Биотехнологический способ производства инсулина

Биотехнологическое производство рекомбинантного инсулина. Экономические аспекты. Создание рекомбинантных белков «второго поколения» на примере инсулина

Nbsp;

Биообъекты как средства производства лекарственных, профилактических и диагностических средств. Классификация. Характеристика. Основные группы получаемых биологически активных веществ.

Центральным и обязательным элементом биотехнологического производства, создающим его специфику, является биообъект.

Биообъектом может быть целостный сохранивший жизнеспособность многоклеточный или одноклеточный организм. Им могут являться изолированные клетки многоклеточного организма, а также вирусы и выделенные из клеток мультиферментные комплексы, включенные в определенный метаболический процесс. Наконец, биообъектом может быть индивидуальный изолированный фермент.

Функция биообъекта – полный биосинтез целевого продукта, включающий обычно ряд последовательных ферментативных реакций или катализ лишь одной ферментативной реакции, которая имеет ключевое значение для получения целевого продукта. Биообъект, осуществляющий полный биосинтез целевого продукта называется продуцентом. Биообъект, являющийся индивидуальным ферментом или выполняющий функцию одной ферментативной реакции используемой биотехнологом – именуют промышленным биокатализатором.

Таким образом, к биообъектам относятся как макромолекулы, так микро- и макроорганизмы. В качестве макромолекул в промышленном производстве используются все известные классы ферментов, но наиболее часто — гидролазы и трансферазы. Доказано, что использование ферментов в производстве в иммобилизованном виде, то есть связанных с нерастворимым носителем, является наиболее рациональным, так как в этом случае обеспечивается многократность их применения и стандартность

повторяющихся производственных циклов.

В любом технологическом процессе в биотехнологии используют биообъекты (источники сырья или биохимических каталитических процессов).

Биообъект – автономная саморегулирующаяся система.

— макроорганизмы из животного и растительного мира.

— культуры клеток эукариот.

— информационные макромолекулы (ДНК или РНК).

— функциональные макромолекулы (ферменты, биокатализаторы).

— человек (донор того или иного полупродукта).

Выращивание клеток высших растений возможно в виде:

— каллуса – нароста недифференцируемой меристемы на поверхности питательной среды.

— в виде суспензии в жидких средах.

Выращивание клеток высших животных возможно:

— на твердых носителях.

— в виде суспензии в жидких средах.

Преимущества использования биомасс и каллуса:

— возможность получения сырья с заданными характеристиками (стандартизация).

— повышение выхода полу- и конечного продукта.

— сокращение сроков культивирования.

— возможность промышленного получения редких растений и биоматериалов (раувольфия, диаскорея, унгерния).

Все биообъекты (микрообъекты) относятся либо к прокариотам (сине-зеленые водоросли, бактерии, вирусы, бактериофаги), либо к эукариотам (простейшие, водоросли, грибы).

Способы использования биомассы:

— получение биомассы с последующим её использованием в качестве полупродукта или искомого ЛП.

— использование продуктов жизнедеятельности биообъектов (производство аминокислот, антибиотиков, полисахаридов, витаминов).

— использование биообъекта для биотрансформации веществ (витамин С).

— повышенная стабильность и устойчивость к воздействиям окружающей среды.

— возможность создания непрерывных или полунепрерывных технологических потоков.

— снижение затрат на выделение и очистку продуктов реакции.

В природе существует огромное число микроорганизмов, которые способны синтезировать продукты или осуществлять реакции, которые могут быть полезны для биотехнологии. Однако практическое применение нашли не более 100 видов микроорганизмов (бактерии, грибы, дрожжи, вирусы, водоросли).

Дрожжи широко используют в хлебопечении, пивоварении, виноделии, получении соков, кормового белка, питательных сред для выращивания бактерий и культур животных клеток. Из 500 известных видов дрожжей используется только несколько видов – Saccharomyces cerevisiae, Saccharamyces carlsbergencis, Saccharomyces uwarum.

Среди бактерий чаще всего применяют в биотехнологии представителей следующих родов: Acetobacter, которые превращают этанол в уксусную кислоту и уксусную кислоту в углекислый газ и воду; Bacillus – для получения ферментов (B. subtilis), средств защиты растений (В. thuringiensis); Clostridium – для сбраживания сахаров в ацетон, этанол, бутанол; псевдомонады – например, P. Denitrificans – для получения витамина В₁₂, Corynebacterium glutamatum – для получения аминокислот и др.

