О.В. Мосин
Лимонную кислоту широко используют в пищевой, медицинской, фармацевтической, лакокрасочной промышленности и в некоторых других отраслях народного хозяйства.
Около 60 лет назад лимонную кислоту выделяли преимущественно из плодов цитрусовых растений. Теперь же основную массу ее производят с помощью определенных штаммов плесневого гриба Aspergillus niger. В настоящее время ведущими производителями лимонной кислоты являются КНР, США, Франция, Россия и некоторые другие страны. Ранее, начиная с 1917 г., производство лимонной кислоты было основано на поверхностном культивировании микроба-продуцента; в 1938-1942 гг. освоено также глубинное культивирование в герметичных ферментаторах. Благодаря этому удалось механизировать и автоматизировать процесс, эффективнее использовать производственные площади и снизить себестоимость целевого продукта, сократить общую продолжительность технологического цикла, облегчить поддержание асептичности в производственных условиях.
Ныне в производстве применяют селекционированные штаммы A. niger, дающие выход лимонной кислоты 98-99% в расчете на потребленную сахарозу и обладающие повышенной осмотолерантностью (при начальных концентрациях сахара в питательной среде порядка 12%).
Лимонная кислота, как трехосновная оксикарбоковая кислота, наряду с глюконовой, фумаровой и другими, является интермедиатом метаболизма в цикле трикарбоновых кислот, когда имеет место неполное окисление соединений углерода в аэробных условиях. Ее сверхсинтез возможен при лимитировании гриба — продуцента по железу и фосфору, при одновременном избытке в среде источника углерода и при низких значениях рН. Лимонная кислота накапливается вначале в клетках продуцента, а затем выделяется в культуральную среду.
Вышеперечисленные факторы ингибируют такие ферменты, как аконитат-гидратазу, изоцитратдегидрогеназу и, возможно, -кетоглутаратдегидрогеназу. Поэтому не происходит полного метаболизма лимонной кислоты в ЦТК и ее можно получать в достаточно больших количествах с коммерческими целями.
Поскольку основным сырьем для производства лимонной кислоты является меласса, в которой содержится много железа, то на стадии предферментации необходимо его осадить с помощью желтой кровяной соли — Kd [Fe(CN6)J. К тому же доказано, что эта соль и лимонная кислота в клетках выступают ингибиторами изоцитратдегидрогеназы.
Известны два способа ферментации Aniger — поверхностный и глубинный. Первый из них реализуют на предприятиях малой и средней мощности в виде жидкофазной ферментации на жидкой среде (например, в ряде стран Европы и Америки) и в виде твердофазной ферментации (например, в Японии) на уплотненной среде. Технологическая схема жидкофазной ферментации представлена по Р. Я. Карклиныпу и А. К. Пробоку (1972) на рис. 1.
В отдельном цехе осуществляют наработку спор (конидий) гриба в виде трехстадийной схемы. В первую стадию A.niger выращивают на скошенной агаризованной среде (например, на сусло-агаре) в пробирках, во вторую и третью стадии его размножают на плотной или жидкой среде соответственно в колбах Эрленмейера или в алюминиевых кюветах площадью 8,5-12 дм2 и с высотой бортиков от 7 до 20 см. Продолжительность каждой стадии — от 2 до 4 суток при температуре 32?С. При образовании и созревании конидий вначале бесцветный мицелий становится затем черным; конидии собирают по принципу аспирации (по лат. aspiratio — вдыхание, надувание) специальным вакуумным насосом, подсушивают в термокамере при 28-30?С, смешивают со стерильным активированным углем (1:2), фасуют в стерильные флаконы (колбы) и хранят в течение от полутора до двух лет. С 10 дм2 питательной среды в кюветах можно получить до 4-5 г сухих конидий. Подобный посевной материал может быть самостоятельным коммерческим продуктом, поставляемым на заводы лимонной кислоты.
Поверхностный, способ жидкофазной ферментации A.niger для промышленного производства лимонной кислоты реализуют в «бродильных камерах», где размещают на стеллажах названные выше кюветы (8-10 штук на один стеллаж) одну над другой. На дне каждой кюветы имеется сливной штуцер. «Бродильные камеры» оборудованы приточно-вытяжной вентиляцией, обеспечивающей равномерный приток стерильного воздуха заданной температуры и влажности (3-4 м3/м2 мицелия x ч -1). Температура в камерах поддерживается на уровне 34-36?С, высота питающего слоя жидкой мелассной среды 6-12 см. Максимальное тепловыделение (500-550 кДж/м2 x ч) имеет место к 5 суткам; исходная концентрация Сахаров в питательной среде в среднем порядка 12%; начальное значение рН 6,8—7,0 снижается до 4,5 в течение первых трех суток и до 3,0 — к концу процесса (8-9 сутки). Максимальное кислото-образование в таких условиях происходит на 5-6 сутки (100-105 г/м2 пленки гриба-ч -1, а затем стабильно удерживается на уровне 50-60 г/м2x ч1.
