85 Диагностикумы. Получение, применение.
диагностических целях при обнаружении антител в сыворотке крови больных, реконвалесцентов и бактерионосителей используются серологические реакции.
Для постановки таких реакций применяются диагностикумы — препараты, содержащие взвесь обезвреженных микроор-ганизмов или определенные антигены.
Необходимость использования диагностикумов для серологических реакций связана не только с явным их преимуществом перед живыми культурами микробов (безопасность в работе), но еще и потому, что для приготовления диагностикумов подбираются штаммы микроорганизмов с высокой чувствительностью к антителам и способностью длительно сохранять антигенные свойства.
Для инактивации микроорганизмов при приготовлении диагностикумов чаще всего используются химические вещества, особенно формалин, являющийся лучшим консервантом. Убитые нагреванием микробы хуже сохраняют антигенные свойства и применяются редко.
серологических реакциях (реакции агглютинации, реакции пассивной гемагглютинации, реакции связывания комплемента, реакции торможения гемагглютинации) для выявления специфических антител применяются: бактериальные, эритроцитарные и вирусные диагностикумы.
Бактериальные диагностикумы могут содержать инактивированную микробную взвесь или отдельные антигенные компоненты бактерий: О, Н или Vi-антигены и используются в реакциях агглютинации.
Эритроцитарные диагностикумы представляют собой эритроциты (обработанные танином или формалином) с ад-сорбированными на них антигенами, извлеченными из бактерий, и применяются в РПГА (реакции пассивной гемагглютинации). В том случае, когда РПГА используется для выявления антигена в выделениях больных, в тканях и др., при-меняют «антительные диагностикумы», т. е. эритроциты, сенсибилизированные антителами.
Вирусные диагностикумы — препараты, содержащие инактированные вируссодержащие жидкости (культуральные, из куриных эмбрионов или организма животных, зараженных соответствующим вирусом), применяются в РСК (реакции связывания комплемента), реакции торможения гемагглютинации (РТГА) и реакции нейтрализации.
настоящее время в лабораториях используются следующие диагноста кумы.
Бактериальный диагностикум сальмонелл тифа. Применяется в реакции агглютинации для обнаружения антител в сыворотке больных.
Сальмонеллезные О-диагностикумы содержат О-антигены различных групп сальмонелл (инактивированных 15%-ным раствором глицерина). Применяются для выявления О-аптител при сальмонеллезных инфекциях в реакции агглютинации с сывороткой больных.
Сальмонеллезные Н-монодиагностикумы. Используются в реакции агглютинации для определения заболевания в прошлом
(анамнестическая реакция агглютинации) и реже с диагностической целью.
Vi — брюшнотифозный диагностикум. Применяется в реакции агглютинации при выявлении брюшнотифозного бактерионосительства.
Единый бруцеллезный диагностикум — взвесь бруцелл (инактивированных фенолом), подкрашенная метиленовым синим. Применяется для определения антител в сыворотках крови больных бруцеллезом людей и животных в реакциях агглютинации Райта и Хеддльсона.
Эритроцитарный сальмонеллезный О-диагностикум — взвесь эритроцитов с адсорбированными на них О-антигенами различных групп сальмонелл. Используется для постановки РПГА с сывороткой больного при уточнении клинического диагноза сальмонеллеэной инфекции.
Эритроцитарный Vi-диагностикум — эритроциты, сенсибилизированные очищенным Vi-антигеиом S. typhi, применяется в РПГА при выявлении брюшнотифозного бактерионосительства.
Гриппозный диагностикум представляет собой аллантоисную жидкость инфицированных вирусом гриппа (типов А, В) куриных эмбрионов и инактивированную мертиолатом или формалином. Диагностикумы необходимы при постановке РТГА с парными сыворотками больных для уточнения клинического диагноза и циркулирующего типа вируса гриппа.
Диагностикум вируса клещевого энцефалита получают из суспензии мозга белых мышей, зараженных вирусом клещевого энцефалита. Суспензию подвергают центрифугированию (для осветлення) и инактивируют химическими веществами. Диагностикум используется в РТГА и РСК с сывороткой больных при диагностике заболевания.
№ 86 Моноклональные антитела. Получение, применение.