Для получения разнообразных антибиотиков в биотехнологии применяют актиномицеты (род Streptomyces), грибы рода Penicillium и др.

Многие микроорганизмы – бактерии, дрожжи, вирусы – используются в качестве реципиентов чужеродного генетического материала с целью получения рекомбинантных штаммов–продуцентов биотехнологической продукции. Получены рекомбинантные штаммы E. coli, продуцирующие интерфероны, инсулин, гормон роста, антигены вируса СПИДа; штаммы B. subtilis, вырабатывающие интерферон; штаммы дрожжей, продуцирующие интерлейкин–2, антиген вируса гепатита В; рекомбинантные вирусы осповакцины, синтезирующие антигены гепатита В, вируса бешенства, клещевого энцефалита и др.

Для получения вакцин и диагностических препаратов используют также патогенные микроорганизмы (брюшного тифа, коклюша, дифтерии, столбняка и др.).

Широкое применение в биотехнологии нашли культуры животных и растительных клеток. Известно, что строение, физиология и биотехнология животных и растительных клеток более сложные, чем у бактериальных клеток. Из культур животных и растительных клеток можно извлечь более широкий ассортимент продуктов сложной, цепной реакции, но процесс культивирования растительных и животных клеток более трудоемкий и дорогостоящий. Из культур тканей растений можно получать разнообразные соединения, используемые в медицине (алкалоиды, противовоспалительные вещества, противолейкозные и противоопухолевые, противобактериальные, сердечные и почечные средства, ферменты, витамины, опиаты и др.), сельском хозяйстве, химической и других отраслях промышленности. Животные клетки используют как для получения продукции, так и для выращивания в клетках вирусов с целью получения из них вакцин и диагностических препаратов.

Таким образом, в современном биотехнологическом производстве используют весьма широкий ассортимент биообъектов, классификация которых весьма сложна и наиболее рационально может быть выполнена на основе принципа их соразмерности. В таблице приведены биологические объекты, объединенные в 5 групп, причем, соразмерность в первых четырех имеет кратность в три порядка и только в пятой группе собраны биообъекты, отличающиеся по размерам от предшествующей (четвертой) группы всего на один порядок.

Биообъекты, используемые при биотехнологических способах производства лекарственных (диагностических, лечебных и профилактических) средств:

1.	Размер от 10 м до 1 см: человек, животные, растения-бионакопители сапонинов, алкалоидов и т.п.
2.	Размер от 1 см до 1 мм: гигантские водоросли, каллусные культуры меристемы, культуры тканей, культуры клеток.
3.	Размер от 1 мм до 1 мкм: клетки эукариот и прокариот в культуре, биопродуценты и биотрансформаторы.
4.	Размер от 1 мкм до 1 нм: бактериофаги, вирусы, липосомы.
5.	Размер менее 1 нм: ДНК, ферменты, макромолекулы-носители.

Требования, предъявляемые к биообъектам для реализации биотехнологических процессов: чистота, высокая скорость размножения клеток и репродукции вирусных частиц, активность и стабильность биомолекул или биосистем.

Биотехнологическое производство рекомбинантного инсулина. Экономические аспекты. Создание рекомбинантных белков «второго поколения» на примере инсулина.

Биотехнология рекомбинантных белков охватывает производство:

• вакцин (против гепатита В0

• пептидных факторов роста тканей

• рекомбинантных интерферонов (они представляют неспецифическую

защиту клетки от вирусов и злокачественных образований)

На первом месте среди них по значению стоит рекомбинантный инсулин,

составляющий около 30% от всего рынка рекомбинантной продукции.

В проблеме производства рекомбинантных белков очень важно, чтобы

используемые в этом случае микроорганизмы, в которые вносят чужеродные

гены, удовлетворяли бы следующим свойствам:

1. Метаболизм микроорганизма должен быть хорошо изучен, поэтому в

качестве продуцентов рекомбинантных белков используют именно

такие микроорганизмы: это Escherichia coli, Bacillus subtilis,

2. Микроорганизмы должны быть не патогенны.