Из трех вариантов проведения технологического процесса (периодический, или бессменный; сменный и доливной) наилучшим оценивают доливной, когда через б-7 суток от начала процесса ферментации (концентрация сахара снижается до 3-4%) подливают стерильный раствор мелассы без питательных солей — 30-35% начального объема (не забывать рационально использовать объем кювет при первоначальном заполнении питательной средой с учетом ее испарения). Таким путем добиваются продления цикла ферментации до 12 суток, а с этим на 30-35% возрастает количество перерабатываемой среды для получения целевого продукта. При сменном (одно- и многосменном) методе кулътуралъную жидкость в конце ферментации сливают из-под пленки, пленку снизу промывают стерильной водой и под нее же заливают свежую стерильную питательную среду, содержащую только углевод и лишенную минеральных солей. Ферментацию продолжают еще 4-6 суток.
В собранной культуральной жидкости содержится смесь органических кислот — лимонная, глюконовая, щавелевая и неиспользованный сахар в примерном соотношении 45-50:3:1:7, то есть лимонная кислота составляет от 80 до 90%. Ее выделяют химическим путем — добавляют к нагретой до 100?С культуральной жидкости известковое молоко — Са(ОН)2 или мел — СаСО3, доводя рН до 6,8-7,0; это количество составляет примерно 2,5-3%; трехзамещённый кальция цитрат, хуже растворимый в горячей воде, чем в холодной, выпадает в осадок вместе с кальция оксалатом (кальция глюконат остается в растворе); осадок отфильтровывают, промывают горячей водой и гидролизуют серной кислотой. Свободная лимонная кислота остается в растворе, а негидролизованный кальция оксалат и образовавшийся гипс — CaSO4 остаются в осадке. Раствор лимонной кислоты очищают, подвергают вакуум-упариванию и кристаллизуют. Кристаллы кислоты высушивают и фасуют (Рис.1).
Рис. 1. Технологическая схема получения лимонной кислоты из мелассы поверхностным способом (жидкофазная ферментация): 1 — цистерна для мелассы, 2 — центробежные насосы, 3 — реактор для разбавления мелассы, 4 — стерилизатор, 5 — бродильная камера, 6 — сборник сбраживаемых растворов, 7 — нейтрализатор, 8, 10 — нутч-филь-тры, 9 — расщепитель, 11 — сбор-ник-монтежю, 12 — вакуум-аппарат, 13-дисольвер, 14 — фильтр-пресс, 15 — кристаллизатор, 16 — приемник, 17 — сушилка, 18 — готовая продукция, 19 — сборник фильтрата.
Мицелий продуцента либо используют для выделения фермента пектиназы, либо высушивают и поставляют на корм скоту и домашней птице (желательно — в обезвреженном — убитом виде); наконец, он может быть использован, как источник флавинов.
Твердофазная ферментация на уплотненных средах для получения лимонной кислоты — наиболее простой способ из всех известных, ферментацию определенного штамма A.niger, резистентного к высоким концентрациям металлов (особенно — железа), содержащихся в семенах злаковых растений, проводят на увлажненных отрубях риса или пшеницы, находящихся в кюветах. Условия биосинтеза кислот при этом аналогичны условиям на агаризованных или в жидких питательных средах. После окончания процесса отруби экстрагируют водой, куда переходят кислоты, а затем выделяют цитрат кальция и чистую лимонную кислоту согласно схеме, изложенной выше.
Общая технологическая схема получения лимонной кислоты при глубинной ферментации A.niger приведена на рис. 2.
Рис. 2. Технологическая схема получения лимонной кислоты при глубинной ферментации продуцента: 1 — емкость с мелассой, 2 — приемник мелассы, 3 — весы, 4 — варочный котел, 5 — центробежный насос, 6 — промежуточная емкость, 7 — стерилизующая колонка, 8 — выдержива-тель,9—холодильник, 10 — посевной аппарат, 11 — головной ферментатор, 12 — стерилизующие фильтры, 13 — емкость для хранения мелассы, 14 — промежуточный сборник, 15 — барабанный вакуум-фильтр, 16 — приемник для мицелия, 17 — вакуум-сборник для мицелия, 18 — вакуум-сборник фильтрата культуральной жидкости,
Согласно подсчетам глубинный метод экономически выгоден в тех случаях, когда мощность завода превышает 2,5 тыс. тонн лимонной кислоты в год, в противном случае поверхностный метод оказывается предпочтительнее из-за меньших энергозатрат и себестоимости продукции.
