Биохимические свойства бактерий способы их изучения

Методы изучения биохимических свойств микроорганизмов

В жизнедеятельности микробов ферменты играют боль­шую роль. Они являются обязательными участниками разно­образных биохимических реакций, лежащих в основе функ­ций питания, дыхания, размножения. По характеру связи с цитоплазменными структурами и по месту проявления своего действия ферменты делятся на внутри- и внеклеточные. Каж­дый вид микроорганизмов продуцирует постоянный для него набор ферментов, одни из которых расщепляют в разной сте­пени белки и углеводы, а другие вызывают окисление и вос­становление различных субстратов.

Стабильность ферментативных систем бактерий позволя­ет использовать биохимические свойства бактерий в сочета­нии с их морфологическими, культуральными и другими по­стоянными признаками для определения видов и типов бак­терий.

Для обнаружения ферментов исследуемую культуру мик­робов засевают на специальные дифференциально-диагности­ческие питательные среды.

Сахаролитические свойства микроорганизмов

Свойство расщеп­лять углеводы и высокоатомные спирты, которые принято объединять в одну группу, именуемую сахарами, присуще многим патогенным микробам. Под действием сахаролитических ферментов бактерий сахара расщепляются на альдегиды и кислоты. Конечными продуктами их расщепления явля­ются газообразные вещества: СO₂ и Н₂.

Характерно, что различные виды и даже разновидности микробов относятся по-разному к одним и тем же сахарам. Так, например, одни бактерии, ферментируя лактозу, оста­ются нейтральными в отношении глюкозы, другие, наоборот, сбраживают глюкозу, а третьи, наиболее активные, вызыва­ют расщепление и глюкозы, и лактозы.

Для обнаружения сахаролитических ферментов исследуе­мую культуру бактерий засевают в питательные среды Гисса, называемые также «пестрым» рядом. «Пестрый» ряд Гисса содержит обычно 5 пробирок: с глюкозой, лактозой, маннитом, мальтозой и сахарозой. При некоторых исследова­ниях для более углубленного изучения биохимических свойств выделенного микроба ряд Гисса дополняют дульцитом, сорбитом, ксилозой, арабинозой и некоторыми другими сахарами. Другими словами, есть «большой» и «малый» «пестрый ряд».

Название «пестрый» ряд обусловлено тем, что под дей­ствием ферментов микроба одни углеводы остаются неизмен­ными и, следовательно, цвет питательной среды не меняет­ся, в то время как другие сахара расщепляются, образуя кислые продукты распада, которые изменяют цвет индикато­ра и, соответственно, цвет питательной среды.

Среды Гисса бывают жидкими и полужидкими (с добав­лением 0,2—0,5% агар-агара). В пробирки с жидкими сре­дами Гисса для обнаружения газов, являющихся конечными продуктами распада сахаров, опускают «поплавок» — трубоч­ку диаметром 0,5—0,7 см, запаянную с одного конца. «По­плавок» помещают запаянным концом кверху; при стерили­зации он полностью заполняется питательной средой. При образовании в среде газообразных продуктов они вытесняют часть жидкости, находящейся в «поплавке», вследствие чего у запаянного конца его собирается воздушный пузырек.

В полужидких средах Гисса газообразование определяют по наличию мелких пузырьков газа в толще среды и стой­кой пены на ее поверхности.

Таким образом, при изучении сахаролитических фермен­тов, выделяемых микробами, учитывают не только явления расщепления тех или иных сахаров по кислотообразованию, но и глубину ферментативного процесса по наличию в пита­тельной среде конечных газообразных продуктов.

Пробирки с набором сред Гисса ставят в штатив в один ряд. На каждой пробирке надписывают название сахара, со­держащегося в среде. На первой пробирке каждого ряда, кроме названия сахара, указывают номер или вид исследуе­мой микробной культуры. Культуру берут на кончик петли в очень небольшом количестве и засевают по общепринятой методике.

Источник

Биохимические свойства бактерий. Методы изучения

Блок

Бактериологический метод диагностики. Достоинства и недостатки.

Бактериологический метод – метод идентификации микроорганизмов по их биологических свойствам.