3. Микроорганизмы должны хорошо и интенсивно размножаться в

4. Желательно, чтобы микроорганизм был способен выделять

секретируемый им чужеродный белок в среду. Это можно достичь, если

ввести в клетку реципиента ген, который синтезирует рекомбинантный

белок с дополнительной аминокислотной последовательностью,

состоящий из гидрофобных аминокислот. Роль гидрофобных

аминокислот состоит в том, что они перетаскивают белок в липидную

мембрану, в которой с помощью определенных ферментов (сигнальных

протеаз), гидрофобная последовательность отщепляется и образуется

нужный целевой продукт – это рекомбинантный белок, выходящий в

среду.5. Должна быть возможность сделать клетки микроорганизмов

компетентными для того, чтобы их клеточная стенка была бы

проницаема для плазмид.

Промышленное производство рекомбинантного инсулина

Инсулин, как вы знаете, является регулятором углеводного обмена. В

организме человека инсулин синтезируется в бетаклетках островков Лангерганса

поджелудочной железы. При отсутствии или недостатке его синтеза развивается

такое заболевание как сахарный диабет (инсулинозависимый диабет – 1 типа).

При сахарном диабете повышается содержание глюкозы в крови и развиваются

патологические процессы. Диабет II типа (инсулинозависимый) возникает при

дефектах в структуре рецепторов, отвечающих за проникновение глюкозы в

клетку. Все эти сведения касаются этиологии такого заболевания как сахарный

Следующий вопрос, который надо рассмотреть, это структура инсулина.

Итак, инсулин это пептидный гормон, состоящий из двух пептидных цепей:

А-цепь состоит из 21 аминокислотных остатков.

В-цепь состоит из 30 аминокислотных остатков

Эти две цепи связаны бисульфидными SS связями, которые обеспечивают

пространственную структуру белка инсулина.

При синтезе инсулина в поджелудочной железе вначале образуется

предшественник инсулина, так называемый проинсулин. Этот проинсулин

состоит из А-цепи, В-цепи и С-пептида, состоящего из 35 аминокислотных

остатков.С-пептид отщепляется под действием карбоксипептидазы и трипсина и

проинсулин переходит в активный инсулин.

Есть разные способы получения инсулина. Мы остановимся на получении

инсулина биосинтетическим путем, с точки зрения преимущества этого метода.

Итак, преимущества получения инсулина биосинтетическим путем.

До внедрения в промышленность метода получения инсулина с

использованием рекомбинантных микроорганизмов существовал только один

способ получения инсулина – из поджелудочных желез крупного рогатого скота

и свиней. Инсулин, получаемый из поджелудочной железы крупного рогатого

скота отличается от инсулина человека на 3 аминокислотных остатка, а инсулин,

получаемый из железы свиньи, только на один аминокислотный остаток, то есть

он ближе к человеческому инсулину. Тем не менее, при введении белков,

отличающихся по структуре от белков человека даже в таком незначительном

выражении, возможно возникновение аллергических реакций. Такой инсулин,

как чужеродный белок, также может и инактивироваться в крови

Кроме того, для получения 1 килограмма инсулина требуется 35 тысяч голов

свиней (если известно, что годовая потребность в инсулине -1 тонна препарата).

С другой стороны, биосинтетическим путем можно получить такое же

количесвто инсулина, проведя биосинтез в 25 кубовом ферментере, используя

рекомбинантный микроорганизм Escherichia coli.

Биосинтетический метод получения инсулина стал применяться в начале 80-х

Остановимся на схеме получения рекомбинантного инсулина (фирма Eli Lilli-

Эли-Лилли, Соединенные Штаты Америки):

1. этап Путем химического синтеза были созданы последовательности

нуклеотидов, которые кодируют образование А и В цепей, то есть были

созданы синтетические гены.

2. 11 этап. Каждый из синтетических генов вводят в плазмиды (в одну

плазмиду вводят ген, синтезирующий цепь А, в другую плазмиду вводят

ген, синтезирующий цепь В).

3. 111 этап. Вводят ген, кодирующий образование фермента

бетагалактозидазы. Этот ген включают в каждую плазмиду для того,

чтобы добиться бурной репликации плазмид.