Лимонную кислоту можно получать из н-парафинов с помощью дрожжевых организмов рода Candida — C.lipolytica, C.tropicalis, C.parapsilosis, C.oleophila, C.guilliermondii, C.zeylanoides. Наиболее активными из них являются дрожжи C.lipolytica. К тому же другие виды (кроме C.oleophila) относят к разряду условно патогенных.
Кроме лимонной дрожжи образуют на н-алканах Tpeo-Ds-изо-лимонную, представляющую собою геометрический изомер лимонной кислоты.
При лимитировании продуцента в азоте, фосфоре, сере и магнии, но при избытке в среде парафина, можно наблюдать сверхсинтез равных количеств обоих изомеров. Методами генетики и селекции получены мутанты, синтезирующие лишь один какой-либо изомер лимонной кислоты. Накопление целевого продукта может достигать 200 г/л и выше при выходе кислоты от использованного парафина более чем 140%.
Культивирование C.lipolytica проводят в ферментаторах при интенсивных перемешивании и аэрации среды. В нашей стране отработаны методы получения лимонной и изолимонной кислот на н-алканах. Большая заслуга в этом принадлежит Т. В. финогеновой. Получаемые технические соли цитраты и изоцитраты имеют важное значение при изготовлении, например, моющих и других веществ.
Биотехнология/под ред. И. Хиггинса, Д. Беста, Дж. Джонса/перевод с английского/под ред. А. А. Баева. — М.: Мир, 1988. — 479 с.
Биотехнология микробного синтеза/под ред. М. Е. Бекера — Рига: Зинатне, 1980. — 350 с.
Воробьев Л. И. Техническая микробиология. — М.: Высшая школа, 1987. — 94 с.
Д е б а б о в В. Г., Лившиц В. А. Биотехнология. — М.: Высшая школа, 1988.
Кн. 2. Современные методы создания промышленных штаммов микроорганизмов. 1988. — 208 с.
Промышленная микробиология и успехи генетической инженерии. Сборник: перевод с английского под ред. Г. К- Скрябина. — М.: Мир, 1984. — 172 с.
Смирнов В. А. Пищевые кислоты. — М.: Легкая и пищевая промышленность, 1983. — 240 с.
Basic biotechnology Ed. by John Bu’Lock and Bjern Kristiansen.- Acad. Press, London, Orlando San Diego, New York, Austin, Boston, Sydney Tokio, Toronto, 1987. — 561 p.
Источник
Способ получения лимонной кислоты глубинным методом
РЕСПУБЛИК (19) (111
ace(;q ÄÄ-, l ЕА. У д „„.„», ИМЦ1г»;,,„-, J3 ®E Y(0 П;:
К ABTOPCHOMY СВИДЕТЕЛЬСТВУ
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР
ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 3545952/28-13 (22) 20. 12. 82 (46) 30.03.86. Бюл. Ф 12 (7 1) Ленинградский межотраслевой научно-исследовательский институт пищевой промьппленности (72) В.П. Ермакова, Е.Я.Щербакова, В.И.Кузьмин, А.А.Веселова, Т.В.Петрюк и В.M.Финько ,(53) 661.734.1(088.8) (56) Авторское свидетельство СССР
И — 659609, кл. С 12 Р 7/48, 1979.
Авторское свидетельство СССР
11 153707, кл. С 12 P 7/48, 1963. (54) (57) 1. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЛИМОННОИ КИСЛОТЫ ГЛУБИННЫМ МЕТОДОМ, включающий посев спор гриба-продуцента
Aspergillus niger в условиях аэрации и перемешивания в посевной ферментатор, подращивание на мелас-: сном растворе кислотообразующего мицелия, ферментацию на мелассной среде в основном ферментаторе ивьщеление лимонной кислоты, о т л и ч аю шийся тем, что, с целью повышения выхода лимонной кислоты, для д114 С 12 P 7/48, С 12 R 1 685 подращивания мицелия используют мелассный раотвор с концентрацией сахара 4,5-6,0Х, при этом подращивание ведут в течение 24-36 ч для ферментации используют мелассную среду с концентрацией сахара 13-14%, ферментацию проводят в течение 4,55,5 сут., а на вторые и третьи сутки ферментации проводят долив стерильной воды в количестве 4-5% от объема среды, причем в качестве гриба-продуцента используют Aspergillus
2. Способ по п. 1, о т л и ч аю шийся тем, что, с целью создания оптимальных условий для ферментации при использовании меласс с содержанием кальция свьппе 0,8%,в . мелассную среду вводят щавелевокислый аммоний в количестве, необходимом для осаждения 1/2 солей кальция, содержащихся в мелассе, и сернокисльж цинк в количестве 10-17 мг на 1 л мелассной среды, при этом общееколичество мелассной среды берут исходя из заполнения объема основного ферментатора на 70-75Х.
