Научная электронная библиотека
Перетрухина А. Т., Блинова Е. И.,
Глава 7. ВЫДЕЛЕНИЕ ГАММА-ГЛОБУЛИНА
Широкое практическое применение в настоящее время имеет метод очистки, сводящийся к выделению гамма-глобулиновой фракции иммунных сывороток. Наиболее детально этот метод изучен применительно к получению так называемого «коревого» гамма-глобулина из человеческой крови:
В последние годы интенсивно изучаются методы выделения гамма-глобулина из гипериммунных сывороток против клещевого энцефалита, бешенства, лептоспироза, сибирской язвы. Обнадеживающие результаты получены при выделении гамма-глобулина из некоторых антитоксических сывороток.
Принцип метода сводится к фракционированию сывороток спиртоводными осадителями при разных значениях рН и при температуре ниже нуля. Целью фракционирования является отделение иммунного гамма-глобулина от альбумина, альфа- и бета-глобулинов. Очистка проходит в три стадии.
1 стадия. Условия: концентрация спирта 25 %, Т °С 5 °С, рН 6,8-7,2
В осадок выпадает гамма-глобулиновая фракция; кроме того, он содержит значительные примеси, главным образом, бета-глобулина. Раствор, содержащий альбумины, а также часть альфа- и бета-глобулинов после отделения осадка путем фильтрации или центрифугирования выбрасывают. Осадок растворяют в солевом растворе
(0,01 М — NаС1), после чего осуществляется вторая стадия очистки.
2 стадия. Условия: концентрация спирта 13-17 %, Т °С -3. -6 °С, рН 5,1.
В осадок выпадает бета-глобулин, липоидные вещества и небольшое количество альфа- и гамма-глобулинов. После отделения осадка раствор, содержащий очищенный гамма-глобулин, подвергается дальнейшей обработке.
3 стадия. Условия: концентрация спирта 25-26 %, Т °С 5. 6,5 °С, рН 7,0-7,2, NаС1 0,05-0,07 мл.
В осадок выпадает гамма-глобулин.
Для лучшей очистки гамма-глобулина допускается переосаждение белковых осадков, полученных на 1-й и 3-й стадиях очистки. Повторным извлечением гамма-глобулина из балластных белков после 2-го осаждения достигается повышение выхода.
Конечный выход гамма-глобулина составляет 8-10 % от общего белка сыворотки. Для удаления спирта и получения в сухом виде осадок подвергается сублимационному высушиванию.
Сухой гамма-глобулин до растворения может сохраняться в вакуум-эксикаторе над хлористым кальцием или иным поглотителем влаги не долее одного месяца.
Дальнейшей обработке может подвергаться и сырой осадок, максимально освобожденный от спирта путем суперцентрифугирования и отстаивания в течение 12-18 часов при температуре -5 °С.
При изготовлении жидкого гамма-глобулина осадок растворяется в физиологическом растворе или дистиллированной воде (если растворяется сухой осадок, в котором содержится NаС1) так, чтобы довести количество белка до 10-10,5 %. Содержание NаС1 в растворе должно быть доведено до 0,85 %. В качестве консерванта к препарату добавляется мертиолят в конечной концентрации 1:15000.
В 10 %-м растворе гамма-глобулина устанавливается рН 7,0-7,5 и с помощью рефрактометра точно проверяется количество белка. После этого раствор подвергается стерилизующей фильтрации при температуре 2-8 °С.
Разливка в ампулы производится после проверки-стерильности. Готовый препарат должен быть прозрачным или слегка опалесцирующим и содержать 10 % белка. Каждая серия контролируется методом электрофореза. Выпуск препарата допускается в том случае, если гамма-глобулиновая фракция составляет 97 % от количества общего белка.
Содержание спирта в готовом препарате в тех случаях, если обработке подвергался сырой осадок, не должно превышать 4,5 %. Каждая серия профильтрованного гамма-глобулина подвергается контролю на стерильность и безвредность. Отличие от контроля безвредности сывороток заключается в количестве вводимого препарата (свинке вводится 1 доза гамма-глобулина) и длительности срока наблюдения (за мышами наблюдают 4 дня). Годным признается препарат, не вызывающий общих и местных реакций в течение периода наблюдения.
