Культивирование бифидобактерий
СПОСОБ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ БИФИДОБАКТЕРИЙ В МОЛОКЕ
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ
Авторы: Хамагаева, Куликова, Телешова, Тихомирова, Науметова
Прим. ред.: Данное изобретение было зарегистрировано Государственным комитетом СССР по делам изобретений и открытий еще в 1983 году. Правообладателем является ВСГУТУ. Изобретение относится к молочной промышленности и может быть использовано для получения кисломолочных продуктов для детей и взрослых. Конкурентным преимуществом данного изобретения является достигнутая в процессе культивирования заметная активизация бифидобактерий (ускорение их роста в молоке), что значительно упрощает промышленное производство бифидопродуктов (см. дополнительно нов.: Способ культивирования бифидобактерий в молоке — Патент 2205217).
Известны способы получения диетического молока, йогурта, кисломолочного продукта путем внесения ферментного препарата дрожжевой β-галактозидазы [1].
Недостатком указанных способов является то, что производство данных продуктов основано на гидролитическом свойстве β-галактозидазы, т.е. образование моноз глюкозы и галактозы.
Известен также способ производства ацидофильного молока для детского и диетического питания, предусматривающий внесение в молоко перед его тепловой обработкой дрожжевой β-галактозидазы из расчета 160 г на 1 т молока, проведение ферментативного гидролиза лактозы при 30-37 0 С в течении 2-2,5 ч [2].
Однако кисломолочные продукты, выработанные по известному способу, обладают высокой кислотностью 80-120 0 Т, что не позволяет широко использовать их для питания детей раннего возраста.
Наиболее близким к изобретению по технической сущности и достигаемому результату, является способ культивирования бифидобактерий, включающий стерилизацию молока, охлаждение, добавление кукурузного экстракта в количестве 0,25 – 1%, внесение одной микробиологической петли чистой культуры бифидобактерий, выдержки до образования сгустка кислотностью 52-55 0 Т [3].
Недостатком данного способа культивирования является внесение кукурузного экстракта, что ухудшает свойства молока, и высокая титруемая кислотность 110-125 0 Т. Продукт с такой кислотностью не пригоден для питания детей первого года жизни.
Целью данного изобретения является получение олигосахаридов, обладающих бифидогенными свойствами, и ускорение роста бифидобактерий.
Указанная цель достигается тем, что согласно способу, предусматривающему стерилизацию, охлаждение, внесение одной микробиологической петли чистой культуры бифидобактерий, выдержки до образования сгустка кислотностью 52-55 0 Т, перед стерилизацией в обезжиренное молоко вносят β-галактозидазу в количестве 0,1-0,2% к массе молока при активности фермента 900 ед/мл и проводят выдержку в течении 1,5-2 ч при 37 0 С.
Предлагаемый способ осуществляется следующим образом:
Молоко очищают, обезжиривают по известной технологии, вносят ферментный препарат дрожжевой β-галактозидазы из расчета 0,1-0,2% к количеству молока. Проводится гидролиз при температуре действия β-галактозидазы 37 0 С в течении 1,5-2 ч. Затем проводят стерилизацию при 115-120 0 С с выдержкой 15-20 мин. Охлаждают до температуры заквашивания 37 0 С и вносят одну микробиологическую петлю чистой культуры Bifidobacteriun bifidum, сквашивание проводится в течении 16-24 часов до образования сгустка при кислотности 50-52 0 Т.
Пример 1. Молоко очищают, вносят ферментный препарат дрожжевой β-галактозидазы из расчета 0,1% к количеству молока при активности 900 ед/мл и выдерживают в течении 2 ч при 37 0 С. Затем молоко стерилизуют при 120 0 С в течение 15 минут, охлаждают до температуры 37 0 С, вносят одну петлю чистой культуры B. bifidum. Сквашивание проводят при 37 0 С в течение 20 ч до образования сгустка кислотностью 50-52 0 Т.