Метод выделения чистых культур позволяет выделить из естественной среды обитания ― тканей и жидкостей организма человека или внешней среды ― отдельные виды микробов. Это достигается посевом материалов в искусственные питательные среды

Чистые культуры патогенных микробов, выделенные от больных людей и животных, позволяют своевременно установить диагноз и определить природу инфекционного заболевания. Они являются исходным материалом для получения бактерийных препаратов (вакцины, токсины, фаги, антибиотики и т. д.) Выделенная чистая культура идентифицируется по морфологическим, тинкториальиым, культуральным, токсигенным и биохимическим свойствам, по антигенной структуре и вирулентности. Идентификация представляет собой комплекс микроскопических, бактериологических, иммунологических и биологических исследований, применяемых для определения типа и вида бактерий.

· высокая информативность, объективность

· высокая чувствительность, специфичность

· возможно определить чувствительность к антибиотикам

· возможно внутривидовое типирование (разделение микроорганизмов на мелкие группы для установления источников заражения)

· не все м.о. растут на питательных средах

· результат зависит от квалифицированности и опыта работника

Условия для культивирования:

Результат: рост колоний. Колония-потомство одной микробной клетки на плотной среде

Для уплотнения среды используют агар-агар, его преимущества:

· Его не переваривают м.о.

· Т плавления=100 градусов

· Т застывания=45 градусов

Полужидкие среды используют для длительного хранения культур, изучения подвижности.

Бактериологический метод диагностики. Основные этапы.

Этап

· Подготовительные мероприятия. Эта стадия включает в себя забор, хранение и транспортировку материала. Также, при необходимости, может проводиться его обработка, в зависимости от свойств изучаемых бактерий. Например, при обследовании материала на туберкулёз, для выявления кислоустойчивых микробактерий используются растворы щёлочи или кислоты.

· Обогащение. Данная стадия не является обязательной и проводится в том случае, если количества бактерий в исследуемом материале недостаточно для проведения полноценного исследования. Например, при выделении гемокультуры, исследуемую кровь помещают в среду в соотношении 1 к 10 и хранят в течение суток при температуре 37о.

· Микроскопия. Мазок исследуемого материала окрашивается и изучается под микроскопом — исследуется микрофлора, её свойства и количество. В дальнейшем из первичного мазка необходимо отдельно выделить все находящиеся в нём микроорганизмы.

· Создание отдельных колоний. На чашку, со специальной, селективной средой, наносится материал, для этого используют петлю или шпатель. Далее, устанавливают чашку вверх дном, для защиты колоний от конденсата, и хранят в термостате около 20 часов, поддерживая температуру 37о. Важно! Следует помнить, что в процессе исследования, необходимо придерживаться правил изоляции. С одной стороны, для защиты исследуемого материала и выводимых бактерий, и с другой стороны, для предотвращения заражения окружающих лиц и внешней среды.

Этап

· Изучение морфологических свойств колоний в средах и их микроскопия. Исследуются чашки и отмечаются свойства микроорганизмов, показатели их количества, темпы роста, а также отмечается наиболее подходящая питательная среда. Для изучения лучше всего выбрать колонии, располагающиеся ближе к центру, и если образуется несколько типов чистых культур, то изучить каждую в отдельности. Для изучения морфотипной чистоты культуры используют мазок колонии, его окрашивают (обычно используется метод по Граму или же любой другой) и тщательно микроскопируют.

· Накопление чистой культуры. Для этого колонии всех морфотипов рассаживают в отдельные пробирки с питательной средой и содержат в термостате при определённой температуре (для большинства микроорганизмов подходящей является температура 37о, но в некоторых случаях может быть иной). Питательной средой для накопления часто служит среда Клиглера. Она имеет «скошенный» вид в пробирках, где 2/3 её части в виде столбика, а 1/3 – скошенная поверхность, окрашена в светло-красный цвет.

Этап

· Уровень роста и чистоты культуры. В общем порядке, выведенная чистая культура имеет однородный рост и при микроскопическом рассмотрении клетки имеют одинаковое морфологическое и тинкториальное строение. Но встречаются некоторые виды бактерий с ярковыраженным плеофоризмом, при этом, встречаются клетки, имеющие различное морфологическое строение.

Биохимические свойства бактерий. Методы изучения

Биохимические свойства — способность микроорганизмов к ферментации и ассимиляции тех или иных химических веществ. У бактерий различают три основные группы ферментов:

· Конститутивные — постоянно синтезирующиеся в микробных клетках.