Препараты гамма-глобулина должны сохраняться при температуре 4-10 °С. Срок годности их полтора года; по истечении этого срока, если препарат не изменил своих физических свойств, он может применяться в течение еще одного месяца.
Применение сывороточных препаратов
Сыворотки и гамма-глобулины применяются с профилактическими и лечебными целями. И в том и в другом случаях важно, чтобы антитела быстро проникали в кровь. В связи с этим препараты эти вводят внутримышечно, откуда они быстро всасываются. Применяемое раньше внутривенное введение теперь не практикуется из-за возможных при этом способе введения шоковых реакций. Известно, что сывороточные препараты, содержащие чужеродный для человеческого организма белок, вызывают сенсибилизацию его; при повторных введениях препарата, аналогичного происхождения это приводит к развитию нежелательных реакций повышенной чувствительности.
Очищенные от балластных белков сыворотки в значительной степени, но не совсем, освобождаются от сенсибилизирующих свойств. В связи с этим как нативные, так и очищенные сывороточные препараты должны вводиться с соблюдением определенных правил предосторожности. В настоящее время все иммунные сыворотки снабжаются разведенной (1:100) очищенной лошадиной сывороткой, разлитой в отдельные ампулы по 1 мл. Эта сыворотка предназначена только для выявления состояния повышенной чувствительности у детей и взрослых к белку лошадиной сыворотки. Для лечения и профилактики инфекционных болезней она не применяется.
Разведенную сыворотку употребляют непосредственно перед введением лечебной или профилактической дозы всех видов антитоксических сывороток с целью предупреждения анафилактических реакций. Сыворотка вводится внутрикожно в сгибательную поверхность предплечья в объеме 0,1 мл. Наблюдение за реакцией ведется в течение 20 минут.
Если диаметр папулы за это время не превышает 0,9 см и вокруг нее отмечается ограниченная гиперемия, реакция считается отрицательной. В таком случае иммунную сыворотку вводят подкожно, сначала в количестве 0,1 мл, если реакция отсутствует — через 30 мин — 1 час всю остальную.
При положительной реакции на разведенную сыворотку, введенную внутрикожно, папула увеличивается в диаметре до 1-3 и более сантиметров и окружена большой зоной гиперемии. В этом случае, если имеются безусловные показания к введению сыворотки, это делают с особыми предосторожностями. Сначала вводят под кожу разведенную сыворотку в дозах 0,5-2,0-5,0 мл с интервалами 15-20 минут. Если реакция отсутствует, то вводят неразведенную сыворотку, сначала 0,1 мл, а затем через 30 минут, при отсутствии реакции, — всю остальную.
Если в ответ на введение малых доз возникает реакция, рекомендуется вводить сыворотку под наркозом (гексоналовым, пентоталовым и др.).
Усложнение приемов серотерапии и профилактики оправдывается стремлением предохранить организм от осложнений, связанных с повышенной чувствительностью к чужеродному белку в тех случаях, когда это не может послужить поводом к отмене введения сыворотки (дифтерия, столбняк, ботулизм, клещевой энцефалит и др.).
При появлении анафилактических реакций больному вводят адреналин, эфедрин, новокаин, хлористый кальций, глюкозу, гормональные препараты и сердечные средства в дозах, указанных в специальных наставлениях, которыми снабжается каждая коробка с сывороточными препаратами.
В этом разделе необходимо остановиться на перспективах использования гамма-глобулина, выделенного из человеческой крови. До недавних пор он, применялся, гласным образом, для профилактики кори. Однако его применение для предупреждения других болезней, показало несомненную ценность. Это обусловлено содержанием в нем антител против соответствующих возбудителей (коклюша, оспы, по-видимому, эпидемического гепатита). Выпускается же гамма-глобулин без указания титра, антител, за исключением титра гриппозных антител в гамма-глобулине, полученном из крови иммунизированных гриппозной вакциной доноров. По-видимому, в ближайшее время будут указываться титры и других антител. Возможно, что расширится приготовление гамма-глобулинов из крови иммунизированных разными антигенами доноров. Таким образом человеческий гамма-глобулин перестанет быть только «коревым» и распространит свое влияние на другие области инфекционной патологии.
