43. Анатоксины. Получение, очистка, титрование и применение.
В процессе культивирования природных патогенных микробов можно получить протективный антиген, синтезируемый этими бактериями токсин затем превращается в анатоксин, сохраняющий специфическую антигенность и иммуногенность. Анатоксины являются одним из видов молекулярных вакцин. Анатоксины – препараты, полученные из бактериальных экзотоксинов, полностью лишенные своих токсических свойств, но сохранившие антигенные и иммуногенные свойства. Получение: токсигенные бактерии выращивают на жидких средах, фильтруют с помощью бактериальных фильтров для удаления микробных тел, к фильтрату добавляют 0,4% формалина и выдерживают в термостате при 30-40t на 4 недели до полного исчезновения токсических свойств, проверяют на стерильность, токсигенность и иммуногенность. Эти препараты называются нативными анатоксинам, в настоящее время почти не используются, т. к. содержат большое количество балластных веществ, неблагоприятно влияющих на организм. Анатоксины подвергаю физической и химической очистке, адсорбируют на адъювантах. Такие препараты называются адсорбированными высокоочищенными концентрированными анатоксинами.
Титрование анатоксинов в реакции фолликуляции производят по стандартной фолликулирующей атитоксической сыворотке, в которой известно количество антитоксических единиц. 1 антигенная единица анатоксина обозначается Lf, это то количеств о анатоксина, которое вступает в реакцию фолликуляции с 1 единицей дифтерийного анатоксина.
Анатоксины применяются для профилактики и реже, для лечения токсинемических инфекций дифтерия, газовая гангрена, ботулизм, столбняк). Так же анатоксины применяются для получения антитоксических сывороток путем гипериммунизации животных.
Примеры препаратов: АКДС, АДС, адсорбированный стафилококковый анатоксин, ботулинистический анатоксин, анатоксины из экзотоксинов возбудителей газовых инфекций.
Тут вы можете оставить комментарий к выбранному абзацу или сообщить об ошибке.
Источник
Анатоксины. Получение, очистка, титрование, применение
В процессе культивирования природных патогенных микробов можно получить протективный антиген, синтезируемый этими бактериями токсин затем превращается в анатоксин, сохраняющий специфическую антигенность и иммуногенность. Анатоксины являются одним из видов молекулярных вакцин. Анатоксины – препараты, полученные из бактериальных экзотоксинов, полностью лишенные своих токсических свойств, но сохранившие антигенные и иммуногенные свойства. Получение: токсигенные бактерии выращивают на жидких средах, фильтруют с помощью бактериальных фильтров для удаления микробных тел, к фильтрату добавляют 0,4% формалина и выдерживают в термостате при 30-40t на 4 недели до полного исчезновения токсических свойств, проверяют на стерильность, токсигенность и иммуногенность. Эти препараты называются нативными анатоксинам, в настоящее время почти не используются, т. к. содержат большое количество балластных веществ, неблагоприятно влияющих на организм. Анатоксины подвергаю физической и химической очистке, адсорбируют на адъювантах. Такие препараты называются адсорбированными высокоочищенными концентрированными анатоксинами.
Титрование анатоксинов в реакции фолликуляции производят по стандартной фолликулирующей атитоксической сыворотке, в которой известно количество антитоксических единиц. 1 антигенная единица анатоксина обозначается Lf, это то количество анатоксина, которое вступает в реакцию фолликуляции с 1 единицей дифтерийного анатоксина.
Анатоксины применяются для профилактики и реже, для лечения токсинемических инфекций дифтерия, газовая гангрена, ботулизм, столбняк). Так же анатоксины применяются для получения антитоксических сывороток путем гипериммунизации животных.
Примеры препаратов: АКДС, АДС, адсорбированный стафилококковый анатоксин, ботулинистический анатоксин, анатоксины из экзотоксинов возбудителей газовых инфекций.
Возбудители малярии. Таксономия. Характеристика.
Источник
Анатоксины, их получение, титрование и практическое применение.
