведется в периодическом режиме.

Пример практического применения рубчатого ферментера – анаэробная стадия при производстве пива в бешенных проточных емкостях. В этих случаях не требуется аэрации и процесс идет без перемешивания. Если этот процесс аэробный, то его ведут в батарее аэрируемых ферментеров. При этом кривая роста периодической культуры распределяется по ходу батарее.

4.2.Технология полного смешивания.

В процессе полного смешивания рост культур происходит в емкости – ферментере при интенсивном перемешивании. Перемешивание достигается продуванием воздуха или работой мешалки (или тем и другим одновременно). Во всей массе культуры условия должны быть совершенно одинаковыми. В ферментере создаются условия соответствующие одной точки кривой роста культуры. При больших потоках среды эти условия близки к фазе логарифмического роста, при малых – приближаются к условиям стационарной фазы роста культур. При таком методе может быть воспроизведена любая точка роста периодической культуры. В установившемся режиме скорость потока среды, отнесенная к объему культуры в ферментере, называют коэффициентом разбавления. Коэффициент разбавления равняется удельной скорости роста µ.

D – коэффициент добавления

F – скорость потока среды

V – объем культуры в ферментере

µ- удельная скорость роста

Это означает, что культура находится в устойчивом стационарном состоянии, в результате концентрация биомассы (Х) в ферментере остается постоянной. В таком случае скорость роста определяется коэффициентом разбавления. Она уравнивается с ним и концентрация субстрата (S) также остается постоянной (равномерно расходуемый субстрат обновляется с равномерной скоростью притока новой питательной среды).

При таком способе культивирования культура (вследствие возникновения феномена синхронизации роста) обладает способностью самостоятельно автоматически подстраиваться к измененным условиям процесса. Если условия изменяются в сторону ускорения роста, то в ферментере повышается концентрация биомассы и понижается концентрация субстрата, при замедлении роста – концентрация биомассы понизится, а концентрация питающего субстрата повысится.

При кратковременном изменении условий культивирования эти состояния микробной популяции обратимы и на изменение скорости потока культура реагирует соответствующим изменением концентрации биомассы и концентрации субстрата, не выходя из стационарного состояния. Однако, следует помнить, что чрезмерное увеличение скорости потока, причины сильно замедляющие рост, могут привести к тому, сто скорость роста (µ) окажется меньше коэффициента разбавления (F). И в таком случае культура вымоется из ферментера.

Воспроизведение в потоке определенной точки кривой роста культур широко применяется в промышленности при наращивании биомассы микроорганизмов. Хорошо отработанный периодический процесс выращивания экономически выгодно воспроизводить в проточном варианте, поскольку культура непрерывно находится в состоянии максимальной активности нужного процесса, не тратится время на освобождение емкостей и лаг-фазу.

При наращивании биомассы в проточных условиях биотехнологический процесс стремятся вести при возможно большей скорости потока, но не настолько большой, чтобы в среде оставался недоиспользованный субстрат. Таким образом получают наибольший экономический коэффициент, который при непрерывном культивировании определяют следующим образом:

S₀ – концентрация питательного вещества в поступающей среде

S – концентрация питательного вещества в культуре, вытекающей из ферментера

Х – концентрация биомассы в вытекающей культуре

4.3.Биотехнологическая реализация способов непрерывного культивирования микроорганизмов.

Существует много способов непрерывного культивирования микроорганизмов, но в биопромышленности в основном применяются два типа:

— Хемостатный, при котором состояние равновесия или стационарное состояние достигается путем регулирования поступления лимитирующих рост субстратов;

— Турбидостатный, при котором состояние равновесия или стационарное состояние культуры достигается путем удаления биомассы и замещения её свежей средой со скоростью равной скорости роста культуры.

Хемостат в отличии от турбидостата позволяет с высокой скоростью регулировать условия лимитирования роста (субстратное лимитирование), тогда как турбидостат предпочтительнее для изучения микроорганизмов в условиях близких к максимальной удельной скорости роста.