Источник
Способ получения гамма-глобулина
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГАММАГЛОБУЛИНА путем обработки биологической жидкости хлороформом с последующей очисткой, отличающийся тем, что, с целью повышения степени очистки целевого продукта с сохранением степени специфической активности, в биологическую жидкость перед обработкой хлороформом добавляют полиэтиленимин в конечной концентрации 0,5-1,5%, далее обработку проводят полиакриловой кислотой в конечной концентрации 0,2-0,6%, причем конечная концентрация хлороформа составляет 5-10%.
„„SU„„1119697 А зш А 61 К 39/395
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР
ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ
К А ВТОРСКОМУ СВИД=ТЕЛЬСТВУ
I (/ (21) 3446749/28-13 (22) 28.05.82 (46) 23.10.84. Бюл. № 39 (72) Ж. А. Шажко, В. А. Мищенко, Н. А. Улупов, В. В. Михалишин, Н. Н. Шуть
А . Б. Смирнов и Н. А. Яременко (71) Всесоюзный научно-исследовательский ящурный институт (53) 612.11.12 (088.8) (56) 1. Руководство по вакцинному и сывороточному делу. Под ред. П. Н. Бурга-. сова. M., сМедицина», 1978, 315 — 321.
2. Шажко Ж. А. и др. Актуальные проблемы ветеринарной вирусологии. Владимир.
1977, с. 152 — 154 (прототип). (54) (57) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГАММАГЛОБУЛИНА путем обработки биологической жидкости хлороформом с последующей очисткой, отличающийся тем, что, с целью повышения степени очистки целевого продукта с сохранением степени специфической активности, в биологическую жидкость перед обработкой хлороформом добавляют полиэтиленимин в конечной концентрации 0,5 — 1,5%, далее обработку проводят полиакриловой кислотой в конечной концентрации 0,2 — 0,6%, причем конечная концентрация хлороформа составляет 5 — 10%.
Изобретение относится к вирусологии и может быть использовано в клинической и диагностической работе, а также при изготовлении антительных препаратов для иммунохимических реакций и пассивной иммунизации.
Чистота препаратов антител, получаемых при использовании этого метода, зависит от того, сколь большая часть гамма-глобу.линов приходится на долю выделяемых антител, а также от степени предварительного tO удаления балластных веществ, главным образом липопр1ттеинов.
Известен способ получения гамма-глобулина путем его фракционирования по методине Кона спиртовым осаждением на холоде (11.
Использование спиртового метода Кона получения гамма-глобулина ограничено трудоемкостью, длительйостью процедуры, необходимостью большого количества холодильного оборудования. К тому же пре- 20 параты, полученные из молока и молозива, содержат кроме гамма-глобулина альбумин, сС. и р -глобулины и молочные сахара..
Известен также способ получения гаммаглобулина, включающий очистку сыворотки от балластных белков путем ее о4работки охлажденным хлороформом в их изоэлектрической точке при рН 5,0 — 5,6 с последующим концентрированием препарата известным образом, например путем обработки Зо жидкости сульфатом аммония 40 — 500/о-ного насыщения, сульфатом натрия в 18О/о-ной конечной концентрации в растворе или полиэтиленглнколем М.В. 6000 †100 дальтон в 8 в 10О/о-ной конечной концентрации (2).
Однако известные способы не обеспечи- З5 вают высокой степени очистки целевого продукта с сохранением необходимой степени специфической активности. Длительный и сложный технологический процесс включает открытые стадии и стадии, оказыва- 4р ющие денатурирующие воздействия на сывороточные белки, что является одной из причин снижения активности сывороток на 20 — 30о/оЦель изобретения — повышение степени очистки гамма-глобулина с сохранением 45 высокой специфической активности.
Указанная цель достигается тем, что согласно способу получения гамма-глобу- лина путем обработки биологической жидкости хлороформом с последующей очисткой, в биологическую жидкость перед обработкой хлороформом добавляют полиэтиленимин в конечной концентрации 0,5—
1,5 /о, далее обработку проводят полиакриловой кислотой в конечной концентрации 0,2 — 0,6 /р, причем конечная концентрация хлороформа составляет 5 — 10 /о.