Анатоксины (anatoxinum от греч.— «an» — отрицание и toxo» — отравляю) представляют собой препараты, полученные из бактериальных экзотоксинов, полностью лишенные т ксических свойств, но сохранившие антигенные и иммуногенные свойства. Метод получения анатоксина предложил в 1923 году крупнейший французский ученый Рамон (G. Ramon).При приготовлении анатоксинов культуры бактерий — возбудителей токсинемических инфекций, продуцирующих экзотоксины, выращивают в жидких питательных средах (реакто-
рах большой емкости) для накопления токсина. Затем фильтруют через бактериальные фильтры для удаления микробных тел. К фильтрату добавляют 0,3—0,4 % —формалина и помещают в термостат при температуре 37°—40°С н а 3—4 недели до полного исчезновения токсических свойств. Полученный анатоксин проверяют на стерильность, безвредность и иммуногенность. Такие препараты получили название нативных анатоксинов, т. к. они содержат большое количество веществ питательной среды, которые являются балластными и могут
способствовать развитию нежелательных реакций организма при введении препарата. Нативные анатоксины необходимо вводить в больших дозах из-за их невысокой удельной активности. Поэтому в настоящее время применяются преимущественно очищенные анатоксины, для чего нативные анатоксины подвергают обработке различными физическими и химическими методами (ионнообменной хромотографии, кислотному осаждению и др.), чтобы освободить от всех балластных веществ и сконцентрировать препарат в меньшем объеме. Однако уменьшение размеров частиц анатоксина сделало необходимым адсорбировать препарат на адъютантах
Таким образом, применяющиеся анатоксины являются адсорбированными высокоочищенными концентрированными препаратам:’Специфическую активность или силу анатоксина определяют в реакции флоккуляции в так называемых единицах флоккуляции— (Lf) или по реакции связывания анатоксинов, выражающуюся в единицах связывания— (ЕС). Титрование анатоксинов в реакции флоккуляции (по методу Рамона) производят по стандартной флоккулирующей антитоксической сыворотке, в которой известно количество международных антитоксических единиц (ME, см. с. 23) в 1 мл. Одна антигенная единица анатоксина обозначается Limes flocculationis (Lf — порог флоккуляции), это то количество анатоксина, которое вступает в реакцию флоккуляции с одной единицей дифтерийного антитоксина. Определив дозу анатоксина, давшую инициальную (первичную) реакцию флоккуляции с одной антитоксической единицей сыворотки, рассчитывают количество Lf препарата в 1 мл. Антигенные свойства столбнячного анатоксина (и некоторых других) обозначают в единицах связывания (ЕС). Для определения ЕС необходимы:испытуемый препарат анатоксина, стандартная антитоксическая сыворотка (с содержанием 0,1 ME в 1 мл), опытная доза токсина (вытитрованная к 0,1 ME стандартной сыворотки), белые мыши.Реакцию связывания проводят следующим образом: в ряд пробирок с одинаковым объемом стандартной сыворотки добавляют различные разведения испытуемого анатоксина.Смесь для связывания выдерживают в термостате 45 минут,затем в каждую пробирку добавляют опытную дозу токсина и вновь оставляют в термостате на 45 минут. После этого из каждой пробирки вводят смесь (сыворотки — анатоксина —токсина) 2—4 мышам и наблюдают за состоянием животных в течение 4 суток. Если весь анатоксин, добавленный к сыворотке, связался ею, то добавление токсина и последующее
заражение мышей ведет к их гибели. При недостаточной дозе анатоксина для связывания всей сыворотки, добавленный токсин нейтрализуется сывороткой, и мыши остаются живыми. Для расчета ЕС в 1 мл определяемого анатоксина берется то разведение анатоксина, при котором происходит гибель 50% белых мышей на 4-е сутки. Это количество анатоксина содержит дозу, связывающую 0,1 ME сыворотки. Анатоксины применяются для профилактики и реже для лечения токсинемических инфекций (дифтерия, газовая ган-
грена, ботулизм, столбняк) и некоторых заболеваний, вызванных стафилококками.
94. Антимикробные сыворотки (иммуноглобулины). Получение, применение.