Изобретение относится к пищевой промышленности, а именно к технологии получения пищевых органических кислот, в частности лимонной. кислоты, способом глубинной ферментации угле-,5 водсодержащего сырья, например мелассы, погруженной культурой микроорганизма — продуцента лимонной кислоты.
Цель изобретения — повьппение выхода лимонной кислоты и создание 1О .оптимальных условий для ферментации при использовании меласс с содержанием кальция свьппе 0,8%.
Способ осуществляют следующим образом. 15
Посевной мицелий в течение 2436 ч выращивают на среде из мелассы, содержащей 4,5-6Х сахара, в одну стадию: для ферментации подготавливают мелассную среду с начальной 20 концентрацией сахара 13-14%. В качестве ингибитора образования побочных кислот применяют сернокислый цинк в дозе, соответствующей 10-17 мг на литр среды. Объем заполнения фер- 25 ментатора 70-75Х. Увеличение концентрации свыше 6Х приводит к непроизводительному расходу сахара, дополнительным затратам сырья. Умеиьше» ние концентрации ниже 4,5% настолько 50 увеличивает период адаптации грибапродуцента в результате резкого перепада концентрации питательных веществ при переводе подрощенного мицелия в ферментированные растворы, что процесс становится нерентабельным.
Использование мелассной среды с высокой концентрацией сахара и одновременное заполнение объема ферментатора на 70-?5X позволяет использовать в одном цикле (без дополнительных подливов) до 7,5 т мелассы и, следовательно, получить высокий валовый выход лимонной кислоты с ферментатора. При использовании концентрированных мелассных сред, когда весь запас питательных веществ дается сразу, процесс адаптации и роста гриба происходит с первых суток, а затем идет активный биосинтез лимонной кислоты, увеличение титруемой кислотности без снижения до конца процесса.
Для обеспечения нормальной аэрации в ферментаторе эрлифтного типа и более полной утилизации субстрата, в процессе ферментации на 2-е и 3-и сутки производят долив стерильной воды в количестве 4-5% от объема ферментатора. Продолжительность ферментации 4,5-5,5 сут °
Необходимость доливов стерильной воды вызвана тем, что в результате испарения среды увеличивается вязкость растворов, возрастает концент-, рация продуктов метаболизма гриба, ухудшаются условия питания и газообмена. Доливы воды в количес,тве
4-5% от объема среды снимают эти негативные явления и улучшают условия кислотообразования. Выбранное время долива (2-е и 3-и сутки ферментации) наиболее благоприятно, так как именно в этот период в результате нарастания мицелиальной массы и высокой степени аэрации происходит значительное испарение среды и накопление продуктов жизнедеятельности гриба. При более позднем сроке начала доливов происходит снижение технологических показателей процесса. Прозводить долив воды на первые сутки нецелесообразно, так как гриб только начинает накапливать биомассу и любые операции, связанные с доливом, увеличивают вероятность инфицирования среды.
В качестве гриба-продуцента используют осмофильный штамм Aspergil(us niger Л-4 (штамм депонирован в
Центральном музее промьппленных микроорганизмов института «ВНИИгенетика» под номером Г-171) .
Высокая исходная степень заполнения ферментаторов достигается в результате частичного (1/2) осаждения солей кальция щавелевокислым аммонием. Вследствие этого происходит сравнительно небольшое вспенивание среды, что позволяет сохранить необходимый уровень заполнения ферментатора на 70-75Х. При полном осаждении солей кальция возрастает содержание азота, что способствует накоплению побочных кислот, в частности щавелевой.
Дозировка ZnSO зависит от испольФ зуемых образцов мелассы, от доз ферроцианида кальция и щавелевокислого аммония, применяемых для обработки мелассы. Вещества, используемые для осаждения тяжелых металлов и солей кальция, не имеют избирательного действия и в процессе соосаждения выводят из раствора ряд необходимых микроэлементов, в том числе и Zn.
Источник