Учитывая сложный состав таких биологических жидкостей, как сыворотка крови, молоко, молозиво, желчь, феномен селективного выделения гамма-глобулина обработкой полиэтиленимином, хлороформом и полиакриловой кислотой можно объяснить следующим образом:. с помощью полиэтиленимина удаляются из биологической жидкости альбумин и основная часть мелкомолекулярных белков (преальбумин, трансферин, постальбумин и др.), полиэтиленимин флоккулирует в этом случае белки с малым суммарным зарядом; хлороформ денатурирует крупномолекулярные структурные компоненты, но с малым суммарным зарядом, в том числе липопротеины, глюкопротеины и в последующем переводит их в нерастворимое состояние; при обработке полиакриловой кислотой осаждаются альфа-2-макроглобулины и бета-глобулины, а также образовавшиеся на вышеуказанных этапах агрегаты денатурированного белка и остатки полиэтиленимина.
Селективное выделение гамма-глобулина возможно только вышеуказанной nooseредной обработкой. Изменение очередности обработки не дает подобного эффекта, так как присутствие в биологической жидкости мелкомолекулярных белков снижает эффективность удаления крупномолекулярных компонентов — липопротеинов, глюкопротеинов и др. После этой обработки в биологической жидкости, в основном, находятся крупномолекулярные белки, из которых в дальнейшем с помощью полиакриловой кислоты удается получить гамма-глобулин.
Пример 1. К 100 мл сыворотки крови крупного рогатого скота добавляют равное количество дистиллированной воды, а затем по каплям добавляют 10 мл 10О/q-ного водного раствора полиэтиленимина, создав таким образом его 0,5 /р-ную конечную концентрацию в смеси. Смесь перемешивают до образования флоккул в течение 5 — 10 мин
После образования флоккул в жидкость добавляют 10 мл хлороформа, что составляет 5О/р его конечной концентрации в растворе, и ее энергично гемогенизируют в течение 5 — 10 мин. После центрифугирования в течение 20 мин при 3000 об./мин в надосадочную жидкость добавляют 10 мл 4О/q-ной полиакриловой кислоты, что составляет
0,2 /р ее конечной концентрации в растворе.
Затем проводят центрифугирование при
3000 об./мин 20 мин. Для дальнейшего применения используют надосадочную жидкость. При необходимости получения препарата с более высокой удельной серологической активностью гамма-глобулин концентрируют известным образом, например путем обработки жидкости сульфатом аммония 40 — 50О/р-ного насыщения, сульфатом натрия в !8 /р-ной конечной концентрации в растворе или полиэтиленгликолем в 8—
10О/о-ной конечной концентрации. Полученный осадок ресуспендируют в заданном
3 объеме и используют для дальнейших исследований.
Пример 2. К 100 мл молока крупного рогатого скота (рН 7,0 — 7,5) добавляют
10 м 10 /О-ного водного раствора полиэтилнимина, создав таким образом его 1 /p-ную конечную концентрацию. Смесь перемешивают 5 — 10 мин. После образования флоккул в жидкость добавляют 5 мл хлороформа, что составлят 5 его конечной концентрации, и ее энергично гемогенизируют в течение 10
5 — 10 мин. После центрифугирования в течение 20 мин при 3000 об./мин в надосадочную жидкость добавляют 10 мл 4 /о-ной полиакриловой кислоты, что составляет 0,4О/О ее конечной концентрации. Затем сыворотку центрифугируют, а для дальнейшей работы используют надосадочную жидкость, При необходимости получения препарата с более высокой удельной серологической активностью гамма-глобулин концентрируют известным . образом, например путем об- щ работки жидкости сульфатом аммония 40—
— 50О/О-ного насыщения, сульфатом натрия в
18О/p-ной конечной концентрации в растворе или полиэтиленгликолем в 8 — 10О/о-ной конечной концентрации. Полученный осадок суспендируют в заданном объеме и используют для дальнейших исследований.
