Экспериментальный способ определения глюкозы

Идентификация органических соединений

Задание 1

В двух пробирках без этикеток содержатся следующие вещества:

1 вариант: этиловый спирт и муравьиная кислота;
2 вариант: растворы глюкозы и глицерина;
3 вариант: растворы формальдегида и белка;
4 вариант: растительное и машинное масла;
5 вариант: крахмальный клейстер и глицерин;
6 вариант: растворы глюкозы и этанола;
7 вариант: растворы сахарозы и глюкозы.

Получите у учителя две пробирки в соответствии с номером вашего варианта. Предложите способ экспериментального определения содержимого каждой пробирки. После одобрения вашего предложения учителем приступите к практическому распознаванию веществ.

Задание 2

С помощью одного реактива докажите, что глюкоза является веществом с двойственной функцией.

Задание 3

Вам выданы пробирки с растворами, в одной из которых содержится глицерин, в другой — формальдегид, в третьей — глюкоза. С помощью одних и тех же реактивов определите каждое вещество.

Задание 4

Докажите опытным путем, что картофель и белый хлеб содержат крахмал, а спелое яблоко — глюкозу.

Идентификация органических соединений. Ответы

Задание 1

Вариант 1. Этиловый спирт и муравьиная кислота

Данные вещества можно различить по запаху, каждое из них обладает специфическим характерным запахом. В сильно разбавленном растворе запах может быть еле уловим. Для более точного определения можно воспользоваться реакцией «серебряного зеркала» или реакцией со свежеприготовленным гидроксидом меди (II), в которые, в отличие от этилового спирта, вступает муравьиная кислота, т.к. ее молекулы содержат карбонильную группу.

Опыт. В каждую пробирку добавили по несколько капель аммиачного раствора оксида серебра, пробирки нагрели. В одной из пробирок наблюдаем выпадение осадка серебра. Значит, здесь содержится муравьиная кислота.

Вариант 2. Раствор глюкозы и глицерина

Для определения можно воспользоваться реакцией «серебряного зеркала» или реакцией со свежеприготовленным гидроксидом меди (II), в которые, в отличие от глицерина, вступает глюкоза, т.к. ее молекулы содержат карбонильную группу.

Опыт. В каждую пробирку добавили по несколько капель аммиачного раствора оксида серебра, пробирки нагрели. В одной из пробирок наблюдаем выпадение осадка серебра. Значит, здесь содержится глюкоза.

Вариант 3. Растворы формальдегида и белка

Для определения можно воспользоваться реакцией со свежеприготовленным гидроксидом меди (II), в которую вступает как белок при обычных условиях, а формальдегид только при нагревании.

Опыт. В каждую пробирку добавили по 1-2 мл раствора медного купороса, а затем добавили по 2 мл раствора щелочи.

В одной из пробирок наблюдаем фиолетовое окрашивание. Значит, здесь содержится белок. Содержимое другой пробирки нагрели. Наблюдаем выпадение красного осадка оксида меди (II), что подтверждает — вторая пробирка содержит формальдегид.

Вариант 4. Растительное и машинное масла

Для определения можно воспользоваться характерной для непредельных соединений реакцией обесцвечивания раствора перманганата калия, в которую вступает растительное масло, в отличие от машинного (которое по своему составу является смесью предельных жидких углеводородов).

Опыт. В каждую пробирку наливаем по 2 мл жидкости и добавляем по несколько капель раствора перманганата калия. В одной из пробирок наблюдаем обесцвечивание раствора перманганата калия. Значит, здесь было растительное масло.

Вариант 5. Крахмальный клейстер и глицерин

Для определения можно воспользоваться характерной для крахмала реакцией с йодом.

Опыт. В каждую пробирку добавляем по 2 капли раствора йода. В одной из пробирок наблюдаем синее окрашивание, значит здесь находился крахмальный клейстер. Глицерин не дает видимой реакции.

Вариант 6. Растворы глюкозы и этанола

Для определения можно воспользоваться реакцией со свежеприготовленным гидроксидом меди (II), в которые, в отличие от этанола, вступает глюкоза, т.к. ее молекулы содержат карбонильную группу.

Опыт. В каждую пробирку добавили по 1-2 мл раствора медного купороса, а затем добавили по 2 мл раствора щелочи. В одной из пробирок наблюдаем синее окрашивание, значит здесь была глюкоза. Раствор этанола на дает видимой реакции.

Вариант 7. Раствор сахарозы и глюкозы

Для определения можно воспользоваться аммиачным растровом оксида серебра, раствор глюкозы, в отличие от сахарозы, дает реакцию «серебряного зеркала».

Опыт. В каждую пробирку добавили по несколько капель аммиачного раствора оксида серебра, пробирки нагрели. В одной из пробирок наблюдаем выпадение осадка серебра. Значит, здесь содержится глюкоза.