4.3.1. Хемостатный способ культивирования

µ – удельная скорость роста

µ_{мах – максимально возможная скорость роста в данной среде}

S – концентрация лимитирующего субстрата в среде

y – экономический коэффициент, или доля потребленного субстрата, пошедшего на синтез биомассы

S₀ _{– концентрация} субстрата в поступающей среде

S – концентрация субстрата в ферментере

Концентрацию субстрата в ферментере в стационарном состоянии культуры определяют по формуле:

K_s – константа Моно

D _{– коэффициент разбавления или скорость} разбавления

S – концентрация субстрата в ферментере

µ_{мах – максимально возможная скорость роста}

Скорость разбавления, или коэффициент разбавления (D) при хемостатном культивировании известен. Он равен:

F – скорость потока

V _{– объем культуры}

Таким образом, следует рассматривать количественные зависимости, существующие между:

— концентрацией биомассы – Х,

— концентрацией лимитирующего субстрата – S

— скоростью роста – µ

Графически эта зависимость характеризуется хемостатной кривой, которая выглядит следующим образом:

D_кр= µ_мах*

Производительность фермента по выходу (урожаю) биомассы рассчитывают следующим образом:

4.3.2. Турбидостатный способ культивирования.

Турбидостат представляет собой самую простую из всех хорошо перемешиваемых систем непрерывного перемешиваемых систем непрерывного культивирования. Концентрация клеток при турбидостатном культивировании регулируется постоянной подстройкой скорости поступления питательных компонентов. В отличии от хемостата концентрацию биомассы в турбидостате выбирает оператор, а скорость разбавления и соответственно концентрация субстратов поддерживается таким образом, чтобы сохранялся заданный уровень биомассы.

Турбидостатное культивирование осуществляют обычно в тех случаях, когда лимитирующий фактор не известен или в лимитирующих количествах субстрата нет необходимости. Поэтому субстрат добавляется в ферментер в избытке. Избыток концентрации всех компонентов питательной среды делает работу турбидостата стабильной даже при удельной скорости роста культуры близкой к максимальной (µ_мах). Турбидостат позволяет регулировать систему в широких инервалах концентраций биомассы при скорости разбавления близкой к критической (D_кр). Именно в этих условиях химостат менее стабилен.

Скорость разбавления в турбидостате всегда равна удельной скорости роста:

при условии Х=constanta

В свою очередь, постоянство концентрации микробной биомассы удерживают регуляцией скорости потока, которую осуществляет не оператор, а автоматическая система. В большинстве случаев с этой целью прибегают к прямому оптическому измерению мутности биомассы, котороя зависит от концентрации клеток (Х).

Для этого ферментер оборудуют фотоэлектроколлориметром или аналогичным ему устройством, работающем по принципу светорассеявания. Если концентрация клеток остается на нужном уровне питательная среда подается с заданной скоростью, а при снижении концентрации клеток подача питательной среды прекращается. Именно этот принцип работы турбидостата обеспечивает его устойчивую работу даже при коэффициенте разбавления близком к критическому – на границе вымывания клеток.

Сигналом для подачи среды может быть не только оптическая плотность (мутность), но и любой параметр среды, поддающийся измерению электродом или другим устройством, переводящим величину измерительного параметра в величину электрического потенциала. Последний усиливается и приводит в действие работу насоса, подающего раствор или питательную среду.

Поскольку основные метаболические функции (поглощение бактериями кислорода, выделение CO₂, изменение рН), тесно связанны со скоростью роста клеток и в конечном счете с удельной скоростью роста культуры, именно эти показатели чаще других используют как измеряемые переменные при регулировке потока среды.

Например, для процессов культивирования имеющих прямую связь между приростом биомассы и изменением значения рН среды, используется рН-статный способ управления скоростью потока среды. Скорость потока с помощью автоматических устройств уравнивается со скоростью изменения рН растущей популяции, а следовательно, и со скоростью роста культур. Это обеспечивает поддержание рН на заданном уровне, а скорость роста является максимальной в данных условиях. Изменяя условия, можно проследить за соответствующими изменениями максимальной скорости роста культур. В последнее время в эксплуатацию вводятся сложные комплексы ферментер-ЭВМ, обеспечивающие более высокий уровень использования турбидостатного способа непрерывного культивирования.

Как химостатное, так и турбидостатное культивирование имеют большое количество вариантов. Например, тот и другой способы могут осуществляться одностадийно и двустадийно. Одностадийное культивирование означает, что процесс ведется в одной емкости (в одном ферментере), а двухстадийное – в двух последовательных ферментерах.

Одностадийное химостатное культивирование применяется при необходимости воспроизвести любую скорость роста культур, кроме максимальной. Двухстадийное культивирование в двух последовательных ферментерах позволяет обеспечивать культуры максимальной скоростью роста и даже создать условия для ее превышения. Для этого в первом ферментере ведется культивирвание при D о содержит всего лишь 6,2 мл или 0,28 моль О_{2 .} Такого количества достаточно для окисления не более 8,3 мг, или 0,046 ммоль глюкозы (т.е. примерно одной тысячной общего количества глюкозы, содержащейся в обычных питательных средах). Поэтому в среде невозможно создать значительный запас О₂ – кислород приходиться добавлять непрерывно.