Пример 3. К 100 мл молозива свиней (рН 7,0 — 7,6) добавляют 10.мл 10О/р-ного водного раствора полиэтиленимина, создав таким образом его 1 /О-ную конечную кон- 30 центрацию в растворе. Смесь перемешивают 5 — 10 мин. После образования флоккул в жидкость добавляют 10 мл хлороформа, что составляет 10 /о его конечной концентрации, и энергично гемогенизируют в течение 5 — 10 мин, а затем центрифугируют З5 при 3000 об./мин 20 мин. В надосадочную жидкость добавляют 10 мл 4О/p-ной полиакриловой кислоты, что составляет 0,4% ее конечной концентрации, и центрифугируют при 3000 об./мин 20 мин. Последующее 40 концентрирование с помощью средств, указанных в примерах 1 и 2, не всегда целесообразно в связи с высоким содержанием антител в молозиве.
Пример 4. К 100 мл желчи свиней (рН
7,0 — 7,6) добавляют 15 мл 10О/о-ного водного раствора полиэтиленимина, что составляет 1,5 /О его конечной концентрации. Жидкость перемешивают 5 — 10 мин. После образования флоккул в жидкость добавляют
10 мл хлороформа, что составляет 10О/О его конечной концентрации, и ее энергично гомогенизируют 5 — 10 мин, а затем центрифугируют при 3000 об./мин 20 мин. В надосадочную жидкость добавляют 15 мл 4%-ной полиакриловой кислоты, что составляет
О,бо/о ее конечной концентрации в растворе, и центрифугируют при 3000 об./мин 20 мин
При необходимости получения препарата с
4 более высокой удельной серологической активностью гамма-глобулин концентрируют известным образом, например путем обработки жидкости сульфатом аммония 40—
50О/р-ного насыщения, сульфатом натрия в
18О/О-ной конечной концентрации в растворе или полиэтиленгликолем в 8 — 10 /р-ной конечной концентрации. Полученный осадок ресуспендируют в заданном объеме и используют для дальнейших исследований.
Результаты опытов по выделению гаммаглобулиновой фракции из молока и молозива представлены в табл. 1.
Данные табл, 1 свидетельствуют об универсальности способа получения гамма-глобулинов. Так при получении гамма-глобулинов из молозива, содержание белка уменьшилось в 7 раз, потери активности не было отмечено. На примере с молоком была отмечена небольшая потеря специфической активности в реакции нейтрализации, но не в РРИД.
В табл. 2 представлены результаты опытов по получению гамма-глобулинов с использованием известного (контрольного) и предлагаемого способов.
Из табл. 2 видно, что предлагаемый способ по сравнению с известным позволяетполучать гамма-глобулины со значительно большей удельной серологической активностью (1,33 — 7,54 раз). Эта закономерность подтверждена и с сыворотками других видов животных (табл. 3). Кроме того, необходимо отметить, что это подтверждено на примере вируснейтрализующих и преципити рующ их антител.
Из табл. 4 видно, что при обработке сыворотки по предлагаемому способу происходит селективное выделение гамма-глобулина.
Предлагаемый способ биологической жидкости дает возможность, в отличие от » ранее используемых способов, получить высококонцентрированный препарат с заданной активностью. Из проведенных опы- . тов выяснилось, что предлагаемый способ получения гамма-глобулина универсален; так как дает возможность получать гаммаглобулин не только из различных биологических жидкостей, но и из биологических жидкостей различных видов животных.
Преимущество предлагаемого способа заключается также в том, что получаемый антительный препарат имеет значительно большую удельную серологическую активность, чем полученный по известному способу, и имеет возможность регулирования активности в зависимости от степени концентрирования. Предлагаемый способ прост, воспроизводим, технологичен, легко выполнимый в аппаратном оформлении. Высокая удельная серологическая активность
Источник гамма2,9 0,5 1,5 1,17 3,35 3,35
12,5 1,8 ) 6,5 ; 6,5 ) 7,65 > 8,0
Веиество для концентрирования
Белок, Х Индекс нейтря- Удельная се- Белок 2 Индекс нейт- Удельная селиэацин 1й рологнческая ралнэанин рологнческая
Источник