Антибактериальные сыворотки получают гипериммуннзацией лошадей соответствующими убитыми бактериями или антигенами и содержат антитела с агглютинирующими, литическими и опсонизирующими свойствами. Они не нашли широкого применения в силу их малой эффективности. Антибактериальные сыворотки относятся к нетитруемым препаратам, так как общепринятой единицы измерения их лечебной силы нe существует. Поэтому антибактериальные лечебные сыворотки дозируются в объемных единицах, непосредственно у постели больного, исходя из степени тяжести заболевания.для очистки и концентрации антибактериальных сывороток и некоторых антивирусных используют метод, основанный
на разделении белковых фракций нативных сывороток и выделении активных иммуноглобулинов этиловым спиртом при низкой температуре (метод водно-спиртового осаждения на холоду).Иммуноглобулины(гомологичные), получаемые из крови человека, готовят двух видов — противокоревой (или нормальный) и иммуноглобулины направленного действия. Преимущество этих иммуноглобулинов перед гетерогенными в том, что они практически нереактогенны и циркулируют в организме болеее продолжительное время, в течение 30—40 дней.Извлекают иммуноглобулины из сыворотки крови человека путем фракционирования (по методу Кона) этиловым спиртом при температуре ниже нуля.Противокоревой (или нормальный) иммуноглобулин получают из донорской, плацентарной или абортной крови. Содержит антитела против вируса кори, а также против вирусов гриппа, гепатита, полиомиелита, возбудителей коклюша и не-
которых других вирусных и бактериальных инфекций. Препарат применяют для профилактики кори, инфекционного гепатита, коклюша, полиомиелита, менингококковой инфекции и др.для профилактики кори иммуноглобулины вводят всем детям старше 3 месяцев, бывших в контакте с больным и не привитым коревой вакциной. Иммуноглобулины вводят с профилактической целью всем детям до 6 лет, контактировавшим с больным коклюшем и не привитым против этой инфекции. Профилактика гепатита А иммуноглобулином проводятся
в предэпидемичсский период и в эпидемических очагах. Препарат в некоторых случаях оказывает защитное действие или чаще смягчает клиническое течение болезни. Очень важно правильное соблюдение дозировки иммуноглобулина (0,02 мл на 1 кг веса). Продолжительность профилактического действия препарата 3—6 месяцев. Иммуноглобулины направленного действия готовят из сыворотки крови людей-добровольцев, подвергшихся специальной иммунизации против определенной инфекции. Такие препараты содержат повышенные концентрации специфических антител и используются для лечебных целей. В настоящее время получают иммуноглобулины направленного действия против гриппа, бешенства, оспы, клещевого энцефалита, столбняка и стафилококковых инфекций.
95. Антитоксические сыворотки. Получение, очистка, титрование, применение.
Антитоксические сыворотки получают иммунизацией лошадей возрастающими дозами анатоксинов, а затем и соответствующими токсинами. Сыворотки подвергают очистке и концентрации методом «Диаферм-3»,контролю на безвредность, апирогенность, затем титруют т. е. определяют содержание антитоксинов в 1 мл препарата. Специфическая активность сывороток или количество антител измеряется с помощью специальных методов, основанных на способности сывороток in vitro и in vivo нейтрализовать соответствующие токсины и
выражается в международных антитоксических единицах (ME), принятых ВОЗ. За 1 ME принимается
то минимальное количество сыворотки, которое способно нейтрализовать определенную дозу токсина, выражающуюся в стандартных единицах, обозначаемых как смертельные, некротические или реактивные дозы в зависимости от вида токсина и способа титрования.Титрование антитоксических сывороток может проводиться тремя методами — методами Эрлиха, Рёмера, Района.Титрование сывороток по методу Района
осуществляется с помощью реакции флоккуляции по известному анатоксину или токсину, одну Lf (Limes flocculationis —порог флоккуляции) которых нейтрализует одна единица дифтерийного антитоксина. Первичная или инициальная реакция флоккуляции наступает при соответствии количества антигенных единиц анатоксина количеству антитоксинов в исследуемой сыворотке. Исходя из результатов первичной реакции флоккуляции и ведется расчет антитоксических единиц в 1 мл испытуемой сыворотки. Однако метод Рамона является
только ориентировочным. Метод Эрлиха. Перед титрованием сывороток по методу Эрлиха проводят определение условной смертельной (опытной) дозы токсина Lt (Limes tod). Lt определяется с помощью стандартной антитоксической сыворотки, к определенному количеству которой добавляют различные объемы
токсина и после выдерживания смеси при комнатной температуре (в течение 45 минут) вводят белым .мышам или морским свинкам. Затем наблюдают за животными четверо суток. За опытную дозу токсина (Lt) принимается то количество токсина, которое в смеси с 1 ME стандартной сыворотки вызывает гибель 50% взятых в опыт животных. На втором этапе титрования к различным разведениям испытуемой сыворотки добавляют опытную дозу токсина, смесь также выдерживают и вводят животным. По получаемым результатам производят расчет титра испытуемой антитоксической сыворотки. Метод Рёмера. Титрование антитоксических сывороток
по методу Рёмера проводится также в два этапа, но является более экономичным, т. к. опыт проводится на одном животном. Предварительно определяется опытная некротическая доза токсина — Ln (limes necrosis) введением внутрикожно морской свинке различного количества токсина со стандартной сывороткой. За некротическую дозу токсина принимается то его наименьшее количество, которое при внутрикожном
введении морской свинке в смеси с 1/50 ME стандартной противодифтериГ’ной сыворотки вызывает на месте введения некроз на 4—5-й день. Затем различные объемы испытуемой сыворотки в смеси с оттитрованной некротической дозой токсина вводятся внутрикожно морской свинке и по результатам проводится расчет титра сыворотки. По методу Рёмера титруется противодифтерийная сыворотка.