· Индуцибельные — синтез которых индуцируется соответствующим субстратом.

· Репрессибельные — синтез которых подавляется в результате избыточного накопления продукта реакции, катализируемой данным ферментом. Для идентификации микроорганизмов — возбудителей инфекционных болезней, кроме морфологических и культурных свойств, необходимо изучение биохимических признаков.

Биохимические признаки

· гликолитические свойства бактерий (бактерии характеризуются неодинаковой способностью использовать различные углеводы. Утилизация углеводов бактериями приводит к образованию органических кислот, либо кислот и газов. Определение сахаролитических ферментов проводится на средах пестрого ряда, средах Гисса. Пестрые ряды, среды Гисса-состав: питательная основа-пептонная вода, любой сахар, индикатор рН

В пробирку с глюкозой помещают «поплавок» для определения продукции газа (изначально все желтое, а потом окрашивается в розовый) Для определения протеолитических ферментов — коллагеназ производят посев уколом исследуемой культуры в столбик мясо-пептонной желатины (МПЖ). Продолжительность культивирования 7-10 суток при комнатной температуре. При положительном результате наблюдается разжижение желатины. Например: возбудитель сибирской язвы образует кратерообразное разжижение МПЖ. В настоящее время для изучения биохимических свойств бактерий используется система индикаторная бумажная (СИБ) СИБ — набор бумажных дисков, пропитанных различными субстратами и индикаторами, которые помещают в пробирки с взвесью изучаемой культуры. Диски фильтровальной бумаги пропитывают индикаторными (дифференциальными) средами. В высушенном состоянии диски можно длительно хранить. Перед использованием диски раскладывают пинцетом в стерильные пробирки и добавляют суспензию идентифицируемой культуры в физрастворе)

· протеолитические свойства бактерий (расщепление желатина, если разжижает-есть активность м.о. Или мясо-пептонный бульон, любая простая среда)

Для определения протеолитических ферментов — коллагеназ производят посев уколом исследуемой культуры в столбик мясо-пептонной желатины (МПЖ). Продолжительность культивирования 7-10 суток при комнатной температуре. При положительном результате наблюдается разжижение желатины. Например: возбудитель сибирской язвы образует кратерообразное разжижение МПЖ. В настоящее время для изучения биохимических свойств бактерий используется система индикаторная бумажная (СИБ) СИБ — набор бумажных дисков, пропитанных различными субстратами и индикаторами, которые помещают в пробирки с взвесью изучаемой культуры. Диски фильтровальной бумаги пропитывают индикаторными (дифференциальными) средами. В высушенном состоянии диски можно длительно хранить. Перед использованием диски раскладывают пинцетом в стерильные пробирки и добавляют суспензию идентифицируемой культуры в физрастворе

·липолитические свойства (желточно-солевой агар, расщепление лецитина)

Дата добавления: 2018-10-27 ; просмотров: 3976 ; Мы поможем в написании вашей работы!

Источник

Разнообразие биохимических свойств бактерий

Изучение биохимических свойств бактерий постоянно дает почву для размышлений исследователям. Несмотря на общность химического состава, бактерии существенно отличаются по биохимическим свойствам – способности расщеплять питательные вещества, антибиотики, продуцировать витамины и ферменты, выделять в процессе жизнедеятельности различные газы. Изучение биохимических свойств бактериальных культур дает возможность разделять их при помощи специальных питательных сред, выяснять видовую принадлежность, разделять на штаммы. Это особенно актуально для молочнокислых бактерий, чистые культуры которых широко применяются в пищевой промышленности.

Микробиология рекомендует проводить идентификацию бактериальных культур по совокупности нескольких их признаков и свойств, к числу которых относятся следующие.

• морфологические;
• культуральные;
• биохимические;
• серологические.

Методы изучения биохимических свойств молочнокислых и других бактерий – это исследование культур, индикаторные бумажные системы (СИБ) и микротесты, представляющие собой набор пластиковых лунок с индикаторами. Некоторые микроорганизмы можно идентифицировать по пигментообразованию – способности образовывать окрашенные колонии.