4. 1У этап. Вводят плазмиды в клетку Escherichia coli – кишечной палочки

и получают две культуры продуцента, одна культура синтезирует А-цепь,

5. V этап. Помещают две культуры в ферментер. В среду добавляют

галактозу, которая индуцирует образование фермента

бетагалактозидазы. При этом плазмиды активно реплицируются,

образуя много копий плазмид и, следовательно, много генов,

синтезирующих А и В цепи.

6. VI этап. Клетки лизируют, выделяют А и В цепи, которые связаны с

бетагалактозидазой. Все это обрабатывают бромцианом и отщепляют

А и В-цепи от бетагалактозидазы. Затем производят дальнейшую

очистку и выделение А и В цепей.

7. VII этап. Окисляют остатки цистеина, связывают и получают

Инсулин, полученный этим путем является человеческим инсулином по своей

структуре. Применение современных методов очистки исключает наличие в

инсулине эндотоксинов и пирогенных примесей.

Дата добавления: 2018-04-04 ; просмотров: 3051 ; Мы поможем в написании вашей работы!

Источник

Технология получения инсулина

Нарушение секреции инсулина. Использование аффиннойхромотографии. Схема получения инсулина. Экспрессия проинсулина в клетках Е.coli. Подходы к решению проблемы сахарного диабета. Вклад биотехнологии в промышленное производство непептидных гормонов.

Рубрика	Медицина
Вид	контрольная работа
Язык	русский
Дата добавления	11.12.2013
Размер файла	61,2 K

Отправить свою хорошую работу в базу знаний просто. Используйте форму, расположенную ниже

Студенты, аспиранты, молодые ученые, использующие базу знаний в своей учебе и работе, будут вам очень благодарны.

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН

КАЗАХСКИЙ АГРОТЕХНИЧЕСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ ИМЕНИ С.СЕЙФУЛЛИНА

Кафедра микробиологии и биотехнологии

По дисциплине «Биотехнологии мокроорганизмов»

На тему: Технология получения инсулина

Выполнила: Мырзабек М?лдір Курбанбек?ызы

Проверила: Акимбаева А.К (к. б. н.)

СОКРАЩЕНИЯ И ОБОЗНАЧЕНИЯ

1. История открытия

2. Получение инсулина в биотехнологии

3. Способы получения инсулина человека

4. Экспрессия проинсулина в клетках Е.coli

5. Очистка инсулина

6. Способ применения и дозы

В данной курсовой работе применялись следующие определения:

Белок носитель — обеспечивающий транспортировку гибридного белка в периплазматическое пространство клетки или культуральную среду;

Аффинный компонент — существенно облегчающий выделение гибридного белка.

Инсулин (от лат. insula — остров) — гормон пептидной природы, образуется в бета-клетках островков Лангерганса поджелудочной железы.

Интерлейкины — группа цитокинов, синтезируемая в основном лейкоцитами (по этой причине было выбрано окончание «-лейкин»).

Проинсулин — это предшественник инсулина, синтезирующийся В-клетками островкового аппарата поджелудочной железы.

Хроматография (от греч. chroma, chromatos — цвет, краска), физико-химический метод разделения и анализа смесей, основанный на распределении их компонентов между двумя фазами — неподвижной и подвижной (элюент), протекающей через неподвижную.

Инкапсуляция — механизм языка программирования, ограничивающий доступ к составляющим объект компонентам (методам и свойствам), делает их приватными, то есть доступными только внутри объекта.

Гибридный белок (англ. fusionprotein, также химерный, составной белок) — белок, полученный объединением двух или более генов, изначально кодировавших отдельные белки.

Гормоны (от греч. hormao — привожу в движение, побуждаю), инкреты, биологически активные вещества, вырабатываемые эндокринными железами, или железами внутренней секреции, и выделяемые ими непосредственно в кровь.

Сахарный диабет-группа эндокринных заболеваний, развивающихся вследствие абсолютной или относительной недостаточности гормона инсулина.

Инкапсуляция — механизм языка программирования, ограничивающий доступ к составляющим объект компонентам (методам и свойствам), делает их приватными, то есть доступными только внутри объекта.

Соматостатин — гормон дельта-клеток островков Лангерганса поджелудочной железы, а также один из гормонов гипоталамуса.