Задание 2

Глюкоза является веществом с двойственной функцией, это можно доказать при помощи свежеприготовленного гидроксида меди (II).

Опыт. В пробирку с раствором глюкозы добавляем 1-2 мл раствора медного купороса, а затем добавили 2 мл раствора щелочи. Наблюдаем синее окрашивание, характерное для класса многоатомных спиртов. Молекула глюкозы содержит несколько гидроксильых групп. Затем полученное содержимое пробирки нагрели. Наблюдаем выпадение красного осадка оксида меди (II), что подтверждает наличие в молекуле глюкозы карбонильной группы. Следовательно, глюкоза является альдегидоспиртом.

Задание 3

Растворы глюкозы, глицерина и формальдегида можно различить при помощи свежеприготовленного гидроксида меди (II).

Опыт. В пробирки с растворами глюкозы, глицерина и формальдегида добавляем по 1-2 мл раствора медного купороса, а затем добавили по 2 мл раствора щелочи. В двух пробирках наблюдаем синее окрашивание, характерное для класса многоатомных спиртов. Значит, в них находятся глюкоза и глицерин. Затем полученное содержимое пробирок нагрели. В пробирке, где не наблюдалось синего окрашивания, выпадает осадок оксида меди (II), красного цвета, что подтверждает наличие карбонильной группы и отсутствие нескольких гидроксильных. Здесь находился раствор формальдегида. В одной из пробирок, где наблюдалось синее окрашивание, также выпадает осадок оксида меди (II), красного цвета, что подтверждает наличие и карбонильной нескольких гидроксильных групп. Здесь находился раствор глюкозы. В третьей пробирке молекулы вещества содержат только несколько гидроксильных групп и не содержат карбонильных. Здесь находился раствор глицерина.

Задание 4

Характерной реакцией на крахмал является синее окрашивание при взаимодействии с йодом. Нанесли пипеткой на срез картофеля, спелого яблока и кусок белого хлеба несколько капель йода. На срезе картофеля и куске белого хлеба наблюдаем синее окрашивание, значит здесь содержится крахмал.

Источник

Современные методы определения глюкозы

Герасименко В.А., к.м.н., Куриляк О.А., к.б.н.

Из архива газеты «Новости А/О Юнимед»

Определение концентрации глюкозы в крови – одно из наиболее часто выполняемых биохимических исследований в КДЛ. Причина исключительной популярности теста связана с высокой заболеваемостью сахарным диабетом. Данный тест выполняется как в условиях стационара, так и в поликлиниках. Больные сахарным диабетом вынуждены исследовать уровень глюкозы в крови в домашних условиях, поскольку без этой информации им трудно скорректировать свою диету, физические нагрузки, применение инсулина и других сахароснижающих препаратов. Исключительная важность теста и большие объемы выполняемых исследований стимулировали разработчиков к созданию различных типов приборов и методов определения концентрации глюкозы в крови.

В настоящее время существует достаточно много методов определения глюкозы. Их можно классифицировать следующим образом.

Методы определения глюкозы в сыворотке крови

— фотометрический по конечной точке

— отражательная фотометрия – сухая химия

Первые два метода крайне неудобны, токсичны и обладают низкой точностью, поэтому мы на них не будем останавливаться.

Глюкозооксидазный метод

Сегодня наибольшее распространение получили методы, основанные на использовании фермента – глюкозооксидазы. В основе метода лежит следующая реакция:

Глюкозооксидаза катализирует перенос двух водородных атомов с первого углеродного атома глюкозы на кислород, растворенный в жидком реагенте. При этом в ходе реакции образуется в эквимолярных количествах перекись водорода. Т.е. концентрация образовавшейся перекиси водорода точно равна определяемой концентрации глюкозы. Следовательно, использование глюкозооксидазной реакции, трансформировало задачу определения концентрации глюкозы в задачу определения концентрации перекиси водорода, которая, как будет показано ниже, значительно проще первой. И здесь есть несколько способов, широко используемых сегодня в лабораторной практике (см. схему).

Среди вышеперечисленных способов регистрации наибольшее распространение получил фотометрический биохимический метод, в котором молекулы перекиси водорода под действием фермента пероксидазы расщепляются с образованием активной формы кислорода – супероксид анион-радикала – О₂ — , который в свою очередь окисляет хромоген, что приводит к значительному изменению спектра поглощения хромогена.

На рис. 1 и 2 показаны спектры рабочего раствора до внесения в него стандартного раствора глюкозы и после. Максимум поглощения реакционной смеси – (реактив + глюкоза) находится в области 500 нм. Соответственно, изменение оптической плотности конечной реакции на длине волны 480-520 нм пропорционально концентрации глюкозы, содержащейся в пробе.