Из чего состоят клетки бактерий

Химический состав бактериальной клетки – это комплекс из нескольких групп веществ:

1. Биогенные вещества. Это азот, углерод, водород и кислород. Их них состоят все органические вещества. Их доля в химсоставе молочнокислых бактерий составляет 95%.
2. Макроэлементы. Их количество в клетках бактерий не превышает 5%. К их числу относятся фосфор, кремний, калий, магний, хлор, кальций, натрий.
3. Микроэлементы. Несмотря на малое количество этих элементов в живых клетках, они играют существенную роль в ее жизнедеятельности, входя в состав биологически активных комплексов – пигментов, ферментных систем, участвуя в процессе фотосинтеза.
4. Вода. Это от 70 до 90% биомассы бактерии.

Среди органических веществ, составляющих клетку бактерий, обнаружены белки (простые и сложные), липиды, тейхоевые кислоты, углеводы, нуклеиновые кислоты.

Белки

Простые белки называются протеинами, более сложные, с сахарами или липидами в составе – протеидами. Существуют структурные белки, образующие элементы бактериальных клеток, обуславливающие их антигенную структуру, и функциональные или регуляторные, осуществляющие обменные процессы. Белковые цепочки состоят из звеньев – аминокислот. Некоторые из них уникальны для бактерий. Например, дипиколиновая кислота, обеспечивающая высокую устойчивость спор, диаминопимелиновая кислота, D-глутамин, D-аланин. Белки флагеллин и пилин образуют жгутики и ворсинки подвижных бактерий.

Большинство поверхностных антигенов бактерий, как свидетельствуют данные микробиологии, также являются белками. Уникальные биологические функции выполняют порины – белки, обеспечивающие транспорт веществ сквозь клеточные мембраны бактерий. Основой бактериальной клеточной стенки являются пептидогликаны – сложные белковые структуры, играющие роль гетерополимерного остова. Их состав имеет видоспецифичную структуру и его анализ позволяет проводить антигенное определение видовой принадлежности бактериальных культур.

Недавно было обнаружено уникальное биохимическое свойство бактериальных пептидогликанов – наряду с пирогенной способностью они способны останавливать развитие опухолей.

Различают липопротеиды, глюкопротеиды и нуклеопротеиды. Белки являются основными составляющими белковых фабрик бактерий – рибосом.

Липиды

Входят в цитоплазматические мембраны бактерий, а также составляют наружные оболочки грамотрицательных прокариот. Жирные кислоты являются видоспецифичными и их определение позволяет идентифицировать роды и виды этих микроорганизмов.

Наличие в липидах кислотоустойчивых жирных кислот придает им целый ряд биологических и биохимических свойств – устойчивость к воздействию спиртов, кислот и щелочей, солнечной радиации и дезинфицирующим растворам, избирательность по отношению к красителям, а также патогенность.

Тейхоевые кислоты

Линейные полимеры клеточных стенок грамположительных бактерий (в том числе молочнокислых), являясь их основными антигенами.

Углеводы

Полисахариды. Входят в состав клеточных стенок. Различают экзо- и эндоклеточные полисахариды. Первые, в свою очередь, бывают истинными, выходящими наружу клетки, и каркасными, входящими в состав капсул. Слизеподобные декстраны широко применяются в медицине – входят в состав кровезаменителей, используются в качестве молекулярных сит в хроматографии. Биологические и биохимические функции эндоклеточных полисахаридов состоят в создании внутриклеточных запасов питательных веществ.

Липополисахариды. Являются эндотоксинами (другое название – антигены) и состоят из липида, общего для грамотрицательных бактерий полисахаридного ядра и концевых (терминальных) цепочек (другое название – специфические боковые цепи). Обуславливают такие биохимические свойства бактерий, как антигенная специфичность и патогенность.

Нуклеиновые кислоты

ДНК, основной функцией которой является хранение и передача наследственной информации, содержится в нуклеоиде и плазмидах. ДНК нуклеоида молочнокислых бактерий осуществляет передачу генетической информации по вертикали – от поколения к поколению. Плазмидная ДНК позволяет бактериям обмениваться генами в течение их жизни – это называется горизонтальным переносом генов.

Основные биохимические свойства ДНК – это способность к репликации (самовоспроизведению) и транскрипции (образованию на ней матричных РНК, с которых в дальнейшем считываются белки).

РНК – основной компонент рибосом, в которых синтезируются бактериальные белки (рРНК). Существуют также мРНК и тРНК, осуществляющие доставку аминокислот в реакционный центр биосинтеза белка.