Моноклональные антитела. Каждый В-лимфоцит и его потомки, образовавшиеся в результате пролиферации (т.е. клон), способны синтезировать антитела с паратопом строго определенной специфичности. Такие антитела получили название моноклональных. В природных условиях макроорганизма получить моноклональные антитела практически невозможно. Дело в том, что на одну и ту же антигенную детерминанту одновременно реагируют до 100 различных клонов В-лимфоцитов, незначи-тельно различающихся антигенной специфичностью рецепторов и, естественно, аффинностью. Поэтому в результате иммунизации даже монодетерминантным антигеном мы всегда получаем политональные антитела.
Принципиально получение моноклональных антител выполнимо, если провести предварительную селекцию антителопродуцирующих клеток и их клонирование (т.е. выделение отдельных клонов в чистые культуры). Однако задача осложняется тем, что В-лимфоциты, как и другие эукариотические клетки, имеют ограниченную продолжительность жизни и число возможных митотических делений.
Проблема получения моноклональных антител была успешно решена Д. Келлером и Ц. Милыптейном. Авторы получили гибридные клетки путем слияния иммунных В-лимфоцитов с миеломной (опухолевой) клеткой. Полученные гибриды обладали специфическими свойствами антителопро-дуцента и «бессмертием» раковотрансформированной клетки. Такой вид клеток получил название гибридом. Гибридома хорошо размножается в искусственных питательных средах и в организме животных и в неограниченном количестве вырабатывает антитела. В результате дальнейшей селекции были отобраны отдельные клоны гибридных клеток, обладавшие наивысшей продуктивностью и наибольшей аффинностью специфических антител. Гибридомы, продуцирующие моноклональые антитела, размножают или в аппаратах, приспособленных для выращивания культур клеток или же вводя их внутрибрюшинно особой линии (асцитным) мышам. В последнем случае моноклональные антитела накапливаются в асцитной жидкости, в которой размножаются губридомы. Полученные как тем, так и другим способом моноклональные антитела подвергают очистке, стандартизации и используют для создания на их основе диагностических препаратов.
Гибридомные моноклональные антитела нашли широкое применение при создании диагностических и лечебных иммунобиологических препаратов.
Источник
62. Диагностикумы. Получение, применение.
В диагностических целях при обнаружении антител в сыворотке крови больных, реконвалесцентов и бактерионосителей используются серологические реакции.
Для постановки таких реакций применяются диагностикумы — препараты, содержащие взвесь обезвреженных микроорганизмов или определенные антигены.
Необходимость использования диагностикумов для серологических реакций связана не только с явным их преимуществом перед живыми культурами микробов (безопасность в работе), но еще и потому, что для приготовления диагностикумов подбираются штаммы микроорганизмов с высокой чувствительностью к антителам и способностью длительно сохранять антигенные свойства.
Для инактивации микроорганизмов при приготовлении диагностикумов чаще всего используются химические вещества, особенно формалин, являющийся лучшим консервантом. Убитые нагреванием микробы хуже сохраняют антигенные свойства и применяются редко.
В серологических реакциях (реакции агглютинации, реакции пассивной гемагглютинации, реакции связывания комплемента, реакции торможения гемагглютинации) для выявления специфических антител применяются: бактериальные, эритроцитарные и вирусные диагностикумы.
Бактериальные диагностикумы могут содержать инактивированную микробную взвесь или отдельные антигенные компоненты бактерий: О, Н или Vi-антигены и используются в реакциях агглютинации.
Эритроцитарные диагностикумы представляют собой эритроциты (обработанные танином или формалином) с адсорбированными на них антигенами, извлеченными из бактерий, и применяются в РПГА (реакции пассивной гемагглютинации). В том случае, когда РПГА используется для выявления антигена в выделениях больных, в тканях и др., применяют «антительные диагностикумы», т. е. эритроциты, сенсибилизированные антителами.
Вирусные диагностикумы — препараты, содержащие инактированные вируссодержащие жидкости (культуральные, из куриных эмбрионов или организма животных, зараженных соответствующим вирусом), применяются в РСК (реакции связывания комплемента), реакции торможения гемагглютинации (РТГА) и реакции нейтрализации.
В настоящее время в лабораториях используются следующие диагностикумы.