Рисунок 1. Спектр рабочего раствора

Рисунок 2. Спектр реакционной смеси (рабочий раствор + глюкоза)

Большая популярность данного метода определения глюкозы объясняется его высокой специфичностью и простотой выполнения. Метод можно реализовать как с применением обычного фотометра (лучше специализированного биохимического фотометра типа Микролаб 540), так и с помощью автоматических биохимических автоанализаторов.

Наряду с методом фотометрирования по конечной точке, несколько лет назад появились наборы, в которых реализован кинетический метод фотометрирования. Суть метода состоит в том, что при определенном соотношении активностей глюкозооксидазы и пероксидазы, скорость образования окрашенного соединения некоторое время после внесения пробы в рабочий раствор будет пропорциональна концентрации глюкозы в пробе. Преимущество такого метода состоит в том, что результат не зависит от наличия в пробе других соединений, поскольку поглощение последних стабильно во времени. Этот метод требует применения кинетического фотометра, например Stat Fax 1904+, Stat Fax 3300, полуавтоматических анализаторов, например Clima 15, или автоматических биохимических анализаторов. Измерение концентрации глюкозы из цельной крови удобно выполнять с помощью приборов, работа которых основана на амперометрическом принципе измерения, при помощи специальных ферментных датчиков. Перекись водорода является крайне нестабильным химическим соединением и она может служить источником заряженных частиц. Именно это и используется в ферментных датчиках мембранного типа или электрохимических элементах портативных глюкометров.

Рисунок 3. Измерительная ячейка

В измерительной ячейке, сконструированной как проточная, находится измерительная камера, с одной стороны ограниченная ферментной мембраной (Рис. 3). На мембрану толщиной около 60 микрон специальным образом сорбирована глюкозооксидаза. С другой стороны мембраны к ней прижимается платиновый электрод.

Проба цельной крови (обычно 20 мкл) разводится в системном буферном растворе (эритроциты разрушаются), после чего подается по магистрали в проточную ячейку. Глюкоза, подвергается окислению под воздействием фермента глюкозооксидазы, находящейся на мембране. Образовавшаяся перекись водорода диффундирует через мембрану и окисляется далее в каталитической реакции под действием платины. Диффузия перекиси водорода на поверхность платины формирует ток, пропорциональный числу молекул Н₂О₂. Полученный таким образом сигнал обрабатывается прибором в соответствующее значение напряжения. Это измеренное значение пропорционально концентрации глюкозы в пробы.

В качестве примера приборов, использующих вышеописанный метод можно назвать автоматические анализаторы глюкозы Biosen (Германия). Эти приборы удобны для использования не только в стационарах, но и в поликлиниках, где анализ на глюкозу делают преимущественно из капиллярной крови.

Важным этапом в развитии методов клинической лабораторной диагностики стало появление «сухой химии». Естественно, одним из первых приложений этой технологии стала задача определения глюкозы в крови пациента. Первые приборы значительно уступали по точности традицинным лабораторным методам исследований. Однако, со временем, ряду фирм удалось разработать такие диагностические полоски и отражательные фотометры, которые обеспечили весьма высокую точность анализа. Широко популярными во всем мире в настоящее являются глюкометры One Touch и тест-полоски к ним производства компании Life Scan (США), которые удачно сочетают в себе аналитическую точность количественного ферментативного метода со скоростью и простотой «сухой химии».

Глюкометры One Touch предназначены для быстрого и точного измерения уровня глюкозы в цельной крови. Тест-полоска One Touch содержит все необходимые химические компоненты для двухэтапного глюкозооксидазного метода, включая ферменты глюкозооксидазу и пероксидазу, которые сорбированы на уникальную пористую гидрофильную мембрану. Результатом реакции является образование окрашенного комплекса. Интенсивность развившейся окраски регистрируется отражательным минифотометром.

Рисунок 4. Конструкция тест-полоски

В дополнении к этому, мембрана обладает гидрофильными свойствами, благодаря которым капля крови “притягивается” к поверхности тест-полоски при касании.Мембрана тест-полоск One Touch напоминает губку с микроскопическими порами и выполняет тройственную функцию. Она действует: 1) как резервуар, собирая необходимое количество крови, 2) как фильтр, блокируя твердый клеточный материал (эритроциты, лейкоциты и др.), 3) как гладкая оптическая поверхность, на которой измеряется отраженный свет. Последняя функция, в частности, очень важна для работы прибора. Она делает возможным считывать нижнюю часть полоски, тогда как кровь остается на верхней части тест-полоски. Соответственно, нет необходимости стирать (промокать) кровь с поверхности тест-полоски.