Источник
Научная электронная библиотека
Перетрухина А. Т., Блинова Е. И.,
Глава 5. ТОКСИНЫ И АНАТОКСИНЫ
Токсины (от греческого toxikоn — яд), вещества бактериального происхождения, способные угнетать физиологические функции, что приводит к заболеванию или гибели животных и человека. По химической природе все токсины — белки или полипептиды. В отличие от других органических и неорганических ядовитых веществ, токсины при попадании в организм вызывают образование антител.
При некоторых инфекционных заболеваниях (дифтерия, скарлатина) для определения напряженности иммунитета и восприимчивости детей используются внутрикожные пробы с применением соответствующих разведенных токсинов. Положительная реакция (местное воспаление кожи в области введения токсина) обусловливается ядовитым действием токсина на ткани кожи. Отрицательный результат реакции объясняется нейтрализацией введенного в кожу токсина соответствующим антитоксином, содержащимся в иммунном организме в достаточном для этого количестве.
Токсины получают из токсигенных штаммов микробов (дифтерийная палочка или скарлатинозный стрептококк) методом посева на жидкую питательную среду (мартеновский бульон) с последующей фильтрацией через бактериальные фильтры. Из полученных токсинов готовят диагностические токсины Шика (дифтерийный) и Дика (скарлатинный). Токсины вводят внутрикожно, в количестве 0,2 мл (Шика) и 0,1 мл (Дика), в среднюю часть внутренней поверхности предплечья.
Анатоксины — фильтраты бульонных культур токсигенных микроорганизмов, утратившие благодаря специальной обработке токсичность, но сохранившие в значительной степени антигенные и иммуногенные свойства исходных токсинов.
При введении в организм человека или животных анатоксины вызывают образование антитоксического иммунитета, это свойство и позволяет применять их для профилактики тех инфекционных заболеваний, в основе которых лежит действие экзотоксинов, выделяемых возбудителями, а также для гипериммунизации животных — продуцентов антитоксических сывороток.
Независимо от вида анатоксина его иммуногенность и антигенность определяются соответствующими свойствами исходного токсина. Поэтому в лабораториях, изготавливающих эти препараты, уделяется большое внимание созданию оптимальных условий для токсинообразования.
Для получения токсинов высокой силы необходимы штаммы, отличающиеся особенно выраженной способностью к токсинообразованию в искусственных условиях. Этими свойствами обладают далеко не все штаммы токсигенных бактерия. Для производственных целей пользуются штаммами, адаптированными к искусственным средам и стойко сохраняющими способность к токсинообразованию.
Культуры токсинообразователей сохраняются либо в высушенном состоянии, либо на средах оптимальных для данного вида бактерий. Перед употреблением для засева массовых партий штаммы пассируются на среде, используемой для получения токсина.
При прочих равных условиях сила токсинов определяется качеством питательной среды, поэтому лаборатории уделяют внимание приготовлению питательных сред. Сырье, химикалии и другие ингредиенты, входящие в состав среды, подвергаются самому тщательному контролю в биохимических лабораториях производственных институтов.
Для токсинообразования применяются жидкие питательные среды, в состав которых входят мясная вода и продукты пептического (бульон Мартена, среда Рамона) или триптического (среда Попе) переваривания мяса.
Процесс гидролиза мяса контролируется определением общего и аминного азота и коэффициента расщепления белка, который вычисляется из отношения аминного азота к общему. Используются также безмясные казеиновые, полусинтетические среды.
В питательную среду, предназначенную для токсинообразования, добавляются углеводы (глюкоза, мальтоза или смесь их). При сбраживании углеводов освобождается большое количество энергии, необходимой для процессов синтеза, происходящих в развивающейся культуре. Добавление углеводов резко повышает силу образующихся в среде токсинов.