Пример 2. Молоко очищают, обезжиривают, вносят ферментный препарат дрожжевой β-галактозидазы из расчета 0,2% к количеству молока при активности 900 ед/мл и выдерживают в течение 1,5 ч при 37 0 С. Затем молоко стерилизуют при 115 0 С в течение 20 минут, охлаждают до температуры 37 0 С. Вносят одну петлю чистой культуры бифидобактерий. Сквашивание проводят при 37 0 С до образования сгустка кислотностью 50-52 0 Т.
Преимущество предлагаемого способа заключается в том, что выбранные условия культивирования позволяют наладить производство кисломолочных продуктов с бифидобактериями в промышленном масштабе.
Влияние β-галактозидазы на изменение титруемой кислотности и количество клеток микроорганизмов представлены в табл. 1 и 2:
Контроль – обезжиренное молоко без внесения β-галактозидазы, опыт — обезжиренное молоко с β-галактозидазой в количестве 0,1% (табл. 1);
Источник
ГК «Униконс»
Продвижение и реализация комплексных пищевых добавок, антисептиков и др. продукции.
«Антисептики Септоцил»
Септоцил. Бытовая химия, антисептики.
«Петритест»
Микробиологические экспресс-тесты. Первые результаты уже через 4 часа.
«АльтерСтарт»
Закваски, стартовые культуры. Изготовление любых заквасок для любых целей.
- Вы здесь:
- Библиотека технолога
- Молочная промышленность
- Микробиология молока и молочных продуктов
2.5. БИФИДОБАКТЕРИИ КАК ПРОБИОТИЧЕСКАЯ МИКРОФЛОРА
Бифидобактерии являются одной из основных категорий функционального питания. Это доминантные представители нормальной кишечной микрофлоры человека и животных, которые играют весьма существенную роль в нормализации белкового липидного и минерального обмена организма-хозяина за счет продукции большого количества различных ферментов и других биологически активных веществ. Благодаря антагонистической активности бифидобактерии повышают резистентность человека к ряду патогенных микроорганизмов, а также оказывают позитивное регулирующее воздействие на общий иммунологический статус макроорганизма. Доказано их радиопротекторное и противоопухолевое действие, положительное влияние на слизистую оболочку кишечника. Бифидобактерии способны нейтрализовать токсины, выполняя роль второй печени. Все эти свойства бифидобактерий позволили использовать их как основу для создания лечебно-профилактических препаратов и продуктов функционального питания.
Впервые бифидобактерии из стула грудных детей выделил Тиссье в 1900 г. Из-за способности ветвиться их назвали Bacillus bifidus communis (от лат. bifidus — расщепленный, раздвоенный). Первоначально бифидобактерии были отнесены к роду Lactobacillus и рассматривались как вариант вида Lb. acidophilus. Однако по способности образовывать булавовидные формы и сбраживать пентозы бифидобактерии близки к коринебактериям, а по способности ветвиться — к актиномицетам. Наличие особого пути сбраживания углеводов послужило основанием к выделению бифидобактерий в отдельный самостоятельный род. В 9-м издании определителя Берджи бифидобактерии относятся к роду Bifidobacterium, семейству Actinomycetaceae.
В соответствии с последним изданием Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology, род Bifidobacterium входит в семейство Bifidobacteriaceae, порядок Bifidobacteriales, класс Actinobacteria, тип Actinobacteria, царство Bacteria. Основные виды этого рода: В. adolescentis, В. angulatum, В. animalis, В. asteroides, В. bifidum, В. bourn, В. breve, В. catenulatum, В. choerinum, В. coryneforme, В. си- niculi, В. dentium, В. gallicum, В. gallinarum, В. indicum, В. longum, В. magnum, В. merycicum, В. minimum, В. pseudocatenulatum, В. pseudolongum, В. psychraero- philum, В. pullorum, В. ruminantium, В. saeculare, В. scardovii, В. simiae, В. subtile, В. thermacidophilum, В. thermophilum, В. urinalis.