В состав приборов One Touch входит два специальных светодиода. Обработка развившейся окраски на тест-полоске идет следующим образом. Как только тест-полоска вставлена в прибор – происходит нулевое считывание. В этот момент на дисплее мы видим: “ЖДАТЬ”. Когда капля крови наносится на тест-полоску, плазма крови моментально сорбируется мембраной, тогда как эритроциты и излишки плазмы остаются на поверхности мембраны. После полного впитывания капли крови немедленно происходит окрашивание. Прибор регистрирует изменение величины отражения и автоматически запускает таймер. Через 45 секунд химическая реакция заканчивается, результат светоотражения обрабатывается. Окрашенный продукт реакции поглощает свет, испускаемый первым светодиодом. Форменные элементы крови и лишняя плазма также поглощают свет, излучаемый диодом. Чтобы скорректировать фоновое отражение, второе считывание производится вторым светодиодом на другой длине волны. Разность сигналов от первого и второго светодиода несет информацию о поглощении света хромогеном. Сигнал, полученный от хромогена для оценки концентрации глюкозы, соотносится со специальной калибровкой. Все приборы One Touch откалиброваны с использованием референтного метода на лабораторном анализаторе глюкозы. С помощью этой процедуры получается стандартная калибровочная кривая. Отметим, что достаточно сложно наладить производство тест-полосок, которые были бы абсолютно одинаковыми химически, в силу очень низкой концентрации реактивов. Для решения этой проблемы используется стандартная калибровочная кривая, состоящая из 16 –ти калибровочных линий. Контроль качества осуществляется сразу после производства тест-полосок, что позволяет определить, какая из калибровочных линий (от 1 до 16) может быть применена для данной тест-полоски. Это так называемый номер кода, который проставляется на упаковке тест-полосок. Эти 16 калибровочных линий также программируются в микропроцессоре прибора. Для получения оптимально точных результатов, номер кода, указанный на упаковке тест-полосок выставляется в приборе при помощи кнопки кода. Таким образом, неправильно установленный код на приборе может являться причиной ошибки измерения.

С момента появления на рынке приборов One Touch прошло большое количество клинических исследований в лабораториях России, Америки и Европы. Одно из таких исследований было проведено Эндокринологическим научным центром РАМН по заказу Российской Ассоциации Медицинской Лабораторной Диагностики. Специалисты Центра провели сравнительный анализ двух методов измерения уровня глюкозы в крови. Результаты, полученные на One Touch, сопоставлялась с данными, полученными на биохимическом анализаторе Spectrum II (Abbott Laboratories, США), реализующем гексокиназный метод определения глюкозы. Было исследовано 190 проб крови от 95 пациентов. Коэффициент корреляции результатов составил 0,98641. Коэффициент вариации в нормальном и патологическом диапазонах на глюкометре One Touch не превысил 2,5%.

Рис. 5. Корреляционная зависимость показаний “One Touch” и «Спектрум-2» (коэффициент корреляции 0,98641)

В заключении следует упомянуть и о недостатках глюкозооксидазного метода. Образующаяся перекись водорода и супероксид анион-радикал могут окислять не только хромоген, но и другие вещества, присутствующие в биологической жидкости: аскорбиновую кислоту, мочевую кислоту, билирубин. При этом, соответственно, доля перекиси, принимающая участие в окислении хромогена, снижается, что приводит к занижению результата по глюкозе. Этот метод линеен, как правило, до 20-30 ммоль/л глюкозы.В официальном отчете Эндокринологического научного центра РАМН сказано: «приборы One Touch обладают высокой точностью и правильностью, а также широким диапазоном измерений. Их можно использовать для диагностики неотложных состояний при диабете, в том числе бригадами “Скорой помощи”, поскольку эти приборы не только надежны, но и быстро дают результаты».

Гексокиназный метод

Регистрация осуществляется при длине волны 340 нм по светопоглощению НАДН. Этот метод является высокоспецифичным и не дает реакции с другими компонентами сыворотки крови. Гексокиназный метод считается референтным для определения глюкозы. Как правило, он линеен до 50 ммоль/л, что позволило его широко рекомендовать для клиник с эндокринологическими отделениями.

Из описанного разнообразия методов определения глюкозы сотрудники КДЛ могут решить для себя, какой способ определения и какой прибор выбрать:

• Методы «мокрой» биохимии, реализованные на автоматических биохимических анализаторах, обеспечат нужды лабораторий с большим потоком анализов.
• Анализаторы глюкозы типа Biosen требуют от оператора минимальных трудозатрат, так как они полностью автоматизированы и достаточно производительны (скорость от 50 до 200 проб в час).
• Для лабораторий с небольшим числом исследований, а также экспресс-лабораторий удобен специализированный биохимический фотометр Микролаб 540.
• Для бригад скрой помощи идеальное решение — глюкометры типа One Touch.

Т.о., задача КДЛ обеспечить не только быстрое, но и высокоточное определение глюкозы, на сегодняшний день вполне решаема.

Источник