Ферменты бактерий и свойства культур

Биохимические свойства бактерий (в том числе молочнокислых) зависят от присутствующих в них ферментов – белковых структур, способных осуществлять определенные реакции обмена веществ. Изучение структуры белков всегда было тесно связано с микробиологией – культуральные методы изучения ферментов позволяют многое узнать об их специфичности, субстратах и продуктах.

Белковые комплексы, осуществляющие биохимические реакции в клетках молочнокислых и других бактерий, делятся на шесть основных классов:

1. Оксидоредуктазы – ферменты окислительно-восстановительных реакций.
2. Трансферазы – переносят группы атомов с одних молекул на другие.
3. Гидролазы – ферменты гидролитических реакций – расщепления веществ с участием воды.
4. Лиазы. Проводят отщепление от субстратов групп атомов негидролитическим путем – расщепляя и образовывая двойные связи.
5. Синтетазы или лигазы. Ферменты, соединяющие две молекулы между собой, используя энергию АТФ.
6. Изомеразы. Ферменты, способные создавать изомеры – варианты молекул одного состава, отличающихся различным пространственным расположением атомов и их групп.

Если классифицировать ферменты молочнокислых и других бактерий с точки зрения генетического контроля их работы, то можно различить три основные группы:

1. Конститутивные – присутствуют в клетке постоянно.
2. Индуцибельные – присутствуют только при наличии расщепляемого ими субстрата.
3. Репрессибельные – отличаются тем, что их количество обратно пропорционально количеству продукта реакции.

Инвазивные биохимические свойства микроорганизмов зависят от наличия на их поверхности экзоферментов, облегчающих проникновение внутрь тканевых барьеров. Выделяясь во внешнюю среду, такие ферменты расщепляют антибиотики, повышают проницаемость тканей, разжижают слизистый барьер, помогают бактериям проникать внутрь клеток и в межклеточное пространство.

Для описания биохимических свойств бактериальных культур используется рабочая классификация по конечным продуктам и результатам работы ферментов. Поскольку ферментный состав клеток молочнокислых и других бактерий зависит от их генома, он является относительно постоянной величиной. Поэтому методы определения активных ферментов позволяют классифицировать колонии и определять их видовую принадлежность. Различают пять групп ферментативной активности бактериальных культур:

• протеолитические,
• сахаролитические,
• оксилительно-восстановительные,
• аутолитические,
• патогенные.

Продуктами деятельности бактериальных культур могут являться различные кислоты (например, молочная и масляная кислота, выделяемая молочнокислыми бактериями), газы (углекислый, водород, сероводород), индол и другие.

Современные методы позволяют выделить основные факторы патогенности бактериальных культур. Таковыми факторами являются наличие в бактериальной клетке таких ферментов, как гиалуронидаза, лецитиназа, нейроаминидаза, плазмокоагулаза и некоторые другие.

Уникальные биохимические свойства некоторых бактериальных ферментов обусловили их широкое применение в биологических исследованиях. Так, например, в медицине широко применяются протеолитические и аутолитические ферменты, а в молекулярной генетике и генной инженерии – рестриктазы и лигазы, разрезающие и сшивающие цепочки нуклеиновых кислот.

Идентификация бактерий и их метаболизм

После изучения морфологии бактериальных клеток в окрашенных препаратах приступают к культуральному исследованию их ферментативной активности. Наиболее изученными у бактериальных культур являются сахаролитические и протеолитические ферменты. Физиолого-биохимические исследования бактериальной культуры позволяют выявить уникальные для отдельного вида или рода метаболические цепочки.

Среди характерных физиолого-биохимических свойств бактериальной культуры – способность избирательно растворять эритроциты различных видов животных (другое название этой реакции – гемолиз), сворачивать плазму (реакция плазмокоагуляции), растворять фибриновый сгусток (осуществлять фибринолиз).

После завершения изучения биохимических свойств патогенных бактерий проводят их серологическое определение при помощи реакции агглютинации с использованием высокоспецифичной иммунной сыворотки.

Работаю врачом ветеринарной медицины. Увлекаюсь бальными танцами, спортом и йогой. В приоритет ставлю личностное развитие и освоение духовных практик. Любимые темы: ветеринария, биология, строительство, ремонт, путешествия. Табу: юриспруденция, политика, IT-технологии и компьютерные игры.

Источник