1. Бактериальный диагностикум сальмонелл тифа. Применяется в реакции агглютинации для обнаружения антител в сыворотке больных.
2. Сальмонеллезные О-диагностикумы содержат О-антигены различных групп сальмонелл (инактивированных 15%-ным раствором глицерина). Применяются для выявления О-антител при сальмонеллезных инфекциях в реакции агглютинации с сывороткой больных.
3. Сальмонеллезные Н-монодиагностикумы. Используются в реакции агглютинации для определения заболевания в прошлом (анамнестическая реакция агглютинации) и реже с диагностической целью.
4. Vi — брюшнотифозный диагностикум. Применяется в реакции агглютинации при выявлении брюшнотифозного бактерионосительства.
5. Единый бруцеллезный диагностикум — взвесь бруцелл (инактивированных фенолом), подкрашенная метиленовым синим. Применяется для определения антител в сыворотках крови больных бруцеллезом людей и животных в реакциях агглютинации Райта и Хеддльсона.
6. Эритроцитарный сальмонеллезный О-диагностикум — взвесь эритроцитов с адсорбированными на них О-антигенами различных групп сальмонелл. Используется для постановки РПГА с сывороткой больного при уточнении клинического диагноза сальмонеллезной инфекции.
7. Эритроцитарный Vi-диагностикум — эритроциты, сенсибилизированные очищенным Vi-антигеном S. typhi, применяется в РПГА при выявлении брюшнотифозного бактерионосительства.
8. Гриппозный диагностикум представляет собой аллантоисную жидкость инфицированных вирусом гриппа (типов А, В) куриных эмбрионов и инактивированную мертиолатом или формалином. Диагностикумы необходимы при постановке РТГА с парными сыворотками больных для уточнения клинического диагноза и циркулирующего типа вируса гриппа.
9. Диагностикум вируса клещевого энцефалита получают из суспензии мозга белых мышей, зараженных вирусом клещевого энцефалита. Суспензию подвергают центрифугированию (для осветления) и инактивируют химическими веществами.
Диагностикум используется в РТГА и РСК с сывороткой больных при диагностике заболевания.
Источник
XI Международная студенческая научная конференция Студенческий научный форум — 2019
Приготовление бактериальных антигенов – диагностикумов (литературный обзор)
Исследования сывороток больных животных на наличие в них антител, а также определение титров антител в специфических сыворотках при их промышленном изготовлении осуществляются с помощью антигенов-диагностикумов. По происхождению такие антигены подразделяются на бактериальные, риккетсиальные, вирусные [5].
При изготовлении бактериальных антигенов используют или живые культуры или гомогенные стандартизированные взвеси убитых микробов. Антигены из живых культур применяются редко, так рак это связано с определенными технологическими трудностями, также возможностью заражения лабораторного персонала. Диагностикумы из убитых культур являются предпочтительными [2].
Приготовление диагностикумов связано прежде всего с тщательной подготовкой и селекцией штаммов микроорганизмов, из которых они готовятся. Производственные штаммы должны находиться в S-форме. Это обеспечивает им хорошую агглютинабильность, специфичность и образование устойчивой гомогенной взвеси. Чаще всего для получения диагностикумов определенные штаммы микроорганизмов выращивают на агаровых средах. Культуры микробов смывают с поверхностиа агара, а затем их инактивируют 0,5%-м раствором формалина (бруцеллезный, туляремийный антиген), 1%-ми растворами борной кислоты (листериозный, сальмонеллезные, коли-антигены), нагреванием (бруцеллезный антиген) и другими методами [4].
Бактериальная клетка содержит в себе комплекс различных антигенов, как полноценных, так и гаптенов (неполноценных).
У микробов различают видовые, типовые, групповые (видо-, типо-, группоспецифические) антигены, специфичность которых определяется химическими группами молекул клеток [3].
Различают капсульные, жгутиковые и соматические антигены. Каспсульные антигены содержатся в капсуле капсулообразующих микробов и отличаются от антигенов клетки.
Капсульные антигены являются полисахаридами, так капсула сибиреязвенного микроба содержит протеиноподобное вещество — полипептид. Жгутиковые антигены (Н-антигены) содержатся в жгутиках подвижных бактерий, термолабильны, легко разрушаются при температуре 60-80˚С; являются белками [3].