Радиоиммунный анализ — метод количественного определения биологически активных веществ, (гормонов, ферментов, лекарственных препаратов и др.) в биологических жидкостях, основанный на конкурентном связывании искомых стабильных и аналогичных им меченных радионуклидом веществ со специфическими связывающими системами.

СОКРАЩЕНИЯ И ОБОЗНАЧЕНИЯ

ВЭЖХ — высокоэффективной жидкостной хроматографией

кДНК — комплементарная дезоксирибонуклеиновая кислота

Основная функция инсулина — обеспечивать проницаемость клеточных мембран для молекул глюкозы. В упрощенном виде можно сказать, что не только углеводы, но и любые питательные вещества, в конечном счете, расщепляются до глюкозы, которая и используется для синтеза других содержащих углерод молекул, и является единственным видом топлива для клеточных энергостанций — митохондрий. Без инсулина проницаемость клеточной мембраны для глюкозы падает в 20 раз, и клетки умирают от голода, а растворенный в крови избыток сахара отравляет организм.

Нарушение секреции инсулина вследствие деструкции бета-клеток — абсолютная недостаточность инсулина — является ключевым звеном патогенеза сахарного диабета 1-го типа. Нарушение действия инсулина на ткани — относительная инсулиновая недостаточность — имеет важное место в развитии сахарного диабета 2-го типа.

Использование аффиннойхромотографии значительно снизило содержание в препарате загрязняющих белков с более высокой м.м., чем у инсулина. К таким белкам относятся проинсулин и частично расщепленные проинсулины, которые способны индуцировать выработку антиинсулиновых антител.

Использование человеческого инсулина с самого начала терапии сводит к минимуму возникновение аллергических реакций. Человеческий инсулин быстрее абсорбируется и независимо от формы препарата имеет более короткую длительность действия, чем животные инсулины. Человеческие инсулины менее иммуногены, чем свиные, особенно смешанные бычьи и свиные инсулины.

Целью данной курсовой работы является изучить технологию получения инсулина. Для достижения были поставлены следующие задачи:

1.получение инсулина в биотехнологии

2. способы получения инсулина

З. очистка инсулина

История открытия инсулина связана с именем русского врача И.М. Соболева (вторая половина 19 века), доказавшего, что уровень сахара в крови человека регулируется специальным гормоном поджелудочной железы.

В 1922 году инсулин, выделенный из поджелудочной железы животного, был впервые введен десятилетнему мальчику, больному диабетом результат превзошел все ожидания, и уже через год американская фирма «Eli Lilly» выпустила первый препарат животного инсулина.

После получения первой промышленной партии инсулина в последующие несколько лет пройден огромный путь его выделения и очистки. В результате гормон стал доступен для больных сахарным диабетом 1 типа.

В 1935 году датский исследователь Хагедорн оптимизировал действие инсулина в организме, предложив пролонгированный препарат.

Первые кристаллы инсулина были получены в 1952 году, а в в1954 году английский биохимик Г. Сенджер расшифровал структуру инсулина. Развитие методов очистки гормона от других гормональных веществ и продуктов деградации инсулина позволили получить гомогенный инсулин, называемый однокомпонентным.

В начале 70-х гг. советскими учеными А. Юдаевым и С. Швачкиным был предложен химический синтез инсулина, однако осуществление данного синтеза в промышленном масштабе было дорогостоящим и нерентабельным.

В дальнейшем шло прогрессирующее улучшение степени очистки инсулинов, что уменьшало проблемы, обусловленные инсулиновой аллергией, нарушениями работы почек, расстройством зрения и иммунной резистентностью к инсулину. Был необходим наиболее эффективный гормон для заместительной терапии при сахарном диабете — гомологичный инсулин, то есть инсулин человека.

В 80-годах достижения молекулярной биологии позволили синтезировать с помощью E.coli обе цепи человеческого инсулина, которые были, затем соединены в молекулу биологически активного гормона, а в Институте биоорганической химии РАН получен рекомбинантный инсулин с использованием генно-инженерных штаммов E.coli.