Скорость перехода молекулярного кислорода в раствор возрастает с увеличением поверхности раздела между газовой и жидкой фазами и с повышением порциального давления О₂ в газовой фазе. Для аэрации жидких культур пользуются либо обычным воздухом, либо смесью О_2, N₂ и СО₂.

Перемешиванием достигают не только гомогенности бактериальной суспензии в ферментере, но и увеличения поверхности раздела между газовой и жидкой фазами. Газы подаются в нижнюю часть ферментера, непосредственно под мешалку с тем, чтобы обеспечить их равномерное распределение по всей массе культуры. Скорость перемешивания и объем подаваемого воздуха необходимо регулировать так, чтобы концентрация растворенного кислорода никогда не падала бы ниже 10-15% начальной насыщающей его концентрации. Поддержание концентрации растворенного в среде кислорода на уровне выше 10% насыщения при соответствующей температуре позволяют выращивать большинство бактериальных культур в таких условиях, когда кислород не является субстратом, лимитирующем их рост.

Для установления в культуральной среде требуемой концентрации кислорода можно изменить как скорость ее перемешивания, так и скорость подачи воздуха. Скорость подачи воздуха измеряют специальными приборами – ротаметрами, а количество растворенного кислорода – датчиками растворенного кислорода. Эти приборы позволяют оператору управлять концентрацией растворенного кислорода как независимым параметром культивирования.

Воздух, или другой газ, поступающий в ферментер, должен предварительно стерилизоваться. Наиболее простой способ стерилизации заключается в физическом удалении микроорганизмов фильтрацией воздуха через волокнистые фильтры. В большинстве ферментеров используются заполненные стеклотканью трубчатые фильтры, но иногда применяют мембранные фильтры. В лабораторных условиях для этого можно с успехом использовать вату. В любом случае фильтры следует регулярно менять, чтобы обеспечить стерильные условия. Перед первым употреблением фильтры стерилизуют в течение 2х часов при Т=170-190 о .

5.2. Непрерывное культивирование в анаэробных условиях.

Главным условием анаэробного культивирования в ферментерах является удаление из системы кислорода. Прежде всего ферментер заполняют средой, насколько это максимально возможно, и в первые часы культивирования через среду продувают газ, не содержащий кислорода, поддерживая тем самым небольшое положительное давление. Использование больших объемов раскладки (10-20% к объему питательной среды) обеспечивает быстрое начало роста культуры и способствует уменьшению ее чувствительности к кислороду, попадающему из внешней среды.

Для культивирования анаэробов рекомендуется использовать предварительно восстанавливающую среду: её либо получают нагреванием в ферментере, либо вводят в ферментер через который предварительно пропускали газ, не содержащий кислород, уже восстановленную среду. Кислоты, щелочи и растворы питательных компонентов, добавленные в ферментер, в процессе культивирования готовят и хранят в отсутствии кислорода. Нередко удается ослабить или полностью нейтрализовать полное для анаэробов влияние кислорода, добавляя в среду восстановители (аскорбиновую кислоту, тиогликолат, цистеин или даже сульфид, если его переносят бактерии.

5.3 Контроль и регулирование темпиратуры.

Для регуляции температуры большинство лабораторных ферментеров и некоторые типы промышленных оборудуются системами нагрева (типа обычной электрической плиты) и охлаждения (теплообменник с циркулирующей в нем водой или другой охлаждающей жидкостью). Специальный температурный датчик включает систему нагрева или отключает её и регулируент подачу охлаждающей жидкости в теплообменник. Иногда ферментер помещают в термостат с постоянной регулируемой температурой. Этот способ применяют в тех случаях, когда очень необходимо точное регулирование температуры.

В промышленных ферментерах большой емкости устраивают водяную рубашку, в которую подают воду необходимой температуры.

5.4. Контроль и регулирование рН.

Ионы Н + и ОН — — наиболее подвижные из всех ионов, поэтому уже малейшее изменение их концентрации оказывает на микроорганизмы сильное влияние. В связи с этим установление и поддержание заданной оптимальной величины рН имеет существенное значение для роста.

Большинство организмов лучше растет, когда концентрации ионов Н + и ОН — примерно одинаковы (рН=7.0). Многие бактерии, например, нитрифицируемые и клубеньковые бактерии, бактерии разлагающие мочевину, актиномицены, большая часть патогенных для человека и животных бактерий, предпочитают более высокие значения рН (слегка щелочные среды). Лишь немногие толерантны к кислой среде (лактобактерий, ацетобактерий) или даже ацидофилины (тиобациллы, Л.ацитофиллюс). Грибы предпочитают низкие значения рН. Если сложные питательные среды сразличными рН инокулировать почвой, то при рН 5.0 различаются главным образом грибы, а при рН 8.0 – бактерии.