Помимо углеводов для токсинообразования необходимы в минимальных дозах некоторые металлы. Токсинообразование дифтерийной палочки тормозится избытком железа в среде в равной мере как и отсутствием его. При наличии в среде оптимальных количеств железа токсинообразование резко усиливается.
Токсинообразование осуществляется в полную меру при определенном рН среды. Между тем в процессе роста культуры значение рН изменяется и может достигнуть таких показателей, которые будут тормозить образование токсина.
Для устранения этого в среды добавляются буферные вещества, поддерживающие нужное значение рН. Одним из таких веществ, обладающих свойствами буфера, является уксусно-кислый натр, который добавляется в бульон в количестве 0,5-0,75 %.
В зависимости от биологических особенностей микроба-токсинообразователя применяются разные условия выращивания и, в частности, регулируется аэрация среды. Дифтерийная палочка образует токсин в условиях максимальной аэрации, наоборот, столбнячная палочка и другие токсигенные анаэробы в кислороде не нуждаются. В соответствии с этим в первом случае культура выращивается в тонком слое среды с большой поверхностью соприкосновения с воздухом, во втором — среда наливается высоким слоем и в нее добавляются различные адсорбенты кислорода (вата, сухие эритроциты).
Температура выращивания и длительность его варьируют для разных микробов. Общей для процесса токсинообразования является необходимость безукоризненной регулировки температуры в термостате. Колебания температуры отрицательно сказываются на силе токсина. Поэтому термостаты, в которых происходит токсинообразование, снабжаются точными терморегуляторами.
В каждом отдельном случае длительность выращивания культуры определяется интенсивностью токсинообразования на данной серии среды. Для решения вопроса о времени прекращения культивирования производят определение силы токсина и рН среды в разные сроки выращивания.
Когда сила токсина достигает максимума, производят отделение его от микробных тел, это производится путем фильтрации через специальные бактериальные фильтры (анаэробные микроорганизмы) или обычные бумажные (дифтерийная палочка).
Перевод токсических фильтратов в анатоксин осуществляется путем длительного воздействия на них формалина при температуре 39-40 °С. Формалин соединяется свободными аминогруппами аминокислот, полипептидов и белков токсина, в связи с чем, утрачивает свои ядовитые свойства. Переход токсина в анатоксин происходит в течение 3-4 недель. Для правильного анатоксинообразования имеет значение рН токсина. Наиболее благоприятной является нейтральная или слабощелочная реакция среды.
Анатоксины характеризуются полной безвредностью для животных. Однако при неполном обезвреживании в них могут сохраняться остатки токсина, которые вызывают в чувствительном организме поздние повреждения. Поэтому при проверке безвредности анатоксинов наблюдение за животными ведут в течение длительного времени. Безвредность анатоксинов необратима. Никакие воздействия не приводят к восстановлению утраченной токсичности.
Анатоксины сохраняют почти в полной мере антигенные свойства токсинов. Это может быть проверено различными методами в пробирке (реакция флокуляции, реакция связывания анатоксина) и в опытах на животных, у которых введение анатоксина вызывает образование соответствующих антитоксинов и создание антитоксического иммунитета.
Анатоксины отличаются стойкостью; они переносят повторное замораживание и оттаивание, противостоят действию высокой температуры и стабильны при длительном хранении.
Анатоксины содержат помимо специфических белков также балластные вещества, от которых они могут быть освобождены разными методами. Они основаны на способности анатоксинов осаждаться при насыщении нейтральными солями, солями тяжелых металлов, кислотами (соляной, трихлоруксусной, метафосфорной), а также в присутствии этилового и метилового спирта при низкой температуре. Эти методы используются в настоящее время для получения очищенных концентрированных анатоксинов.
Анатоксины адсорбируются на различных нерастворимых веществах (фосфорные соли, гидроокись алюминия), это используется для приготовления сорбированных анатоксинов, которые отличаются замедленной всасываемостью в организме, в результате чего можно получить более напряженный иммунитет.
Благодаря своей безвредности, высокой антигенности и иммуногенности, анатоксины являются ценнейшими средствами профилактики и терапии ряда заболеваний.
В настоящее время получены анатоксины: дифтерийный, столбнячный, ботулинический, стафилококковый, дизентерийный, из токсинов, продуцируемых возбудителями газовой гангрены, а также из змеиного яда.
Источник