Соматические антигены (О-антигены) содержатся в протоплазме бактерий, термостабильны — выдерживают нагревание при температуре 100˚С 1-2 ч, представляют собой полисахаридно-полипептидный комплекс.
Каждый антиген вызывает образование особых антител. Например, Н-антигены не участвуют в формировании иммунитета, а О-антигены обладают хорошо выраженной иммуногенной способностью.
Приготовление диагностикумовсвязано прежде всего с тщательной подготовкой и селекцией штаммов микроорганизмов, из которых они готовятся. Производственные штаммы должны находиться в S-форме. Это обеспечивает им хорошую агглютинабильность, специфичность и образование устойчивой гомогенной взвеси [2,3].
Для получения диагностикумов определенные штаммы микроорганизмов выращивают на агаровых средах. Культуры микробов смывают с поверхности агара; а затем их инактивируют 0, 5%-м раствором формалина (бруцеллезный, туляремийный антиген), 1%-ми растворами борной кислоты (листериозный, сальмонеллезные, коли-антигены), нагреванием (бруцеллезный антиген) и другими методами. О-диагностикумы готовят обычно из неподвижных вариантов культур, полученных при выращивании на плотных питательных средах и обработанных спиртом или глицерином. Наиболее трудно приготовить Vi-антиген, так как он обладает малой устойчивостью к различным воздействиям, в том числе и к формалину. Готовится он из поверхностных компонентов микробных клеток, консервируется формалином, но перед формалнизацией его стабилизируют 25%-м раствором хлорида кальция [3,4].
Антигены бывают корпускулярными и растворимыми.
Корпускулярные антигены представляют собой взвесь убитых, реже живых микробов в физиологическом растворе с определенной концентрацией консерванта. Во всех случаях антигены подвергают высокой степени очистки. Такие антигены используются для постановки РА, РСК, РДСК.
Растворимые антигены готовят в виде экстрактов из агаровых культур соответствующих микробов. Они используются для постановки серологического диагноза с применением РСК при сапе, бруцеллезе, инфекционном эпидидимите баранов и других заболеваниях, а также при постановке реакции иммунодиффузии (РИД) на бруцеллез, лейкоз и многие другие инфекции [2,3,4].
При диагностике пуллороза — тифа птиц при постановке кровекапельной реакции агглютинации (ККРА) на стекле используют цветной антиген, представляющий собой гомогенную взвесь микробных клеток S. gallinarum, убитых формалином и окрашенных кристалл-виолетом.
Антиген готовится из пяти штаммов указанного микроба, вирулентных для птиц и находящихся в S-форме.
Из Mycoplasma gallisepticum готовится антиген для диагностики респираторного микоплазмоза птиц. Он представляет собой взвесь микробных клеток, обезвреженных фенолом и окрашенных 0,5%-м спиртовым раствором генцианвиолета.
При некоторых инфекционных заболеваниях (бруцеллез, пуллороз и другие) используются эритроцитарные диагностикумы.
Такие антигены представляют собой 5-10%-ю взвесь эритроцитов барана, сенсибилизированных полисахаридно-полипептидной фракцией соответствующих возбудителей болезни. Они предназначены для прижизненной диагностики указанных и некоторых вирусных инфекций с применением реакции непрямой гемагглютинации (РНГА).
Для получения полисахаридно-полипептидной фракции проводят гидролиз бактерийной массы сальмонелл уксусной кислотой и осаждение её этиловым спиртом [3,4].
Кровь для получения эритроцитов берут стерильно из яремной вены животного в сосуд со стерильным раствором Олсевера. Эритроциты несколько раз отмывают стерильным фосфатным буфером, центрифугируют, консервируют формалином и ресуспендируют в фосфатно-буферном растворе. Затем ихсенсибилизируютполисахаридно-полипептидной фракцией сальмонелл. Сенсибилизированные эритроциты разводят фосфатным буфером с формальдегидом до 10%-й концентрации, расфасовывают во флаконы и сдают на контроль. Эритроцитарный антиген контролируют на активность, специфичность, стерильность, концентрацию эритроцитов и pH[3,4].
Тутов И. К Ситьков В. И. Основы биотехнологии ветеринарных препаратов. — Ставрополь, 1997.
Источник