Поддержание определенного рН во время роста и размножения важно прежде всего для тех микроорганизмов, которые хотят и продуцируют кислоты, но не обладают к ним толерантностью (лактобациллы, многие псевдомонады, сен.Энтеробактериацео.). Для того, чтобы предотвратить гибель бактерий от ими не выделяемых кислот, используют несбраживаемые вещества, забуференные среды, но чаще корректировку рН ведут путем автоматическогодобавления слабых (5-10%) растворов щелочей.

Основными компонентами системы контроля рН являются рН-электроды, рН-метр, блок автоматического титрирования, сосуды с кислотой или щелоч, соединение гибкими шлангами с ферментером перистальтические насосы или соленоидные клапаны. рН-электроды должны быть устойчивы к стерилизации паром или другими средствами, например, парами окиси этилена или формальдегида. Особенно надежными в этом отношении считают электроды фирмы «Jngold», в которые могут быть автоклавированны многократно.

Большинство перемешиваемых и аэрируемых культур во время роста образует довольно много пены. Если не препятствовать этому, пена смачивает воздушные фильтры, что приводит к загрязнению культуры, а также к выходу пены наружу. Пеногашение осуществляют с помощью механического пеногасителя, или путем добавления к среде химических пеногасителей.В качестве последних чаще всего используют различные растительные масла (подсолнечное, сливковое, кукурузное, хлопчатниковое) или силиконы.

Пеногасители добавляют непосредственно в среду перед её стерилизацией или в ферментер (через шланг в его крышке). Имеются системы, обеспечивающие автоматический контроль подачи пеногасителей.

5.6. Стерилизация ферментеров и способы предотвращения микробной концентрации.

При подготовке ферментера к работе и в процессе его эксплуатации необходимо, чтобы при внесении компонентов среды и отбора проб не нарушалась стерильность и не происходило заражение ферментера посторонними микроорганизмами из внешней среды. Во избежании этого большинство лабораторных ферментеров оснащено трубной для отбора проб.

Большинство лабораторных ферментеров сконструировано таким образом, что колба, в которой осуществляется культивирование микроорганизмов вместе со всей необходимой оснасткой (рН-эоектрод, датчик растворенного кислорода, щелочи, кислоты или отбора проб) снимается со статины или основания и может быть помещена в автоклав. В таких случаях питательная среда заливается в чистую емкость (за исключением тех компонентов, которые не выдерживают стерилизации автоклавированием), монтируется вся необходимая оснастка и колба стерилизуется вместе с питательной средой. После стерилизации и охлаждения питательной среды, колба устанавливается на станину, подключается все необходимое оборудование, вносится расплодка или посевной материал (обычно это молодая 12-16 часовая культура микроорганизма к количестве около 2-5% от объема питательной среды в ферментере) и начинают процесс культивирования по данному режиму.

Промышленные ферментеры большой емкости стерилизуют путем их нагревания вместе с питательной средой под давлением, т.е. создают емкости условия, аналогичные таковым в автоклаве.

В заключении следует еще раз подчеркнуть, что между классической периодической культурой и непрерывной культурой в условиях хемостатического или турбидостатического культивирования имеются принципиальные различия. Периодическую культуру можно рассматривать как замкнутую систему, которая в своем развитии проходит четыре фазы – начальную, экспонентную, стационарную и фазу отмирания (юность, расцвет, старение и смерть). Условия существования культур во всех этих фазах различны. Автоматическое культивирование в периодической культуре осуществить трудно (врядли возможно). Непрерывная культура представляет собой открытую систему, стремящуюся к установлению динамичного равновесия. Фактор времени в ней в известной мере исключается. Для микроорганизмов создаются неизменные условия среды. Установки непрерывного культивирования легко поддаются автоматическому регулированию.

1. Промышленная микробиология. Под ред. Н.С.Егорова. М., 1989

2. Г.Шлегель. Общая микробиология (пер.с нем.) М., 1987

3. Биологические и химиотерапевтические ветеринарные препараты. 3 изд. М., ВГИКИ, 1963

4. Р.Стейнер и др. Мир микробов (пер. с нем.) М., т.2, 1979

5. К.А.Калунянц и др. Оборудование микробиологических производств. М., 1987

6. У.Э.Виестур и др. Биотехнология. Биологические агенты, технология, аппаратура. Рига, 1987

Источник