2. Получение инсулина в биотехнологии

Инсулин, пептидный гормон островков Лангерганса поджелудочной железы, представляет основное средство лечения при сахарном диабете. Эта болезнь вызвана дефицитом инсулина и проявляется повышением уровня глюкозы в крови. До недавнего времени инсулин получали из поджелудочной железы быка и свиньи. Препарат отличался от человеческого инсулина 1-3 аминокислотными заменами, так что возникала угроза аллергических реакций, особенно у детей. Широкомасштабное терапевтическое применение инсулина сдерживалось его высокой стоимостью и ограниченностью ресурсов. Путем химической модификации инсулин из животных удалось сделать неотличимым от человеческого, но это означало дополнительное удорожание продукта.[1]

Компания Eli Lilly с 1982 г. производит генно-инженерный инсулин на основе раздельного синтеза Е. colieА — и В-цепей. Стоимость продукта значительно снизилась, получаемый инсулин идентичен человеческому. С 1980 г. в печати имеются сообщения о клонировании гена проинсулина — предшественника гормона, переходящего в зрелую форму при ограниченном протеолизе.

К лечению диабета приложена также технология инкапсулирования: клетки поджелудочной железы в капсуле, введенные однократно в организм больного, продуцируют инсулин в течение года.

Компания Integrated Genetics приступила к выпуску фолли-кулостимулирующего и лютенизирующего гормонов. Эти пептиды составлены из двух субъединиц. На повестке дня вопрос о промышленном синтезе олигопептидных гормонов нервной системы -энкефалинов, построенных из 5 аминокислотных остатков, и эндорфинов, аналогов морфина. При рациональном применении эти пептиды снимают болевые ощущения, создают хорошее настроение, повышают работоспособность, концентрируют внимание, улучшают память, приводят в порядок режим сна и бодрствования. Примером успешного применения методов генетической инженерии может служить синтез р-эндорфина по технологии гибридных белков, описанной выше для другого пептидного гормона, соматостатина[2].

3. Способы получения инсулина человека

Исторически первым способом получения инсулина для терапевтических целей является выделение аналогов этого гормона из природных источников (островков поджелудочной железы крупного рогатого скота и свиней). В 20-х годах прошлого века было установлено, что бычий и свиной инсулины (которые являются наиболее близкими к инсулину человека по своему строению и аминокислотной последовательности) проявляют в организме человека активность, сравнимую с инсулином человека. После этого долгое время для лечения пациентов, страдающих сахарным диабетом I типа, применяли инсулины быка или свиньи. Однако через некоторое время было показано, что в ряде случаев в организме человека начинают накапливаться антитела к бычьему и свиному инсулинам, тем самым сводя на нет их действие.

С другой стороны, одним из преимуществ этого метода получения инсулина является доступность исходного сырья (бычий и свиной инсулин можно легко получать в больших количествах), что и сыграло решающую роль при разработке первого способа получения инсулина человека. Этот метод получил название полусинтетического[3].

При этом способе получения инсулина человека в качестве исходного сырья использовали свиной инсулин. От очищенного свиного инсулина отщепляли С-концевой октапептид В-цепи, после чего синтезировали С-концевой октапептид человеческого инсулина. Затем его химически присоединяли, снимали защитные группы и очищали полученный инсулин. При тестировании данного метода получения инсулина было показана полная идентичность полученного гормона инсулину человека. Основной недостаток данного способа заключается в высокой стоимости получающегося инсулина (даже сейчас химический синтез октапептида — дорогое удовольствие, тем более в промышленном масштабе).

В настоящее время инсулин человека, в основном, получают двумя способами:модификацией свиного инсулина синтетико-ферментативным методом и генно-инженерным способом.

В первом случае метод основан на том, что свиной инсулин отличается от инсулина человека одной заменой на С-конце В-цепи Ala30Thr. Замену аланина на треонин осуществляют путем катализируемого ферментом отщепления аланина и присоединение вместо него защищенного по карбоксильной группе остатка треонина, присутствующего в реакционной смеси в большом избытке. После отщепления защитной О-трет-бутильной группы получают инсулин человека. (рисунок 1)

Рисунок 1 — Схема способы получения инсулина человека

Инсулин оказался первым белком, полученным для коммерческих целей с использованием технологии рекомбинантной ДНК. Существует два основных подхода для получения генно-инженерного инсулина человека. В первом случае осуществляют раздельное (разные штаммы-продуценты) получение обеих цепей с последующим фолдингом молекулы (образование дисульфидных мостиков) и разделением мизоформ. Во втором — получение в виде предшественника (проинсулина) с последующим ферментативным расщеплением трипсином и карбоксипептидазой. В до активной формы гормона. Наиболее предпочтительным в настоящее время является получение инсулина в виде предшественника, обеспечивающее правильность замыкания дисульфидных мостиков (в случае раздельного получения цепей проводят последовательные циклы денатурации, разделения мизоформ и ренатурации[3].