Морфологически бифидобактерии представляют собой неспорообразую- щие грамположительные неподвижные палочки размером (0,5-1,3×1,5-8 мкм), зернистые. Полиморфизм является их отличительной характеристикой. Изучены прямые и разветвленные палочки, Y- или V-формы, булавовидные и лопа- товидные формы. Они образуют ответвленные и разделенные перегородками палочковидные формы, очень напоминающие актиномицеты и коринебактерии. Это свойство отличает бифидобактерии от лактобацилл. Клетки располагаются одиночно, парами, иногда цепочками, палисадом или розетками. Среди штаммов, выделенных из кишечника взрослых людей, преобладают палочковидные и булавовидные формы; ветвящиеся палочки чаще всего встречаются у детей грудного возраста.
Сразу после выделения и выращивания культур бифидобактерий на печеночном агаре или молоке ветвление исчезает, клетки становятся грамвариабельными, слабее окрашиваются кислыми и щелочными красителями, появляется много гранулированных форм.
Морфологические изменения бифидобактерий могут быть вызваны условиями культивирования и хранения, возрастом культуры, количеством пересевов, добавлением различных ингредиентов к среде и т. д. Бифидобактерии при развитии в неблагоприятных условиях (неподходящая кислотность среды, температура культивирования, недостаток питательных компонентов среды, присутствие кислорода) способны образовывать разбухшие инволюционные шаровидные формы. В средах, обеспечивающих хороший рост, но не создающих условий для нормального синтеза клеточной стенки, например на агаре с томатным соком, появляются глобулярные формы, что можно предотвратить добавлением к среде трипсинового гидролизата молока. В настоящее время установлено, что ветвление происходит в среде, неполноценной в отношении источников питания.
Разнообразны колонии бифидобактерий, выросшие на плотных питательных средах в анаэробных условиях: плоские, полушаровидные, блестящие, шероховатые, окруженные валиком, имеющие более темный центр. Цвет колоний от белого и серого до темно-коричневого, по форме напоминают зерно гречихи или чечевицы. Размеры колоний от 0,5 до 5 мм.
При первичном выделении бифидобактерии являются строгими анаэробами. При культивировании в лабораторных условиях эти микроорганизмы приобретают способность развиваться в присутствии некоторого количества кислорода, а в высокопитательных средах могут расти и в полностью аэробных условиях. Для различных штаммов чувствительность к кислороду неодинакова, что обусловлено различиями в механизме брожения. Некоторые виды могут расти в атмосфере воздуха, обогащенного 10% СО2. Бифидобактерии не образуют каталазу, H2S и индол, не восстанавливают нитраты в нитриты, не обладают (за исключением штаммов из рубца) уреазной активностью, не разжижают желатин. Они преимущественно не образуют газ из глюкозы, не продуцируют фенол, не образуют аммиака из аргинина. При развитии в лакмусовом молоке бифидобактерии вызывают частичное или полное его восстановление. Эти микроорганизмы способны развиваться в бульоне из гидролизованного молока с 2%-ным раствором поваренной соли, 20% желчи, концентрации фенола 1:250.
Бифидобактерии не накапливают токсины, не патогенны для человека, не обладают гемолитическими свойствами, не образуют пигменты. Время генерации бифидобактерий при оптимальном режиме культивирования составляет 4-7 ч. Биокинетическая зона для роста бифидобактерий составляет 20-45,5°С, оптимальная температура развития большинства видов бифидобактерий равна 36- 38°С. Интервал активной кислотности для роста бифидобактерий составляет от 5,0 до 9,5, оптимальным для большинства видов является значение рН 6,5-7,0.
Бифидобактерии являются облигатными анаэробами, получающими энергию в результате брожения. Спектр Сахаров, сбраживаемых этими бактериями, довольно широк, они активно сбраживают сахарозу, галактозу, фруктозу, мальтозу, мелибиозу, раффинозу, лактозу и др. Существует определенная связь между ферментативной активностью бифидобактерий и их адаптацией к определенному типу макроорганизмов.
Антагонистическая активность бифидобактерий определяется рядом факторов, в том числе образованием антибиотических веществ (получено бактерицидное вещество бифилонг, продуцируемое В. longum). Также антагонистическое действие связывают с образованием бифидобактериями уксусной и молочной кислот, в результате чего происходит снижение рН содержимого кишечника, причем главную роль в этом in vitro и in vivo играет уксусная кислота. В настоящее время антагонизм связывают также с образованием бифидобактериями жирных кислот с короткой цепью.