При обоих подходах возможно как индивидуальное получение исходных компонентов (А- и В-цепи или проинсулин), так и в составе гибридных белков. Помимо А- и В-цепи или проинсулина, в составе гибридных белков могут присутствовать:

1) белок носитель — обеспечивающий транспортировку гибридного белка в периплазматическое пространство клетки или культуральную среду;

2) аффинный компонент — существенно облегчающий выделение гибридного белка.

При этом оба эти компонента могут одновременно присутствовать в составе гибридного белка. Кроме этого, при создании гибридных белков может использоваться принцип мультимерности, (то есть, в гибридном белке присутствует несколько копий целевого полипептида), позволяющий существенно повысить выход целевого продукта[4].

В работе использовали штамм JM 109 N1864 со встроенной в плазмиду нуклеотидной последовательностью, экспрессирующей гибридный белок, который состоит из линейного проинсулина и присоединенного к его N-концу через остаток метионина фрагмента белка АStaphylococcusaureus. Культивирование насыщенной биомассы клеток рекомбинантного штамма обеспечивает начало производства гибридного белка, выделение и последовательная трансформация которого intube приводят к инсулину. Другая группа исследователей получала в бактериальной системе экспрессии слитой рекомбинантный белок, состоящий из проинсулина человека и присоединенного к нему через остаток метионина полигистидинового «хвоста». Его выделяли, используя хелатную хроматографию на колонках с Ni-агарозой из телец включения и расщепляли бромцианом. Авторы определили, что выделенный белок является S-сульфурированным. Картирование и масс-спектрометрический анализ полученного проинсулина, очищенного ионнообменной хроматографией на анионите и ОФ (обращеннофазовой) ВЭЖХ (высокоэффективной жидкостной хроматографией), показали наличие дисульфидных мостиков, соответствующих дисульфидным мостикам нативного проинсулина человека. Также сообщается о разработке нового, усовершенствованного способа получения инсулина человека методами генной инженерии в прокариотических клетках. Авторами установлено, что полученный инсулин по своему строению и биологической активности идентичен гормону, выделенному из поджелудочной железы[5].

В последнее время пристальное внимание уделяется упрощению процедуры получения рекомбинантного инсулина методами генной инженерии. Так получили слитой белок, состоящий из лидерного пептида интерлейкина присоединенного к N-концу проинсулина, через остаток лизина. Белок эффективно экспрессировался и локализовался в тельцах включения. После выделения белок расщеплялся трипсином с получением инсулина и С-пептида. Другая группа исследователей действовала аналогичным способом. Слитой белок, состоящий из проинсулина и двух синтетических доменов белка А стафилококков, связывающих IgG, локализовался в тельцах включения, но обладал более высоким уровнем экспрессии. Белок выделялся аффинной хроматографией с использованием IgG и обрабатывался трипсином и карбоксипептидазой В. Полученные инсулин и С-пептид очищались ОФ ВЭЖХ. При создании слитых конструкций весьма существенным является соотношение масс белка носителя и целевого полипептида. Так описано конструирование слитых конструкций, где в качестве полипептида — носителя использовали белок, связывающий сывороточный альбумин человека. К нему присоединяли один, три и семь С-пептидов. С-пептиды соединялись по принципу «голова-хвост» с помощью аминокислотных спейсеров, несущих сайт рестрикции Sfi I и два остатка аргинина в начале и в конце спейсера для последующего расщепления белка трипсином. ВЭЖХ продуктов расщепления показала, что отщепление С-пептида проходит количественно, а это позволяет использовать способ мультимерных синтетических генов для получения целевых полипептидов в промышленном масштабе.

Получение мутанта проинсулина, который содержал замену Arg32Tyr. При совместном расщеплении этого белка трипсином и карбоксипептидазой В образовывался нативный инсулин и С-пептид содержащий остаток тирозина. Последний, после мечения 125I, активно используется в радиоиммунном анализе[6].

Источник