Так как бифидобактерии являются важным элементом кишечной микрофлоры, это обстоятельство в значительной степени влияет на потребности этих микроорганизмов при выращивании in vitro. Их постоянным местом обитания является кишечник человека и животных, где все вещества находятся в легкоусвояемом виде, поэтому часть функций синтеза и расщепления веществ утрачена. Из-за подобной биосинтетической недостаточности бифидобактерии нуждаются в широком спектре факторов роста.
Этим микроорганизмам необходимы: биотин, пантотеновая кислота, цистеин, рибофлавин, пуриновые и пиримидиновые основания, пептиды и амино- сахара, кофермент А, олигосахариды, некоторые ненасыщенные жирные кислоты, витамины группы В. Бифидобактерии нуждаются в азоте, источником которого могут являться аммиак, аммонийные соли, дрожжевой автолизат. Вещества пептидной природы также важны для них: это ди-, три-, тетрапептиды, а также свободные аминокислоты: лизин, пролин, серин, аланин, аспарагиновая и глутаминовая кислоты.
Минеральный состав среды в большой степени влияет на рост бифидобактерий. Им необходимы железо, магний, фосфаты, хлориды калия и натрия, марганец. Натрий ускоряет развитие бифидобактерий, повышает выход биомассы. Магний влияет на функциональную деятельность биологических мембран.
Наиболее изученные виды бифидобактерий, применяющиеся как пробио- тики в молочной промышленности: В. bifidum (типовой), В. adolescentis, В. longum, В. breve, В. infantis.
Штаммы рода Bifidobacterium, используемые для производства бифидо- содержащих пробиотиков, депонируют в официальных коллекциях.
Производственные штаммы рода Bifidobacterium проверяют по культуральным, тинкториальным, морфологическим и биохимическим свойствам, безопасности (in vitro и in vivo). Определение проводят в соответствии с ОФС «Производственные пробиотические штаммы и штаммы для контроля пробиотиков» и «Безопасность пробиотиков в тестах in vivo», которые могут быть дополнены молекулярно-генетическими методами.
Например, на препаратах штамма Bifidobacterium bifidum 1, окрашенных по Граму, должны присутствовать грамположительные неподвижные палочки длиной от 4,0 до 5,0 мкм с бифуркацией или утолщением на одном или двух концах, располагающиеся в виде отдельных клеток или скоплений (рис. 2.3а). В анаэробных условиях на поверхности среды МРС-5 через 72 ч инкубации при температуре 38±1°С В. Bifidum 1 образует круглые мелкие белые колонии; в полужидких средах- печеночной среде Блаурокка, казеиново-дрожжевой (КД-5), гидролизатно-молочной (ГМ) — бактерии вырастают в виде рыхлой массы, оставляя прозрачной верхнюю часть среды (зона аэробиоза); отдельные колонии бифидобактерий при росте на печеночной среде Блаурокка имеют форму мелких «гвоздей» белого цвета, образующих при встряхивании крошковатую массу (рис. 2.3б).
Рис. 2.3
Морфология клеток и колонии В. Bifidum 1, выращенных в среде Блаурокка
Оптимальная температура роста В. Bifidum l 38±1°С, фаза максимального накопления микробных клеток заканчивается к 44-48 ч. При посеве культуры, предварительно выращенной на печеночной среде Блаурокка или КД-5, в обезжиренное молоко в объеме 5-10% при инкубации в течение 72-96 ч штамм В. bifidum l вызывает только закисление молока (до 40-50°Т) без свертывания.
Бифидобактерии выпускают в виде бакконцентратов (например, бифидумбактерин) и включают в кисломолочные продукты. Проблема заключается в том, что бифидобактерии плохо развиваются в молоке. Для стимулирования роста их вносят вместе с другими молочнокислыми микроорганизмами (бифидок, ацидобифидин), используют специальные штаммы, приспособленные к росту в молоке, или добавляют бифидогенные факторы роста (экстракты дрожжей, картофеля, сои, гидролизаты казеина, некоторые минеральные соли).
Источник
